生物矿化法固定化酶的研究

论文摘要

在现有的催化类型中,使用酶催化是一种既绿色环保,又方便快捷的方式。然而,造价昂贵、制备工艺复杂、不能循环使用等缺点成为了制约酶在工业生产中的不利因素。因此,通过将酶固定在特定载体上的方式,在保证了酶能够重复利用的同时,又能在一定程度上提高酶的稳定性。而生物矿化（Biomineralization）是一种新兴的大分子固定化方式,与传统的固定化方式不同,生物矿化法通过将蛋白、氨基酸等有机成分与无机盐（磷酸盐等）用共沉淀的方法连接在一起,从而制备出复杂的形状、分层的组织、均匀的颗粒尺寸,并通常具有强度高等显著性能。科学家们通过尝试模仿生物体内结晶过程,结合现代复合材料和控制矿物结晶技术,探索出了以无机盐为骨架,层层堆叠生物大分子的方式,制备出了具有花型结构的纳米颗粒--纳米花（Nano-flower）。本研究主要分为两个部分,第一部分是用磷酸锌（Zn3（PO4）2）作为载体实现脂肪酶（CSL）的固定化,并且详细研究了CSL浓度、制备时间、温度、离子强度及所固定的生物大分子种类对该纳米颗粒形状和大小的影响。确定了制备纳米花的最适条件为:将硫酸锌溶液（80 mg/mL,5 mL）滴加入CSL溶液（0.6 mg/mL,100 mL）中,在室温（约20℃）条件下搅拌1小时,静置温育2小时后,所得到的为最佳状态纳米花。通过EDAX、扫描电镜、透射电镜、傅里叶红外、XRD晶体衍射、元素分析方式对纳米花进行了性质表征,初步确认了我们制备的纳米花中既含有Zn3（PO4）2成分,又含有CSL酰胺键及N元素,证明了CSL确实被固定在了载体上,并且通过计算发现纳米花中的CSL含量约为7.2%。接下来,将制备好的纳米花用于催化熊果苷乙酰化,发现在添加的酶量相同时,纳米花的催化活力（15.9±0.5 U）约为游离酶CSL（3.7±0.2 U）的4.3倍,同时热稳定性也有很大提高。将纳米花重复使用10次后,仍能保持约95%的活力;在储存20天后,保留约92%的活力,可见固定化之后的CSL稳定性很高。在研究了CSL-Zn3（PO4）2纳米花的制备及催化之后,我们不禁想到,如果能找到一种金属依赖性酶,那么将酶与这种金属结合后,在达到常规固定化的效果的同时,又能够极大地提高酶活。因此本次研究的第二部分中,我们选择D-阿洛酮糖-3-差向异构酶（DPEase）作为研究对象。通过将其表达纯化后,DPEase的纯度达到90%以上,分子量约为40 kDa。我们研究了游离DPEase的各种理化性质,发现DPEase是Co2+、Mn2+依赖型酶,在添加100μM的Co2+时酶活达到最大;最适pH为8.0,最适温度为60℃。然而DPEase的热稳定性和pH稳定性较差,为了解决DPEase在加热条件下易失活的问题,我们想到了将其用生物矿化的方法固定在载体上。鉴于DPEase是Co2+依赖型酶,我们使用磷酸钴作为无机载体,既能够实现固定化后提高DPEase的稳定性,又能够通过Co2+对DPEase的激活作用,更进一步提高酶活力。这也是第一次通过生物矿化法实现DPEase在含Co2+的纳米载体上的固定化。通过对制备DPEase-Co3（PO4）2的过程以及相关影响因素的深入研究,我们得出了结论:将2mg DPEase与磷酸盐（pH 7.4,50.0 mM）混合,加入10.0μl CoSO4（1.0 M）,置于4℃条件下搅拌48h,所得沉淀即为最佳状态纳米花。通过对纳米花进行扫描电镜检测、EDAX检测、傅里叶红外检测、元素分析,初步鉴定了纳米花中含有酰胺I和酰胺II带（DPEase）,以及Co、P元素（Co3（PO4）2）;通过计算发现纳米花中固定的DPEase含量约为12%。在酶学研究上,纳米花的催化活力（36.2±0.5 U/mg）约是游离酶（5.0±0.2 U/mg）的7.2倍。对于酶活的显著提高,我们进行了详细分析:由于DPEase是一种严格的Co2+依赖性酶,在纳米花的形成中,Co2+可以结合DPEase的特定功能位点,并通过变构效应（Allosteric Effect）激活DPEase。此外,在固定化过程中,Co2+和DPEase被挤压在有限的空间,Co2+非常靠近DPEase,大多数活性形式的DPEase可以在固定过程中被富集或―锁定‖,从而轻松激活DPEase。这可能是DPEase-Co2+纳米花显著提高酶活性的合理解释。在本次研究中,我们使用了生物矿化方法,成功地制备出CSL-Zn3（PO4）2与DPEase-Co3（PO4）2纳米花。该新方法将载体的制备和酶的固定化完美结合,大大简化了固定化过程。此外,这种生物矿化方法可以在固定过程中显著提高酶活及酶的稳定性,这表明这种新的生物矿化方法对于酶（尤其是自身能够被某种金属离子激活的酶）的固定化,有着很深远的意义。

论文目录

中文摘要

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第1章绪论

1.1 酶的研究与应用

1.2 固定化酶

1.2.1 概述

1.2.2 固定化酶的常用方法

1.3 生物矿化

1.3.1 概述

1.3.2 生物矿化机制

1.4 纳米结构的制备

1.4.1 概述

1.4.2 纳米级固定化酶的优点

1.5 本论文的研究目的和意义

3（PO₄）₂纳米花的制备与应用'>第2章 CSL-Zn₃（PO₄）₂纳米花的制备与应用

2.1 脂肪酶CSL概述

2.2 纳米材料固定化酶

2.3 熊果苷乙酰化

2.3.1 熊果苷概述

2.3.2 熊果苷乙酰化

2.4 仪器与材料

2.4.1 主要仪器

2.4.2 化学试剂

2.4.3 主要实验试剂

2.5 实验方法

2.5.1 固定化方法优化

2.5.2 使用最佳条件制备纳米花

2.5.3 纳米花的性质表征

2.5.4 催化反应

3（PO₄）₂酶学性质研究'> 2.5.5 CSL-Zn₃（PO₄）₂酶学性质研究

2.6 实验结果与讨论

2.6.1 纳米花制备条件优化

2.6.2 最佳形态纳米化表征

2.6.3 催化活力性质研究

2.7 小结

第3章 D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的研究

3.1 D-阿洛酮糖概述

3.2 DTEase

3.3 DPEase

3.3.1 概述

3.3.2 晶体结构

3.4 实验材料

3.4.1 菌种及质粒

3.4.2 主要实验试剂

3.5 实验方法

3.5.1 制备E.coli BL21（DE3）感受态细胞

3.5.2 热击转化pET-22b（+）质粒

3.5.3 蛋白表达

3.5.4 蛋白纯化

3.5.5 镍柱再生

3.5.6 除盐

3.5.7 检测蛋白浓度

3.5.8 SDS-PAGE

3.5.9 D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶活的检测

3.5.10 DPEase性质研究

3.6 实验结果与讨论

3.6.1 蛋白表达与纯化

3.6.2 HPLC法确定产物

3.7 DPEase的性质研究

3.7.1 金属离子对酶活的影响

3.7.2 最适钴离子浓度

3.7.3 最适pH

3.7.4 pH稳定性

3.7.5 最适温度

3.7.6 热稳定性

3.7.7 储存稳定性

3.8 小结

第4章固定化DPEase的研究

4.1 概述

4.2 变构效应

4.3 实验方法

4.3.1 固定化方法优化

4.3.2 使用最佳条件制备纳米花

4.3.3 纳米花的性质表征

4.3.4 催化性质

4.3.5 酶学性质表征

4.4 实验结果

4.4.1 纳米化制备条件优化

4.4.2 最佳形态纳米花表征

4.4.3 纳米化形成机制分析

4.4.4 酶学性质研究

4.5 小结

第5章工作总结和展望

5.1 工作总结

5.2 工作展望

参考文献

作者简介及在学期间所取得的科研成果

致谢

文章来源

类型: 博士论文

作者: 郑璐

导师: 王智

关键词: 生物矿化,固定化,纳米花,变构效应,稳定性

来源: 吉林大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 吉林大学

分类号: Q814.2

总页数: 112

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