导读:本文包含了醇氧化酶论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:氧化酶,激酶,磷酸,家蚕,层析,激素,维生素。
醇氧化酶论文文献综述
任静[1]（2018）在《烟草磷酸吡哆醇氧化酶和多胺氧化酶基因的克隆与分析》一文中研究指出维生素B_6(VB_6)是一类吡啶化合物的总称,为无色晶体,易溶于水和乙醇,是人体必需的维生素。PLP(磷酸吡哆醛)是其主要活性形式,是生物体代谢过程中多种酶的辅酶,研究显示PLP不仅与氨基酸的代谢有密切相关,其还可参与调节细胞信号转导过程。自然界中VB_6的从头合成途径分为两条,一条为DXP依赖途径,该途径仅存在于真核细菌中;另一条为DXP非依赖途径,是自然界中VB_6合成的主要途径。VB_6的六种组份可通过代谢转换途径实现相互转换,其中PL激酶、PL还原酶、PNP氧化酶、吡哆胺丙酮酸转氨酶及磷酸酶在此过程中发挥重要作用。动物自身不能从头合成VB_6,只能通过VB_6的代谢转换将从饮食中摄取的VB_6转换成机体所需要的形式。植物作为动物获取VB_6的主要来源,研究其体内VB_6的代谢转换具有重要意义。本文以模式植物烟草为材料对PNPO(PNP氧化酶)及PA-O(多胺氧化酶)进行了相关研究。1、通过对已知的NtPNPO氨基酸序列的分析,克隆得到去除叶绿体转运肽同源域的NtPNPO序列,称NtPNPO-2;同时去除叶绿体转运肽同源域、Yjef-N功能域同源域的NtPNPO序列,称NtPNPO-3,测序结果显示NtPNPO-2编码框全长1296bp,编码含有431个氨基酸残基的蛋白质,分子质量为48KDa,等电点为6.31;NtPNPO-3编码框全长750bp,编码含有249个氨基酸残基的蛋白质,分子质量为28KDa,等电点为7.49。通过构建Pmal-C2x-NtPNPO-2、Pmal-C2x-NtPNPO-3原核表达载体,成功获得融合蛋白,随后酶活测定结果显示NtPNPO-2、NtPNPO-3均有催化PMP(磷酸吡哆胺)的活性,明确了烟草PNP氧化酶中Yjef-N功能域并非该酶发挥活性的必要结构。2、通过对烟草EST库的比对得到多胺氧化酶cDNA序列(称NtPAO),对NtPA O进行克隆得到预期的DNA片段,测序结果显示NtPAO编码框长度为1707bp,编码含有568个氨基酸残基的蛋白质,该蛋白的分子量约为63KDa,等电点为5.35。通过构建P-mal-C2x-NtPAO原核表达载体,成功获得目的蛋白。以Spm(精胺)为底物的酶促反应显示,粗酶液具有多胺氧化酶活性,表明原核表达产物是具有活性的N tPAO蛋白。随后以PM(吡哆胺)为底物的酶促反应,显示NtPAO具有催化PM的功能。(本文来源于《安徽农业大学》期刊2018-06-01）
马振桥[2]（2017）在《烟草吡哆醛激酶和磷酸吡哆醇氧化酶基因的克隆与分析》一文中研究指出维生素B6(Vitamin B6,VB6)是一类可以相互转换的吡啶类化合物的总称,包括吡哆醇(Pyridoxine,PN)、吡哆胺(Pyridoxamin,PM)、吡哆醛(Pyridoxal,PL)以及它们所对应的磷酸酯形式为磷酸吡哆醇(Pyridoxine-5’-phosphate,PNP)、磷酸吡哆胺(Pyridoxamine-5’-phosphate,PMP)和磷酸吡哆醛(Pyridoal-5’-phos phate,PLP)。其中PLP是细胞内140多种酶的辅酶。动物自身不能合成VB6,其需要从食物中获取各种形式的VB6通过代谢转换途径完成PLP的合成。在自然界中存在两条从头合成途径,一条是DXP依赖途径,另一条是DXP非依赖途径。植物通过DXP非依赖途径合成PLP,PLP在植物体内经过一系列酶的催化作用代谢转换成不同形式的VB6。在这个过程中VB6磷酸酶、PL还原酶、PM-丙酮酸转氨酶、吡哆醛激酶(PLK,Pyridoxal kinase)和磷酸吡哆醇氧化酶(PNPO,Pyridoxine 5’-phosphate oxidase)起着至关重要的作用。PLK可以将PN、PM和PL磷酸化生成PNP、PMP和PLP,PNPO可以将PNP和PMP氧化生成PLP。植物作为动物的主要食物来源,也是VB6的主要来源。植物体内VB6的代谢转换途径的研究对人体营养素VB6的供给问题具有重要的意义,PLK和PNPO两个关键代谢转换作用酶的研究也尤为必要。在植物拟南芥中已经克隆鉴定出PLK和PNPO并通过T-DNA插入突变在基因表达水平上研究对其他VB6合成代谢转换酶基因表达的影响,但其还缺乏在不同物种和不同方法上的验证。本实验采用模式植物烟草为材料进行PLK和PNPO相关研究,对植物体内营养素VB6的合成和代谢转换具有参考作用。本研究,利用拟南芥PLK和PNPO cDNA序列在烟草EST库中检索,寻找到预测编码烟草NtPLK和NtPNPO的cDNA序列,在Genbank上的登录号分别为XM_009804516.1和XM_009801441.1。以提取的烟草叶片总RNA反转录得到的cDNA为模板,设计引物对NtPLK和NtPNPO的编码框进行克隆得到预期大小的DNA片段,产物测序结果显示NtPLK的编码框长为1020bp,编码的蛋白含有339个氨基酸,分子量大小为37.4kDa,等电点为6.96。氨基酸序列比对发现相对哺乳动物、昆虫和细菌存在N端延长,酶活性位点处的氨基酸残基和其他物种一样保守。该基因在染色体上跨度1.2kb DNA,含有13个外显子和12个内含子。NtPNPO的编码框长为1620bp,编码的蛋白质含有539个氨基酸,分子量大小为60kDa,等电点为8.03。氨基酸序列比对发现与哺乳动物、昆虫和细菌相比在N端大幅度延长约280个氨基酸残基,该区域主要是YjeF_N功能域,该功能域功能目前尚不清楚。该基因在染色体上跨度0.7kb DNA,含有14个外显子和13个内含子。NtPLK在烟草的叶片中转录表达水平最高,根和茎中转录表达水平较低且比较接近。NtPNPO在烟草的叶片中转录表达水平最高,茎中次之,根中最低。将克隆得到的NtPLK和NtPNPO的编码框序列导入到pET32a_((+))表达载体中在Rosetta大肠杆菌中表达出预期蛋白。NtPLK的粗酶液相对于底物PL,显示的吡哆醛激酶的活性为29.7nmolPLP/mg/min。NtPNPO的粗酶液相对于底物PMP,显示的磷酸吡哆醛氧化酶的活性为21.4nmolPLP/mg/min。酶活证实了我们克隆的序列所编码的蛋白为烟草PLK和PNPO。选取NtPLK的编码框内490bp的特异性的序列和NtPNPO的编码框内497bp的特异性的序列,将其各自的正反向序列分别插入pHANNIBAL中内含子的两端,构建发卡结构的RNAi载体。利用农杆菌EHA105介导侵染烟草叶片,通过qRT-PCR检测显示NtPLK RNAi在烟草叶片中下调NtPLK转录水平表达效果的最佳时间是72h,NtPNPO RNAi在烟草叶片中下调NtPNPO转录水平表达效果的最佳时间是48h。NtPLK RNAi处理后72h,烟草叶片中NtPLK、NtPNPO和NtPDX1转录水平的表达量分别下降了50.9%、51.1%和26.3%,而NtPLR上升了27.7%;NtPNPO RNAi处理后48h,烟草叶片中NtPNPO、NtPLK、NtPLR和NtPDX1转录水平的表达量分别下降了68%、22.1%、29.5%和33.9%。证实了构建的RNAi载体成功的下调了目的基因的表达。(本文来源于《安徽农业大学》期刊2017-06-01）
沈伟[3]（2016）在《毕赤酵母醇氧化酶启动子调控相关激酶的研究与应用》一文中研究指出毕赤酵母表达系统是应用最为广泛的重组蛋白表达系统之一,目前已经有超过5000种蛋白通过毕赤酵母系统实现了重组表达。重组蛋白的表达主要依赖一个高效的醇氧化酶基因启动子PAOX1,该启动子受到甲醇的强烈诱导但在其他碳源如葡萄糖、甘油、乙醇中被严格阻遏。由于PAOX1的诱导需要甲醇,其有毒、易燃易爆等特性使得在大规模发酵及生产食用医用产品等方面存在很大限制。其中一个行之有效的解决办法是开发一种不使用甲醇而能够使用其他碳源来高效诱导PAOX1表达重组蛋白的非甲醇依赖型毕赤酵母表达系统。这一设想的实现首先要求对毕赤酵母PAOX1的调控机制需要有较为清楚的认知。目前的研究还仅停留在单个因子的研究上,例如碳源感受体、转运子以及转录因子。激酶在信号转导中扮演着重要的角色,而目前对于激酶的研究则非常少。因此本研究在毕赤酵母数据库中查找了所有目前已注释为激酶的基因,将这些激酶基因单独缺失后建立突变体文库,进行了在不同碳源中的生长状态以及Aox酶活的检测。而后我们从中选取了一个具有比较明显表型的缺失株△hog1,对其在甘油培养条件下进行磷酸化蛋白质组鉴定并与甲醇和甘油培养的野生型毕赤酵母菌株进行了比较与分析。另外我们还根据激酶敲除的结果针对△gut1与△dak菌株成功构建了 2个具有开发潜力的新型非甲醇诱导表达系统,分析了其表达异源重组蛋白的能力。本文首先在毕赤酵母数据库中查找到了 152个已注释的激酶基因,成功地对其中的92个激酶基因进行了单独的缺失。通过对缺失株在不同碳源中的生长状况检测,鉴定了23个激酶基因与毕赤酵母的生长有关,其中影响最为明显的包含有3个碳源非特异性生长相关基因:PAS_chr3_0667,PAS_chr2-1_0168和PAS_chr3_0112,这些基因的缺失株在葡萄糖、甘油及甲醇碳源中生长均受抑制;一个甘油特异性生长相关基因:PAS_chr4_0783,该缺失株仅在甘油碳源中的生长受到抑制;以及8个甲醇特异性生长相关基因:PAS_chr1-4_0340,PAS_chr1-4_0498,PAS_chr3_0841,PAS_chr1-3_0213,PASchr3_0360,PASchr2-10211,PASchr30042以及PAS_FragB_0061,其缺失株仅在甲醇中的生长受到抑制。通过对缺失株进行不同碳源中的Aox酶活检测,鉴定了 9个激酶基因与毕赤酵母PAOX1的激活/阻遏调控相关,其中包含5个与PAOX1甘油碳源阻遏相关的基因:PAS_chr1-3_0232,PAS_chr1-40271,PASchr1-1_0105,PAS chr3_0220和PASchr40783;4个与PAOX1甲醇碳源激活相关的基因:PASchr2-1_0641,PAS_chr2-1_0028,PAS_chr2-1_0639 及 PAS_chr1-4_0498。基于激酶筛选结果我们挑选了△hog1菌株,将WT在甲醇及甘油碳源培养条件下以及△hog1菌株在甘油培养条件下叁个样品的全蛋白进行磷酸化蛋白质组的鉴定。结果发现在肽段的磷酸化位点数量分布,磷酸化氨基酸的种类分布情况在叁个样品中均呈现一个较为一致的情况,仅在绝对数量上有一定区别。对于磷酸化蛋白的GO以及COG分析我们同样也发现,GO分析与COG分析结果在叁个样品中的分布在总体状态上呈现一致。而通过叁个样品间差异磷酸化蛋白的分析我们鉴定了各类在不同菌株不同碳源中特异性磷酸化的蛋白以及157个Hog1激酶可能的作用底物。这些数据结果给未来的进一步研究提供了一定的基础。基于激酶筛选结果我们挑选了△gut1和△dak菌株,在这2个菌株的基础上我们成功构建了具有一定开发前景的△gut1-HpGCY1-Glycerol以及△dak-DHA非甲醇诱导型表达系统。△gut1-HpGCY1-Glycerol系统可以使用甘油作为唯一碳源诱导PAOX1的表达,△dak-DHA系统可以使用二羟基丙酮(DHA)作为唯一碳源诱导PAOX1的表达,两个系统中PAOX1在葡萄糖碳源中均被完全阻遏。因此,这两个系统均保留了毕赤酵母PAOX1原本的可调控能力。转录分析表明在两个系统中,在甘油或DHA碳源培养条件下,甲醇代谢通路与过氧化物酶体相关合成基因相对于野生株都有不同程度的提升,PAOX1的脱阻遏发生在转录水平。而在Western bolt检测中,两个系统在甘油或DHA碳源中在蛋白层面上均能够检测到Aox蛋白的存在。通过表达绿色荧光蛋白我们发现,△dak-DHA系统异源重组蛋白的表达水平要优于△gut1-HpGCY1-Glycerol系统。进一步通过表达3种不同来源不同定位的异源重组蛋白,我们发现△dak-DHA系统的表达水平能达到传统以甲醇为碳源进行诱导的50～60%,并在单细胞表达能力上均优于组成型启动子PGAP。(本文来源于《华东理工大学》期刊2016-12-30）
吴茵,陈敏,郭倩[4]（2016）在《刺芹侧耳芳基醇氧化酶的分离纯化及其酶学性质》一文中研究指出分离纯化刺芹侧耳Pleurotus eryngii芳基醇氧化酶,并探究其酶学性质。通过硫酸铵盐沉、DEAE-Sepharose Fast Flow弱阴离子交换层析、Sephacryl S-200 High Resolution凝胶过滤层析和Source 15Q强阴离子交换层析,得到纯化的单一酶。经肽指纹图谱鉴定,确定其为芳基醇氧化酶,酶活回收率25.5%,纯化倍数38.2。结合SDS-PAGE和IEF-PAGE分析,确定其分子量和等电点分别为70k Da和4.2。以藜芦醇为底物,该酶最适反应p H为6.0,最适反应温度为70℃,金属离子Zn~(2+)、Fe~(2+)和Cu~(2+)对芳基醇氧化酶的活性抑制作用明显,Km和Vmax分别为0.921mmol/L和80U/mg。(本文来源于《菌物学报》期刊2016年06期）
姚丽丽[5]（2016）在《家蚕吡哆醛激酶和磷酸吡哆醇氧化酶基因的RNA干扰研究》一文中研究指出PLP是主要辅酶形式,参与体内氨基酸、糖原、神经递质、鞘磷脂、血红素和核酸的合成与代谢。由于PLP的缺乏会引起严重的神经系统疾病,PLP浓度过高又会产生毒性作用,导致感觉神经和运动出现问题,因此PLP的合成调节及平衡供给是VB6营养核心问题。酶的调节一般从结构水平和合成水平两个方面进行研究,目前PLP合成酶结构水平研究已经透彻,但是合成调节如转录翻译等方面研究有待深入。有研究发现过表PLP依赖酶,PLP含量随之也增加,这提示PLP的合成酶和PLP依赖酶之间有联动调节关系。家蚕是大型泌丝性昆虫,蛋白质代谢旺盛,PLP作为转氨酶的辅酶,PLP需求量增加。为此本研究以家蚕为实验材料,用RNAi的方法对PLK和PNPO基因进行干扰,用荧光定量的方法检测PLK基因、PNPO基因及转氨酶基因的转录水平表达变化,并用高通量测序的方法对RNAi处理后的家蚕丝腺组织进行基因转录组学分析,探讨涉及PLP合成酶基因调控网络。实验结果如下:1.家蚕PLK和PNPO基因RNAi(1)PLK和PNPO基因在注射干扰片段si RNA 48 h后干扰效率最佳。(2)PLK最佳干扰片段是k-siRNA1下降了80%;PNPO最佳干扰片段是o-si RNA2下降了65%。(3)PLK和PNPO基因RNAi处理后,干扰效果最好的组织都是中肠组织,基因表达量分别下降了55%和52%。脂肪体中几乎没有干扰效率。2.家蚕PLK和PNPO基因RNAi后转氨酶的表达量研究PLK基因RNAi处理后,丝腺中磷酸丝氨酸转氨酶(phosphoserine aminotransferase,Ser B)和天门冬氨酸氨基转移酶(asparate aminotransferase,AST)表达量分别下降了90%和29%;PNPO基因RNAi处理后,丝腺中SerB和AST基因表达量分别下降了28%和26%。3.家蚕PLK和PNPO基因RNAi后丝腺组织转录组学分析PLK基因RNAi处理后,筛选得到差异基因365个,其中基因下调177个,基因上调188个。对PLK基因处理组的差异基因进行GO富集,其中,有显着的GOterms有150个(P≤0.05),包括39个分子功能(Molecular funtion),99个生物过程(Biological process)及12个细胞成分(Cell component)。对KEGG代谢通路分析发现有9条通路有富集现象,差异基因主要富集在内质网蛋白加工、次生物质合成和累积及蛋白输出通路中。PNPO基因RNAi处理后,筛选得到差异基因381个,其中基因下调基因260个,上调基因121个。对PNPO基因RNAi处理组的差异基因进行GO富集,分析发现具有显着性富集的分析发现具有显着性的Goterms有280个(P≤0.05),包括140个生物学过程、68个细胞组分和72个分子功能。对其KEGG代谢通路通路分析发现有10条通路有富集现象,差异基因主要富集在内质网蛋白加工、蛋白质输出、核糖体及氨酰生物合成通路中。本研究证明了家蚕PLP合成酶基因和转氨酶基因存在联动调节,PLP合成酶RNAi干扰后影响到家蚕丝蛋白合成,为进一步分析PLP的动态平衡及VB6的代谢工作奠定基础,为研究人类VB6营养问题提供依据。(本文来源于《安徽农业大学》期刊2016-06-01）
杨欢欢,姚丽丽,张剑韵,黄龙全[6]（2015）在《外源激素处理后家蚕吡哆醛激酶和磷酸吡哆醇氧化酶转录水平的变化》一文中研究指出【目的】研究家蚕Bombyx mori经蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20-E)和保幼激素类似物(juvenile hormone analogue,JHA)处理后引起吡哆醛激酶(pyridoxal kinase,PLK)和磷酸吡哆醇氧化酶(pyridoxine-5'-phosphate oxidase,PNPO)的转录水平变化,为进一步研究激素对蚕体营养代谢等工作奠定基础。【方法】以20-E和JHA分别喂食不同发育时期(5龄第1,3和5天)的家蚕幼虫,以喂食蒸馏水的家蚕为对照,采用实时荧光定量PCR(realtime quantitative PCR)方法在处理后24和48 h对各组幼虫后部丝腺中PLP合成酶PLK和PNPO的转录水平进行分析。【结果】5龄第1天幼虫经20-E处理24和48 h后,PLK和PNPO的转录水平出现上调且与对照的差异达到极显着(P<0.01);5龄第3天幼虫经20-E处理,PLK的转录水平在48 h出现下调且与对照的差异达到显着(P<0.05),PNPO的转录水平在24和48 h均出现上调且与对照的差异达到极显着(P<0.01);5龄第5天幼虫经20-E处理后PLK和PNPO的转录水平无变化。5龄第1天幼虫经JHA处理后PLK和PNPO的转录水平未受到影响;5龄第3天幼虫经JHA处理后,PLK的转录水平在48 h出现显着下调且与对照的差异达到显着(P<0.05),PNPO的转录水平在24和48 h后均出现显着下调且与对照的差异达到极显着(P<0.05);5龄第5天幼虫经JHA处理24和48 h后,PLK和PNPO的转录水平出现下调且与对照的差异达到极显着(P<0.01)。【结论】20-E和JHA显着影响家蚕5龄幼虫PLK和PNPO的转录水平,20-E提高5龄前期家蚕PLK和PNPO的转录水平,JHA降低5龄后期它们的转录水平,为深入研究激素对VB_6的调控奠定基础。(本文来源于《昆虫学报》期刊2015年12期）
李坤[7]（2014）在《聚乙烯醇降解菌及仲醇氧化酶宏基因组的筛选》一文中研究指出聚乙烯醇(Poly (vinyl) alcohol，简称PVA)，是目前已发现的唯一可溶于水且无毒的高聚物，具有很多优良的物理性质，如高粘度、成膜性、乳化性、拉伸性、对水、油脂和有机溶剂均有抵抗性等。基于以上特性，PVA广泛应用于粘合剂、涂料、乳化剂、造纸和纺织等行业。目前许多工业废水中含有大量的PVA，由于PVA的可降解性很差，会造成极大的环境污染。因此，研究PVA降解菌及PVA降解酶对于减轻环境污染将具有重大的意义。本论文从筛选PVA降解菌出发，详细研究了一个混菌体系SH-TD的PVA降解性质并通过响应面优化大大提高了其发酵产PVA降解酶的能力。设计了一个功能筛选基因文库的策略，尝试从中筛选出PVA氧化酶(Secondary alcohol oxidase, SAO)阳性克隆子进而获得SAO酶核酸序列，主要研究结果及内容呈现如下：1、利用以PVA为唯一碳源培养基从纺织印染厂土样及活性污泥中富集筛选到一个能在4天内完全降解PVA唯一碳源培养基中1g·L-1PVA的混菌体系SH-TD，从中纯化出3株纯培养的PVA降解菌，经鉴定分别为SH1(Aeromonas sp.)、TD5(Pseudomonassp.)以及TD33(Acinetobacter sp.)。其中TD5和TD33分别可以单独在220h和160h内完全降解发酵培养基中1g·L-1的PVA1799。然而SH1据推测只能利用小分子量的PVA寡聚物。通过测定酶活力，只在SH-TD的发酵液上清中检测到了SAO酶酶活。2、通过单因素实验对可能影响SH-TD对PVA降解效率的生长因子、氮源以及金属离子进行探索，确定了一个更适合SH-TD降解产酶的发酵优化起始培养基，其组成为：PVA、酵母粉、(NH4)2HPO4、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、NaCl、Phe、Trp、Thr。选择了基础培养基中的8个主要因素进行PB实验，根据显着性顺序，得到叁个影响显着的因素分别为酵母粉、(NH4)2HPO4、CaCl2·2H2O。通过爬坡实验和BB实验分析确定了当酵母粉、(NH4)2HPO4和CaCl2·2H2O的浓度分别为0.04、48.42、0.06g·L-1时，24h内SH-TD对PVA的降解效率由优化前的30%提高到78.76%。3、运用宏基因组技术，构建了一个包含SH-TD中全部基因组的Fosmid文库。通过功能筛选，从大约150000个Fosmid文库克隆中筛选得到FTD1-FTD42等42个可在筛选平板上形成透明圈的阳性克隆。其中FTD2SAO酶活力最大为57mU·mL-1。以叁个阳性Fosmid克隆质粒为基因来源构建亚克隆文库。(本文来源于《江南大学》期刊2014-06-01）
谷晶,郭红森,邓教宇[8]（2013）在《大肠杆菌磷酸吡哆醇氧化酶乙酰化位点对酶活性的影响》一文中研究指出大肠杆菌磷酸吡哆醇氧化酶(PdxH)催化磷酸吡哆醇和磷酸吡哆胺氧化形成磷酸吡哆醛,该反应是大肠杆菌从头合成磷酸吡哆醛的最后一步,也是大肠杆菌和哺乳细胞中通过补救途径合成磷酸吡哆醛的关键一步,是维生素B6代谢途径中的重要步骤。本实验室早期蛋白质芯片筛选结果表明,大肠杆菌PdxH酶可能具有乙酰化修(本文来源于《2013年湖北省暨武汉微生物学会会员代表大会暨学术年会论文摘要集》期刊2013-11-21）
李会宣,董向峰,高健[9]（2013）在《Pichia pastoris醇氧化酶基因AOX1启动子研究进展》一文中研究指出醇氧化酶AOX1基因启动子作为甲醇诱导的强启动子,在Pichia pastoris表达系统生产重组蛋白中得到广泛应用。P.pastoris中的转录因子通过特异的顺式作用元件与启动子相互作用而影响基因的转录,因此通过调节AOX1基因启动子的活性可以控制下游基因的表达。基于此,该文就AOX1基因启动子的结构特点和功能、调节AOX1基因启动子活性的因素和方法途径进行综述,并对AOX1基因启动子研究中存在的一些问题进行探讨,以期为从分子水平上阐明AOX1基因启动子的活性调控机制提供借鉴,为提高外源蛋白在P.pastoris表达系统中的产量提供参考。(本文来源于《生物技术》期刊2013年04期）
郭红森[10]（2013）在《大肠杆菌磷酸吡哆醇氧化酶乙酰化位点的突变对酶活性的影响》一文中研究指出大肠杆菌磷酸吡哆醇氧化酶催化磷酸吡哆醇和磷酸吡哆胺氧化形成磷酸吡哆醛,该氧化过程以黄素单核苷酸为中间电子受体,氧气为最终电子受体；该反应是大肠杆菌从头合成磷酸毗哆醛的最后一步,也是大肠杆菌和哺乳细胞中通过补救途径合成磷酸吡哆醛的关键一步。乙酰化修饰普遍存在于胞内的关键代谢酶中,近年来的研究结果显示乙酰化修饰在细胞动力学、细胞凋亡、能量代谢、蛋白质运输和自噬等过程中都发挥重要作用。本实验室早期蛋白质芯片筛选结果表明,大肠杆菌磷酸毗哆醇氧化酶可能具有乙酰化修饰位点,通过Western blotting实验,我们首次确认了大肠杆菌磷酸吡哆醇氧化酶的乙酰化修饰现象,通过质谱进一步的分析,得到了该酶的两个赖氨酸乙酰化修饰位点,分别是72和159位。对不同来源的磷酸吡哆醇氧化酶氨基酸序列进行多重序列比对后发现,72位赖氨酸高度保守,159位赖氨酸的保守性较低。对这两个乙酰化修饰位点分别进行了定点突变,结果表明72位赖氨酸对于大肠杆菌磷酸吡哆醇氧化酶保持酶活力具有关键性作用。在我们构建的72位的四个突变体(K72R, K72Q, K72P和K72A)中,除了K72R之外,其余叁个突变体都只保留了小于10%的酶活力,酶学常数也发生了改变；而且该位点的突变还影响了该酶反应的最适pH值,最适温度和热稳定性等基本性质；159位氨基酸定点突变后对该酶活力的影响较小。(本文来源于《华中农业大学》期刊2013-06-01）
醇氧化酶论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
维生素B6(Vitamin B6,VB6)是一类可以相互转换的吡啶类化合物的总称,包括吡哆醇(Pyridoxine,PN)、吡哆胺(Pyridoxamin,PM)、吡哆醛(Pyridoxal,PL)以及它们所对应的磷酸酯形式为磷酸吡哆醇(Pyridoxine-5’-phosphate,PNP)、磷酸吡哆胺(Pyridoxamine-5’-phosphate,PMP)和磷酸吡哆醛(Pyridoal-5’-phos phate,PLP)。其中PLP是细胞内140多种酶的辅酶。动物自身不能合成VB6,其需要从食物中获取各种形式的VB6通过代谢转换途径完成PLP的合成。在自然界中存在两条从头合成途径,一条是DXP依赖途径,另一条是DXP非依赖途径。植物通过DXP非依赖途径合成PLP,PLP在植物体内经过一系列酶的催化作用代谢转换成不同形式的VB6。在这个过程中VB6磷酸酶、PL还原酶、PM-丙酮酸转氨酶、吡哆醛激酶(PLK,Pyridoxal kinase)和磷酸吡哆醇氧化酶(PNPO,Pyridoxine 5’-phosphate oxidase)起着至关重要的作用。PLK可以将PN、PM和PL磷酸化生成PNP、PMP和PLP,PNPO可以将PNP和PMP氧化生成PLP。植物作为动物的主要食物来源,也是VB6的主要来源。植物体内VB6的代谢转换途径的研究对人体营养素VB6的供给问题具有重要的意义,PLK和PNPO两个关键代谢转换作用酶的研究也尤为必要。在植物拟南芥中已经克隆鉴定出PLK和PNPO并通过T-DNA插入突变在基因表达水平上研究对其他VB6合成代谢转换酶基因表达的影响,但其还缺乏在不同物种和不同方法上的验证。本实验采用模式植物烟草为材料进行PLK和PNPO相关研究,对植物体内营养素VB6的合成和代谢转换具有参考作用。本研究,利用拟南芥PLK和PNPO cDNA序列在烟草EST库中检索,寻找到预测编码烟草NtPLK和NtPNPO的cDNA序列,在Genbank上的登录号分别为XM_009804516.1和XM_009801441.1。以提取的烟草叶片总RNA反转录得到的cDNA为模板,设计引物对NtPLK和NtPNPO的编码框进行克隆得到预期大小的DNA片段,产物测序结果显示NtPLK的编码框长为1020bp,编码的蛋白含有339个氨基酸,分子量大小为37.4kDa,等电点为6.96。氨基酸序列比对发现相对哺乳动物、昆虫和细菌存在N端延长,酶活性位点处的氨基酸残基和其他物种一样保守。该基因在染色体上跨度1.2kb DNA,含有13个外显子和12个内含子。NtPNPO的编码框长为1620bp,编码的蛋白质含有539个氨基酸,分子量大小为60kDa,等电点为8.03。氨基酸序列比对发现与哺乳动物、昆虫和细菌相比在N端大幅度延长约280个氨基酸残基,该区域主要是YjeF_N功能域,该功能域功能目前尚不清楚。该基因在染色体上跨度0.7kb DNA,含有14个外显子和13个内含子。NtPLK在烟草的叶片中转录表达水平最高,根和茎中转录表达水平较低且比较接近。NtPNPO在烟草的叶片中转录表达水平最高,茎中次之,根中最低。将克隆得到的NtPLK和NtPNPO的编码框序列导入到pET32a_((+))表达载体中在Rosetta大肠杆菌中表达出预期蛋白。NtPLK的粗酶液相对于底物PL,显示的吡哆醛激酶的活性为29.7nmolPLP/mg/min。NtPNPO的粗酶液相对于底物PMP,显示的磷酸吡哆醛氧化酶的活性为21.4nmolPLP/mg/min。酶活证实了我们克隆的序列所编码的蛋白为烟草PLK和PNPO。选取NtPLK的编码框内490bp的特异性的序列和NtPNPO的编码框内497bp的特异性的序列,将其各自的正反向序列分别插入pHANNIBAL中内含子的两端,构建发卡结构的RNAi载体。利用农杆菌EHA105介导侵染烟草叶片,通过qRT-PCR检测显示NtPLK RNAi在烟草叶片中下调NtPLK转录水平表达效果的最佳时间是72h,NtPNPO RNAi在烟草叶片中下调NtPNPO转录水平表达效果的最佳时间是48h。NtPLK RNAi处理后72h,烟草叶片中NtPLK、NtPNPO和NtPDX1转录水平的表达量分别下降了50.9%、51.1%和26.3%,而NtPLR上升了27.7%;NtPNPO RNAi处理后48h,烟草叶片中NtPNPO、NtPLK、NtPLR和NtPDX1转录水平的表达量分别下降了68%、22.1%、29.5%和33.9%。证实了构建的RNAi载体成功的下调了目的基因的表达。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
醇氧化酶论文参考文献
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