张明文[1]2003年在《建立银杏遗传转化受体系统的研究》文中提出银杏(Ginkgo biloba)又名白果、公孙树，是我国特有的珍贵孑遗树种，也是目前世界上珍稀裸子植物之一，现仅存一科一属一种，素有裸子植物“活化石”之称，在植物学上具有重要的科学价值。 1980年以来，银杏在食品、保健、医药、木材，绿化等领域得到广泛的开发利用，对银杏的繁殖和育种提出了新的要求。但是，银杏是雌雄异株植物，实生苗定植后一般需要20～30年才能开花结果，银杏常规育种时间长，效率低，严重制约了早期经济效益的提高和生产的发展。另外，杂交育种和实生选种时，童期长、开花结果晚更是木本果树品种改良的主要限制因素。 开展银杏组织培养和遗传转化，研究银杏成花的分子机理，进行银杏分子育种有重要的理论和现实意义。随着现代生物技术的发展，植物组织培养作为一种重要的研究手段取得了可喜的进步，裸子植物银杏组织培养尤其困难。但目前银杏组织培养和遗传转化的研究并不多，成功的例子还没有。建立一个银杏的高频高效再生体系已是刻不容缓的事。 1．银杏组织培养过程中，尤其是在愈伤组织的继代培养中，褐变现象特别严重，曾有不少的人做过这方面的研究，但都没有成功，而本研究通过对不同糖类物质、抗氧化剂、吸附剂以及不同的培养基对褐变的影响和控制效果，探索出有效控制褐化现象发生的最佳培养条件，试验结果表明：MS+ZT1.0mg/L+NAA1.0mg/L+蔗糖50g/L+琼脂8g/L+AC2g/L培养基上的继代效果最好，继代时间最好在15d左右。 2．银杏的不同器官和组织都能够诱导出愈伤组织来，其中，子叶和胚轴10d左右全部愈伤化，诱导速度和诱导率均最高，根则很难诱导，愈伤组织很少，褐化很快；叶片诱导的愈伤组织，生长慢，褐化也慢，在培养基上保持两叁个月而不褐化；胚乳的诱导时间也较长，需要30d左右。诱导的难易分别为：根段、叶片、胚乳、胚根、叶柄、茎段、胚轴、子叶。 3．银杏不同外植体对丛生芽的诱导不同，银杏茎段培养可以直接得到丛生芽，但数量极少，而且大部分属于腋芽萌发，分化率20％左右。也可以利用银杏优良无性系的不同器官为外植体，离体培养产生愈伤组织，经分化获得丛生芽。但是不同器官诱导的愈伤组织对于丛生芽的诱导也是不同的，子叶诱导的愈伤组织的分化率较高，有36％左右，并且继代次数的增加也能够增加分化的几率．而茎段和胚诱导的愈伤组织基本上没有丛生芽发生，这可能和不同愈伤组织的内部结构有关。成熟胚的胚状体诱导率较低，诱导相当困难，在N6＋BAI．smg／L＋NAAO．sing／L＋蔗糖 30g／L＋琼脂 sg／L＋AcZg／L上诱导效果相对较好，可以有＊．5％的诱导率。 4＊的含量对茎段诱导根的发生有着很大的影响，含量高不利于根的诱导，IBA和 KT的配合使用利于根的诱导。实验结果表明，在培养基 1／ZMS＋蔗糖309几＋琼脂 sg／L＋IBAO．sing／L＋KTO．sing／L＋AcZg／L上诱导效果相对较好．
张雯[2]2008年在《银杏萜内酯代谢途径中关键酶基因的遗传转化研究》文中提出银杏萜内酯,包括银杏内酯和白果内酯,是在银杏提取物中起着主要作用的有效药用成分,其独特的生理作用和治疗价值在世界医疗行业引起了极大兴趣。然而,银杏萜内酯在银杏中含量较低,且银杏的细胞培养系很少产银杏萜内酯。由于不断扩大的银杏制品的市场需求和有限的银杏树资源,用基因工程技术修饰银杏萜内酯生物合成途径已成为提高银杏萜内酯含量最具潜力的方法之一。法尼基焦磷酸合成酶(FPS)是异戊烯基转移酶中的一种,它催化一分子的二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)和两分子的异戊烯基焦磷酸(IPP)缩合生成法尼基焦磷酸(FPP)。FPP是植物体内甾体、皂苷、倍半萜、橡胶等许多萜类衍生物质的合成前体。在银杏中,FPP为合成白果内酯合成提供前体,同时也为香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)的生成提供直接前体,而GGPP是包括银杏内酯在内的所有二萜类化合物的共同前体。1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-焦磷酸还原酶(HDR)是MEP途径末端的酶,以5:1的比例同时把1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-焦磷酸(HMBPP)转化成IPP和DMAPP的混合物,为银杏萜内酯的生物合成提供了异戊烯前体。FPS和HDR都是银杏内酯合成途径中的关键酶。因此,fps基因和hdr基因也成为了研究银杏内酯代谢工程的两个潜在靶点。为了研究FPS和HDR对银杏愈伤中银杏内酯含量的影响,我们基于pCAMBIA1304载体构建了两个单基因表达载体,分别是载体p1304+Gbfps和载体p1304+Gbhdr。采用根癌农杆菌介导法,分别将Gbfps和Gbhdr转化银杏种子胚。通过潮霉素(10mg/L)筛选,分别获得了32个和8个抗性愈伤组织系,PCR检测表明其中分别有30个和7个为转基因愈伤组织系。采用HPLC-ELSD法分别对转Gbfps的22个愈伤组织和转Gbhdr的4个愈伤组织中的银杏总内酯含量进行了测定。结果显示,转Gbfps的愈伤组织系f-6中银杏总内酯含量相比非转基因系有大幅提高,达到非转基因系的4.4倍,转Gbhdr的愈伤组织系h-8中银杏总内酯含量达到非转基因系的2.5倍。
曾丽兰[3]2013年在《龙眼胚性愈伤组织SOD的表达分析及启动子功能鉴定》文中认为龙眼（Dimocarpus longan Lour.）是我国南方一种重要的热带亚热带果树。植物在生长发育过程中，为了消除逆境及自身生理代谢所带来的有害的自由基和活性氧，自身的保护酶系统将发挥其巨大作用。SOD是保护酶系统中第一个发挥作用的抗氧化酶，不同类型的SOD基因会随着植物生长过程以及外界环境或因子的变化而出现差异表达。在前人研究的基础上，本研究从16个龙眼品种诱导胚性愈伤组织（embryogenic callus，EC），进行龙眼EC在离体保存、非生物胁迫条件及多种激素处理下EC SOD在转录和蛋白（酶活性）水平的变化检测；采用转化烟草的方法，进行不同类型SOD不同缺失片段的启动子的SOD启动子功能鉴定研究，并进一步进行龙眼EC转化体系的优化研究，为进一步探讨龙眼EC SOD的功能与作用机制，并为今后利用转基因技术直接转化龙眼提供参考。主要研究结果如下：1龙眼胚性愈伤组织的诱导及其限制生长保存条件下的生长状况比较本研究首先对福建省的龙眼主要栽培品种及地方品种进行胚性愈伤组织的诱导，其中7个品种是采自泉州农科院的地方品种，包括‘泉龙160（柴螺系列）’、‘泉龙313（东壁系列）’、‘石硖’、‘泉龙138（乌龙岭系列）’、‘泉龙142’、‘东壁’和‘泉龙114（储良系列）’；另外9个品种是采自莆田果树所的栽培品种，包括‘03晚优’、‘松风本’、‘莆田-石硖’、‘油潭本’、‘龙优’、‘莆田-东壁’、‘云本’、‘青壳宝圆’和‘鸡蛋本’。结果显示，16个品种的龙眼EC均已诱导得到，随后比较限制生长条件下不同品种龙眼EC的生长情况，结果表明11个品种的龙眼EC生长状况相对比较良好并能延长其继代周期到50d，包括‘红核子’、‘龙优’、‘松风本’、‘油潭本’、‘青壳宝圆’、‘云本’、‘鸡蛋本’、‘泉龙313（东壁系列）’、‘泉龙142’、‘泉龙160（柴螺系列）’、‘泉龙114（储良系列）’。另外6个品种的龙眼EC生长状况相对较差并不能延长继代周期到50d，包括‘石峡’、‘东壁’、‘莆田-东壁’、‘莆田-石峡’、‘03晚优’、‘泉龙138（乌龙岭系列）’。2龙眼EC SOD在不同生理条件下的酶活性变化2.1限制生长保存和普通保存过程中的EC的SOD活性变化以红核子、云本、石峡EC为试材，它们在常规保存和限制保存培养基上的SOD活性变化检测结果显示，限制保存能有效延缓龙眼EC的衰老，能明显推迟了SOD活性峰值出现的时间，红核子和云本的SOD活性峰值可以由常规保存时的30d推迟至50d，而限制保存较不理想的石峡也由30d推迟至40d，结果还显示SOD活性峰值出现的时间又与龙眼本身的耐衰老能力有关。2.2不同非生物胁迫及激素处理下龙眼EC的SOD活性变化2.2.1龙眼EC在非生物胁迫中的SOD酶活性变化本研究检测了聚乙二醇（PEG）、甘露醇、蔗糖、NaCl、不同光质的非生物胁迫下龙眼EC的SOD酶活性变化，结果表明：与对照相比，随着PEG胁迫强度的增加，SOD活性在轻度(10%PEG)、中度(20%PEG)胁迫下上升，严重(30%PEG)胁迫下呈快速下降趋势；随着甘露醇浓度的提高，SOD活性不断升高，且一直维持在一个较高的水平上，直到浓度达到100g/L时才开始呈现缓慢下降的趋势；随着蔗糖浓度的升高，SOD活性不断升高，直到蔗糖浓度为70g/L时开始下降，70~90g/L之间的SOD活性下降缓慢。甘露醇和蔗糖处理比PEG处理的SOD活性高，下降的速度也较缓慢，说明适当高浓度的甘露醇和蔗糖，可以有效提高植物细胞活力，从而延缓细胞衰老，为龙眼EC离体保存以及提高龙眼的抗旱性等应用提供了重要科学依据。随着NaCl浓度的升高，低盐胁迫下SOD酶活性先上升后下降，而高盐胁迫下SOD酶活性则呈下降趋势，低盐胁迫下SOD酶通过迅速增加活力来保护细胞，在防止盐胁迫伤害中起到很重要的作用。不同光质分别处理24h、72h，发现随着时间的延长，龙眼EC的SOD活性逐渐上升，在同样的光强和处理时间下，白光下的SOD活性是最强的，红光次之，说明白光可以有效诱导SOD活性的提高，而蓝绿光下的SOD活性接近于对照。2.2.2龙眼EC在激素处理中的SOD酶活性变化乙烯利、IAA、赤霉素、茉莉酸甲酯处理的龙眼EC的SOD活性变化均呈先升后降趋势，乙烯利的峰值出现在30ppm，IAA出现在1.5mg/L时，赤霉素的峰值保持在6~12mg/L间，茉莉酸甲酯出现在100μmol/L时，而水杨酸是升-降-升趋势，分别在50μmol/L和100μmol/L时出现峰值，以上激素处理的峰值均显着高于对照，说明植物激素可能通过提高龙眼EC的SOD活性以增强抗逆性。3龙眼EC SOD在不同生理条件下表达的定量PCR分析3.1龙眼EC在离体保存过程中SOD表达的定量PCR分析以EF-1a、eIF-4a、DlFSD1a为内参基因，用SYBR GreenⅡ荧光染料法的荧光定量PCR法检测常规继代保存过程中龙眼EC的DlCSD1a、DlFSD1a、DlMSD基因的转录水平，结果显示，保存25d时DlCSD1a表达量上升最显着，DlMSD次之，DlFSD1a有小幅度下降；30d时DlCSD1a和DlMSD保持稳定，DlFSD1a大幅度上升；40d后3类基因表达量均下降，说明材料有所老化。说明保存20~30d，龙眼EC的生长主要由不同SOD基因间相互协调，此消彼长，相互调控，以维持龙眼EC SOD的动态平衡，DlCSD1a一直发挥着主要调控作用，DlMSD保持在较高的稳定水平，保存30d时DlFSD1a在抗衰老方面发挥重要作用。3.2龙眼EC在非生物胁迫及激素处理中SOD表达的定量PCR分析3.2.1龙眼EC在非生物胁迫中SOD表达的定量PCR分析以EF-1a、eIF-4a、DlFSD1a为内参基因，用SYBR GreenⅡ荧光染料法的荧光定量PCR法检测蔗糖、NaCl和不同光质的非生物胁迫处理下龙眼EC的DlCSD1a、DlFSD1a、DlMSD基因的转录水平，结果显示，在蔗糖处理下，DlCSD1a起最大作用，DlMSD次之，DlFSD1a保持稳定；不同光质分别处理24h、72h，3类基因的表达量大致为白光＞红光＞蓝光＞绿光，处理24h时DlCSD1a起主要作用，但随着光质处理时间的延长，其表达量大幅度降低，而DlFSD1a表达量得到提高，DlMSD一直无明显表达；在盐胁迫下，DlCSD1a的上调表达最显着，DlMSD次之，DlFSD1a基本保持不变。3.2.2龙眼EC在激素处理中SOD表达的定量PCR分析以EF-1a、eIF-4a、DlFSD1a为内参基因，用SYBR GreenⅡ荧光染料法的荧光定量PCR法检测水杨酸、乙烯利、IAA、赤霉素、茉莉酸甲酯激素处理下龙眼EC的DlCSD1a、DlFSD1a、DlMSD基因的转录水平，结果显示，DlCSD1a对水杨酸、IAA、赤霉素、茉莉酸甲酯均起到主要应答作用，表达峰值分别出现在水杨酸75μmol/L、IAA1.5mg/L、赤霉素12mg/L和茉莉酸甲酯50μmol/L时，DlFSD1a对乙烯、赤霉素无明显应答，而DlMSD基因对乙烯有显着应答，峰值出现在乙烯30ppm。4龙眼EC不同SOD启动子的功能鉴定研究4.1农杆菌注射渗透法转化烟草叶片的体系优化对影响农杆菌注射转化烟草叶片法的多项因素进行了优化，结果表明，应选择移栽1个月左右的生长健壮、扎根较深且无枯叶、黄叶的烟草植株作为受体材料，以叶脉侧脉位置作为试验的侵染部位，农杆菌重悬菌液浓度OD600值为0.85，在20mmol/LMgCl2重悬液添加200μmol/L的乙酰丁香酮，注射3d后进行瞬时表达检测。对该体系进行优化后，将该方法应用于启动子的功能鉴定中我们发现其瞬时表达率明显提高，且数据稳定，重复性好。4.214个3’/5’端序列缺失片段SOD启动子转化烟草叶片及其瞬时表达分析GUS基因的瞬时表达结果显示，DlMSD启动子不同3’/5’端缺失片段中MSD-pro4的活性最强，是CaMV35S启动子的0.839倍，MSD-pro2最弱。DlFSD1a启动子不同3’/5’端缺失片段中FSD-pro4的活性最强，是CaMV35S启动子的0.887倍，FSD-pro2最弱。DlCSD1a启动子不同3’/5’端缺失片段中CSD-pro5的活性最强，是CaMV35S启动子的0.566倍，CSD-pro3最弱。综上，FSD-pro4是其中GUS活性最高的。4.3SOD启动子转化烟草叶片的GUS基因表达的定量PCR分析以18S rRNA为内参基因，用SYBR GreenⅡ荧光染料法的荧光定量PCR法检测不同类型SOD启动子不同缺失片段调控下烟草叶片GUS基因的相对表达量，结果显示DlMSD启动子不同3’/5’端缺失片段中MSD-pro4启动GUS基因的能力最强，MSD-pro3最弱；DlFSD1a启动子不同3’/5’端缺失片段中FSD-pro4最强，FSD-pro3启动子的能力最弱；DlCSD1a启动子不同3’/5’端缺失片段中CSD-pro5的活性最强，CSD-pro3最弱。与GUS瞬时表达检测结果一致的是FSD-pro4是其中启动GUS基因的能力最强的。5农杆菌介导转化龙眼体系的优化利用筛选出的启动GUS基因最强的FSD-pro4启动子，在前人已建立的农杆菌介导转化龙眼的基础上，采用GUS荧光活性检测法，进一步优化转化体系，以期能定量而准确地确定转化体系中多个因素，得到最优转化体系。以在2,4-D浓度0.3mg/L培养18d的龙眼EC作为受体材料，在添加了50μmol/L乙酰丁香酮的农杆菌侵染液中侵染25min，共培养5d，除菌时间为50min，后置于40mg/L潮霉素的培养基上进行抗性筛选。用微量提取法提取DNA，并对抗性EC进行PCR检测，结果表明GUS基因在龙眼抗性EC中获得了高表达，但是龙眼抗性EC生长较为缓慢，有待于将来进一步研究。
赵新亮, 王铁固, 欧行奇, 冯伟森, 王卫东[4]2009年在《离子束介导外源DNA转化小麦的当代生物效应分析》文中提出为拓宽小麦种质资源,创造优异新种质,以6个玉米品种和1个银杏品种的总DNA为转化供体,以4个小麦品种为转化受体,进行了离子束介导遗传转化研究试验。结果表明,离子注入和离子束介导遗传转化后,受体材料田间出苗率有明显降低,离子注入、DNA溶液浸泡和离子束介导遗传转化处理小麦当代都有一定的变异率,具有明显的生物效应;离子注入和离子束介导遗传转化的当代生物效应二者间没有明显差异,但较DNA溶液浸泡均更明显。田间出苗率和当代变异率能较一致地反映离子束介导遗传转化存在基因型上的差异。
田花丽[5]2010年在《农杆菌介导银杏抗菌蛋白基因Gk-2转化黄瓜抗病性研究》文中研究表明枯萎病是黄瓜的主要病害之一,给黄瓜生产造成重大的经济损失。由于黄瓜本身枯萎病抗原材料较少,因此,利用常规育种手段提高黄瓜枯萎病抗病性具有一定的局限性。抗菌蛋白是生物体内产生的一类多蛋白,主要作用于细胞膜,通过破坏病原菌细胞膜的完整性,而达到抑菌的作用。它对细菌、真菌、病毒、原虫、癌细胞等均具有一定的杀灭或抑制作用,具有抗菌谱广、不易产生耐药性等特点。因此,抗菌蛋白作为一个抗病候选基因,具有广阔的应用前景。银杏抗菌蛋白基因Ginkbilobin-2 (Gk-2)是从银杏果仁中分离出来的一类新型抗菌蛋白。它不仅对植物病原真菌(尤其是黄瓜镰刀胞菌)有明显的抑制作用,而且对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等细菌也有一定的抑制作用。本研究建立起的黄瓜再生和遗传转化体系,初步证明银杏抗菌蛋白基因Gk-2已成功的转入黄瓜基因组中,且阳性转化植株对黄瓜枯萎病具有明显的抗性。取得的主要结果如下：1.黄瓜再生体系及遗传转化体系的建立：研究中以NC3号黄瓜栽培品种为试验材料,确定了MS6 (MS+0.005 mg/1 TDZ+0.20 mg/1 IAA)培养基适于黄瓜愈伤组织的形成和不定芽的分化,7d即可分化出不定芽,出愈率和分化率分别高达100%和86.67%。因此,该体系是一个简单、快捷的再生体系。利用带有目的基因Gk-2的农杆菌菌液侵染黄瓜,筛选出了预培养2d、侵染时间20 min、共培养时间3d、卡那霉素抗性筛选浓度为100 mg/l以及侵染菌液和共培养培养基中添加乙酰丁香酮的最佳转化体系。从侵染到转基因植株的获得仅需28d左右,且外植体出芽率较高。因此,这是一个简便、快捷的遗传转化体系。2.转基因植株检测：对转化的T0代植株进行RT-PCR及接菌鉴定,表明银杏抗菌蛋白Gk-2已经成功地转入黄瓜基因组中,转基因植株对黄瓜枯萎病具有较好的抗病性,可明显推迟黄瓜枯萎病的发生,表明该遗传转化体系是高效、快速的,可应用于转基因黄瓜的研究。对获得的T1代植株进行PCR扩增,结果表明,Gk-2基因在T1代转基因黄瓜中稳定遗传。充分证明,Gk-2可以作为黄瓜抗病性改良的潜在基因资源。本研究结果为进一步深入利用银杏抗菌蛋白基因Gk-2选育优质的抗病黄瓜品种以及为其他作物新品种的选育奠定了基础。
张娅君[6]2012年在《枣成熟胚离体培养及农杆菌介导叶片与胚遗传转化研究》文中认为枣是鼠李科（Rhamnaceae）枣属（ZiziphusMill.）植物，其产量在叁大干果中占据首位。因枣花期不一致，且花小，授粉困难，在自然条件下坐果率低，且胚败育严重，同时还存在严重的病虫害。传统育种方法周期长、效率低，不易获得优良抗性新品种。本实验以酸枣成熟胚为材料，建立了枣胚离体再生体系，为枣胚的遗传转化研究奠定基础；另外，以灰枣叶片和蜂蜜罐成熟胚为材料，进行了农杆菌介导枣树抗虫基因遗传转化的研究。主要结果如下：1枣成熟胚离体再生体系的建立试验结果表明：以常温保存1年的成熟胚的萌芽率较高，适宜启动培养基为不添加任何植物激素的MS；增殖培养基为1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.3mg/L；培养基中加入PVP1.5mg/L时对褐化有很好的抑制效果。2农杆菌介导枣树抗虫基因遗传转化研究试验以枣叶片和胚为转化受体研究发现，用农杆菌菌株EHA105侵染外植体，共培养结束后，后期脱菌困难，只有菌液浓度在OD600=0.2，侵染时间为12min，共培养3d后，洗菌后能有效抑菌，获得不定芽；枣树对除草剂basta非常敏感，浓度在2mg/L时的褐化死亡率高达96.5%。初步认为枣树的遗传转化不宜用除草剂basta作为筛选剂。不同种或同一种植物的不同品种对除草剂basta的敏感性差别较大，其应用在草本上较为常见。而在木本植物遗传转化时，应用最多的筛选剂是卡那霉素，且本课题组通过研究，已得到卡那霉素在灰枣上的筛选浓度为40mg/L。在后续进行灰枣抗虫基因Bt遗传转化研究前，可考虑对原有基因载体进行改造，将原有的抗除草剂筛选的bar基因替换成抗卡那霉素筛选的新霉素磷胺酸转移酶基因NPTⅡ。
牙祖韧[7]2007年在《厚荚相思离体培养及农杆菌介导遗传转化技术的研究》文中研究说明本论文研究主要从继代增殖、愈伤组织的诱导和分化和无菌苗的生根壮苗及移栽叁个方面对厚荚相思的离体培养体系进行研究，建立起较好的厚荚相思离体再生体系；从浸染时间、预培养时间和共培养时间对厚荚相思农杆菌介导遗传转化的影响进行了的研究，初步建立了厚荚相思的农杆菌介导遗传转化体系，为今后的厚荚相思离体培养与遗传转化研究提供重要的参考依据。试验结果表明：1、单独使用6-BA或KT对无菌苗的增殖效果不好，改良MS+6-BA0.5mg·L~(-1)+KT1.0mg·L~(-1)为适宜的继代增殖培养基，它能够使无菌苗在以较高的倍数增殖的同时保持旺盛的生长势，无菌苗的增殖倍数达3.4倍。2、2，4-D能有效地对厚荚相思不同的外植体部位诱导出愈伤组织，最高诱导率达100％；但诱导出的愈伤组织不能诱导分化形成不定芽。3、6-BA能有效地对厚荚相思不同的外植体部位诱导出愈伤组织，也能直接在外植体上诱导分化出不定芽。最适宜的不定芽诱导培养基为改良MS+6-BA2.5mg·L~(-1)，不定芽的分化率最高，不同的外植体部位的分化率不同。最高的分化率为羽状复叶在此培养基上的直接分化，分化率为55.86％。4、NAA、IAA、IBA和ABT对厚荚相思无菌苗的生根均有较好的促进作用，MET不适合用于厚荚相思无菌苗的生根诱导。5、以不同的激素种类及其组合诱导生根所得组培生根苗的移栽成活率不同。以ABT0.5-2.0mg·L~(-1)+MET0.5mg·L~(-1)诱导生根的组培苗，在黄泥基质进行移栽的成活率最高，成活率达86.39％。6、不同的移栽基质对生根苗的移栽成活率有不同的影响。以黄泥：育苗介质(1∶1)进行移栽时移栽苗的成活率较高，成活率为84.36％。7、厚荚相思外植体对Km的有较高的基础抗性，抗性浓度为100～125mg·L~(-1)。8、头孢噻肟钠浓度为300mg·L~(-1)时可以完全抑制农杆菌At05、At06和A208SE的生长，但外植体保持较高的分化率。9、不同的菌株、菌液浓度、浸染时间、预培养和共培养对厚荚相思遗传转化GUS基因瞬时表达有不同的影响。
侯春喜[8]2009年在《人参皂苷生物合成关键酶基因MVD和βAS的克隆及βAS的反义表达》文中指出人参是我国道地中药植物,其活性成分主要是次生代谢过程中产生的人参皂苷。深入研究人参皂苷生物合成途径关键酶基因的结构与功能,以及利用基因工程手段调控这些关键酶基因活性,达到调控提高人参皂苷含量的目的,将具有重要的理论和实际应用价值。本论文选择二个具有代表性的基因为研究对象,开展了基因克隆及利用反义RNA技术调控人参皂苷生物合成的尝试工作。这二个基因分别是人参皂苷生物合成上游关键酶基因,既催化异戊二烯途径第一个前体物-异戊烯二磷酸(IPP)合成焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因(MVD),另一个基因是人参皂苷生物合成下游关键酶基因β-香树素合成酶基因(βAS),该基因编码的β-香树素合成酶是催化人参皂苷R0(人参次要活性成分)合成的关键酶。本论文用SMART RACE技术扩增人参MVD基因的保守序列,3’片段和5’片段,结果经过序列比对分析和拼接得到一个ORF为1254bp的片段,用此基因的ORF两端设计引物,扩增得到其cDNA全长。人参MVD基因在大肠杆菌中成功表达,其编码的蛋白分子量大小是46kd,与基因序列分析结果一致。(MVD基因在GenBank中的登录号:GQ455989)。利用反义表达策略,首次研究了βAS基因在人参皂苷生物合成中的功能。通过构建反义pBI121-AβAS植物表达载体,转入工程菌A4后转化人参根,对转化条件进行了筛选,获得反义人参发根系A5,A9,A19,A24和A30,Southern杂交结果显示目的基因拷贝数都是单拷贝。Northern杂交显示5株反义发根中的βAS转录水平显着下降,也说明反义βAS的导入确实可降低βAS的转录量,最多比对照组降低1/3。对酶活分析显示,反义发根系βAS活性均降低,同时,转基因发根系DAS活性被上调,DAS活性在所有的转化组中都获得增加,尤其在A19中增加了1.2倍。化学分析结果显示皂苷合成前体物2,3氧化鲨烯的积累增加。人参皂苷含量分析结果表明,齐敦果烷型人参皂苷R0含量均降低,最多降40%,转化发根的达玛烷型人参皂苷含量最高增加到原来的1.3倍,并且单体皂苷Rb1, Rb2, Rc, Rd,Re,Rf和Rg1均不同程度增加。这些研究成果对于促进MVD的异源表达、提高人参皂苷含量的种质资源的研究具有重要的指导作用,为调控人参皂苷的含量及人参代谢工程的研究奠定了理论和实践基础,具有广阔的应用前景。
张建业[9]2002年在《银杏LEAFY同源基因的分离克隆及其相关基础研究》文中进行了进一步梳理银杏(Ginkgo Biloba L．)，又名白果，着名的孑遗植物，被誉为活化石，是珍贵的食用、药用、材用、观赏用树种。银杏又是严格的雌雄异株，还没有发现雌雄同株现象，其雌雄株在染色体核型，过氧化物同工酶谱等都有较大差异。雌雄花形态也截然不同，有的专家还认为银杏有性染色体。银杏果实营养丰富，味道鲜美，遗憾的是银杏的童期很长，被称为公孙树，实生树的开花需要十几年，严重制约着银杏品种改良和经济利用。为缩短银杏童期，果树工作者进行了大量的研究，从栽培方式，传统育种方法进行了探索，但成效不大。 近年来模式植物拟南芥的开花机理研究取得了很大进展。至少有80个以上与拟南芥开花有关的基因和位点被识别出来。其中LEAFY(LFY)是一个花分生组织特征基因，控制着拟南芥营养分生组织向花分生组织的转变，也影响拟南芥的开花时间。LFY的过量表达可以促使拟南芥、水稻、欧洲山杨、柑桔提早开花。虽然银杏是较古老的裸子植物，但由于LEAFY基因的保守性，银杏LEAFY同源基因也可能调控着银杏开花的时间。同时，银杏的遗传转化研究极少，也需要加以研究。为此，本实验从银杏LEAFY同源基因的克隆入手，分析其雌雄株LFY基因结构差异，构建LFY基因的植物正义反义表达载体，建立矮牵牛遗传转化体系，以研究银杏LFY同源基因的功能，同时建立了银杏组织培养体系，为银杏的遗传转化和提早开花结果奠定基础。 1．常规的CTAB法提取的银杏基因组DNA呈黄色，不易被内切酶所消化，也不能作为PCR模板。我们将CTAB法稍做改良：研磨样品时加入适量的不溶性PVP，提高β-巯基乙醇在提取液中的比例，从而提取到了无色、可酶解、可作PCR模板的高质量的银杏基因组DNA。 2．首次用银杏栽培品种大佛手(Ginkgo biloba L．cv．Dafushou)雄株基因组DNA为模板，通过PCR扩增，获得两个银杏雄株LEAFY同源基因GinLFY和GinNdly基因。 结果分析表明，GinLFY DNA序列全长为3450个核苷酸。经同源性分析和DNA序列结构分析，推测该序列为银杏雄株LEAFY全长基因。该基因与文献报道的银杏雌株LEAFY基因相比，核苷酸序列同源性高达99％，蛋白质序列同源 浙江大学博士学位论文 摘要 性达99％，缺少了3个核昔酸，突变均在植物LEAF’Y基因的非保守区内。从内 含子边界特征和多种植物LEAFY基因同源性比较，确定了该基因的内含子位置。 该基因含 2个内含子，3个外显子。GinNap全长基因含 1493个核昔酸，也含有 2个内含子，3个外显子。与文献报道的银杏雌株 GinNap基因相比，碱基数少 了叁个，对应地少了一个丙氨酸，核昔酸同源性为99．7％，氨基酸同源性为99．3％。 与拟南芥LEAF’Y基因相比较，银杏GinLFY和G毗基因没有做为转录激 活区域的位于氨基酸序列中间的酸性区和位于N端的富含脯氨酸区，但这两个 区域均位于LEAFY基因的非保守区。银杏雄株GinLFY和GinNdly之间氨基酸序 列同源性为 60．2％，这小于被子植物拟南芥 LFY与金鱼草 FLO之间的同源性（7 ％）。另外，与拟南芥L厂Y同源性分别为50刀％和扔＊％：与辐射松＊＊FL L同源 性分别为80．3％和58．二％；与辐射松NEEDLY同源性分别为58二％和75石％。 3．利用p8I121和pCAMBIA1301两个植物表达双元载体质粒构建了心”以沙 基因的反义与正义植物表达载体PZJI 17、PZJlls、PZJllg、PZJ120等四个质粒。 pCAMBIA1301所带的报告基因GUS含内含子，使得GUS只能在真核细胞中起显 色反应。但它的多克隆位点旁侧没有启动子与终止子。构建 Gll7Ndl基因的植 物表达载体前，先给PCAMBIA1301加上了启动子和终止子，形成PCAMBIA1301 一 355—P帖质粒。然后利用限制性内切酶双酶切，构建成 PZJI 19和 PZJ120 质粒。PBI 121表达载体构建方法是酶切去除GUS基因，利用T4连接酶代之以 GinNdl基因，构建成PZJll7和PZJI 18。通过PCR检测和酶切验证，证明质粒 构建正确，并将之转入根癌农杆菌EHA105儿BA4404、GV3101和发根农杆菌15834 中。 4．利用叶片建立了矮牵牛遗传转化体系。培养基MS＋BAZ．0＋NAAO．4适于矮 牵牛叶片诱导愈伤组织，再生不定芽，每块愈伤组织上的不定芽数可达12个以 上，并且源源不断地发出不定芽来。经叶盘的农杆菌敏感性、抗生素耐受性实验， 建立了以叶盘为受体的矮牵牛遗传转化体系。利用含GinNdP基因的正义植物 表达载体质粒PZJI 17的根癌农杆菌EHA105转化矮牵牛，获得了一些抗卡那霉 素的抗性芽，经PCR检测证明，CinNdy基因己经整合到矮牵牛的基因组中。 5．银杏的组织培养银杏的子叶，胚轴，胚根，胚乳，茎段，叶柄，叶片， 根都可以诱导出愈伤?
王汝艳[10]2010年在《一品红遗传转化体系建立的初步研究》文中提出一品红(Euphorbia pulcherrima Willd)为大戟科大戟属植物,别名圣诞红、圣诞花,是国内外最重要盆花之一。世界年产量在2亿盆以上,自然花期在元旦前后,利用常规育种手段不能改变自然花期,生产上通常采用花期调控技术来达到周年供应的目的,但需要现代温室设施投入和大量能源消耗。采用基因工程技术转入与开花相关的基因来调控开花基因的表达,是今后一品红品种花期改良的重要途径。试验以一品红嫩叶为外植体,从愈伤组织诱导、根、芽器官分化等方面开展研究,建立了一品红植株再生体系;在此基础上,以一品红‘天鹅绒’胚性愈伤组织为外植体,利用根癌农杆菌介导法,开展了将拟南芥花分生组织特异相关基因AP1基因转入一品红的研究,主要研究结果如下:(1)通过对最适外植体、不同灭菌时间及抗褐化添加剂的筛选,以及不同植物生长调节物质组合对愈伤组织诱导、芽诱导和根诱导效应的研究,建立了稳定的一品红再生体系。其中,一品红愈伤组织诱导的最优培养基为:MS+ 6-BA 0.5 mg/L+ 2,4-D 0.5 mg/L+Vc 0.05g/L ;诱导愈伤组织芽发生的最适宜培养基为:MS+NAA 0.5 mg/L或6-BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L+Vc 0.05g/L;诱导根分化的最有效培养基为:1/2MS+ NAA 1.0mg/L+ IBA 1.0mg/L+Vc 0.05g/L;壮苗培养中采用1/2MS+NAA 0.5mg/L+IBA0.5mg/L培养基,效果较好。(2)基于所建立的一品红再生体系,以高质量愈伤组织为主要转化受体,进行AP1基因的遗传转化。详细探讨了头孢霉素、羧卞青霉素对一品红外植体生长和农杆菌抑菌效果的影响,优化了转化条件,即选用头孢霉素300 mg/L、羧卞青霉素250 mg/L作为抑菌剂,选用30mg/L的卡那霉素作为筛选浓度。最后,采用GUS染色和PCR检测,发现抗性愈伤组织上的不同部分呈现深蓝色,转基因材料DNA在引物1扩增出约700bp的片段,引物2和3处,分别扩增出约400bp片段,进一步目表明目标基因已经转入一品红基因组中。
参考文献：
[1]. 建立银杏遗传转化受体系统的研究[D]. 张明文. 浙江大学. 2003
[2]. 银杏萜内酯代谢途径中关键酶基因的遗传转化研究[D]. 张雯. 复旦大学. 2008
[3]. 龙眼胚性愈伤组织SOD的表达分析及启动子功能鉴定[D]. 曾丽兰. 福建农林大学. 2013
[4]. 离子束介导外源DNA转化小麦的当代生物效应分析[J]. 赵新亮, 王铁固, 欧行奇, 冯伟森, 王卫东. 贵州农业科学. 2009
[5]. 农杆菌介导银杏抗菌蛋白基因Gk-2转化黄瓜抗病性研究[D]. 田花丽. 西北农林科技大学. 2010
[6]. 枣成熟胚离体培养及农杆菌介导叶片与胚遗传转化研究[D]. 张娅君. 河南农业大学. 2012
[7]. 厚荚相思离体培养及农杆菌介导遗传转化技术的研究[D]. 牙祖韧. 广西大学. 2007
[8]. 人参皂苷生物合成关键酶基因MVD和βAS的克隆及βAS的反义表达[D]. 侯春喜. 吉林大学. 2009
[9]. 银杏LEAFY同源基因的分离克隆及其相关基础研究[D]. 张建业. 浙江大学. 2002
[10]. 一品红遗传转化体系建立的初步研究[D]. 王汝艳. 扬州大学. 2010
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