冯翠莲[1]2004年在《转基因烟草的遗传稳定性分析及其抗逆性测定》文中指出海藻糖(trehalose)是由两个分子的葡萄糖以1，1糖苷键连接而成的非还原性双糖。由于它能有效地保护细胞膜和蛋白质的结构，使生物体在许多异常情况下，如高温、脱水(干旱、高渗透压)、高Ph值时仍保持细胞内湿润，防止细胞因失水而造成细胞内养分的损失的细胞的损伤，从而使生物体具有较强的抗旱、耐盐碱、抗冷、抗热的能力。通过基因工程技术把海藻糖合酶基因导入作物并使其在作物中表达，能有效地提高作物的抗逆性。 本课题以已获得的两株转灰树花海藻糖合酶(Tsase)基因的烟草及其后代为材料，通过分别对这两株转基因烟草各后代进行分子检测(PCR扩增、Southern blot)、抗逆性鉴定并结合其形态结构变化，以分析外源基因在转基因烟草中遗传稳定性和抗逆性。结果表明：海藻糖合酶基因能在转基因植株的后代中稳定地遗传；转基因植株在形态结构方面发生了明显的改变，但在T_1代有部分植株能回复到正常的表型，而且仍然能合成和积累海藻糖；转基因植株的后代的抗旱性和耐盐性均得到了不同程度的提高。这为利用该基因进行植物的抗逆性改良提供了直接的实验依据。
黄诚梅[2]2007年在《甘蔗脯氨酸积累与△~1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（ScP5CS）基因克隆及转化研究》文中提出甘蔗是我国重要的糖料和能源作物，主要分布在广西、广东、云南、海南等南方黄、红壤地区，而且90％以上的种植面积为缺乏灌溉的旱坡地，季节性干旱是限制我国甘蔗生产的首要环境因素。在广西各大植蔗区，大部分植蔗区基本上都没有灌溉条件，而且由于坡地保水能力差，不能充分利用自然降水，每年都出现不同程度的旱害，特别是春、秋旱，这是制约甘蔗获得高产高糖的最主要因素。脯氨酸是目前所知生物界分布最广的渗透保护物质之一，干旱、高盐、高低温及重金属等非生物胁迫都会导致细菌、动物、植物、藻类中脯氨酸大量累积。弄清甘蔗植株体内脯氨酸在胁迫诱导之下的生物合成与代谢变化，以及介入脯氨酸代谢的基因调控，了解其对提高甘蔗耐逆性的调控分子机制，将有助于利用脯氨酸基因工程改良甘蔗抗逆性。本研究以甘蔗(Saccharum officinarum L．)品种：桂糖21号(GT21)，新台糖16号(ROC16)和新台糖22号(ROC22)等3个品种为材料，用聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)6000处理模拟水分胁迫条件，探讨其对甘蔗生长前期与伸长期间叶中脯氨酸积累及其代谢相关酶活性的影响，以阐明脯氨酸代谢与甘蔗耐水分胁迫能力之间的关系。同时，通过PEG6000进行模拟水分胁迫诱导甘蔗△~1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(Saccharum officinarum L．△~-1-pyrroline-5-carboxylate synthetase，ScP5CS)基因的表达，采用同源克隆方法从甘蔗中克隆出ScP5CS基因，并对该基因核苷酸与推断的氨基酸序列进行了结构分析。为了进一步验证甘蔗ScP5CS基因的功能，通过构建ScP5CS基因植物反义表达载体遗传转化烟草，分析该基因在转基因烟草植株中的表达及其抗渗透胁迫功能，以初步探讨该基因的功能。主要研究结果如下：1．在甘蔗生长前期，经胁迫处理，对于游离脯氨酸的变化，ROC16在处理后第1 d其含量就明显上升，GT21在处理2 d后也开始上升，而ROC22在处理后12 d内其含量仍增加不明显。P5CS酶活性经胁迫处理都较之未处理的表现活跃，GT21与ROC16在胁迫处理后其酶活性表现上升趋势，而ROC22变化不明显。鸟氨酸转氨酶(ornithine-δ-aminotransferase，δ-OAT)酶活性变化不明显。对于脯氨酸脱氢酶(proline dehydrogenase，ProDH)酶活性，GT21与ROC16在处理1 d后稍有上升但在7 d后都有下降，而ROC22在第7 d其酶活性就开始提高。2．在甘蔗伸长期，PEG处理后第4 d，GT21与ROC16叶中游离脯氨酸含量明显上升，但ROC22在处理后6 d内其含量增加仍不明显。P5CS酶活性变化因品种而异，ROC22在处理后第6 d才明显上升，其他2个品种则在胁迫处理1 d后即明显提高。δ-OAT酶活性变化不明显。ROC22在处理1 d后其ProDH酶活性稍有提高，而其他2个品种则下降。3．通过探讨PEG胁迫处理下甘蔗生长前期与伸长期间叶中脯氨酸积累及其代谢相关酶活性的变化，表明了在渗透胁迫下，甘蔗叶中游离脯氨酸大量积累，其生物合成中谷氨酸→脯氨酸途径比精氨酸→鸟氨酸→脯氨酸途径更占优势地位。脯氨酸降解受抑制和其合成对脯氨酸积累有同等意义。4．P5CS是脯氨酸生物合成中谷氨酸途径的限速酶，本研究以甘蔗品种ROC22为材料，采用同源克隆方法从基因组DNA中获得两条特异扩增带，初步确定为甘蔗ScP5CS基因组片段，其中ScPS_1片段长度为2016 bp，包含有7个内含子，8个外显子，其中仅有977 bp的外显子编码序列，GenBank注册号为EF620362；将外显子序列与ScP5CS mRNA(EU005373)相比，同源率达到99．6％。而ScPS_2片段大小与ScPS_1外显子序列一样，长度为977 bp，同源率达到99．6％，但缺失了内含子，与ScP5CS mRNA(EU005373)相比，同源率也达到99．6％，这表明了ScPS_2具有大多数返座假基因鲜明的特征：完全缺失存在于功能基因中的间隔序列，即内含子序列。因此，初步推测基因片段ScPS_2为返座假基因序列。5．采用同源克隆与RT-PCR法从甘蔗品种ROC22中得到甘蔗ScP5CS基因的编码区cDNA序列，其长度为2151 bp，为一个完整的ORF，编码716个氨基酸，GenBank注册号为EU005373。核苷酸序列与前人已注册的甘蔗P5CS(EF155655)相比，同源率达到98％，但推断编码的氨基酸同源率仅为92％。该基因具有P5CS共有的结构域与结合位点：Putative ATP-bindingsite；Putative leucine domains；Glu-5-kinase domain；Putative NADPH-bindingdomain；Conserved GSA-DH domain保守区，脯氨酸反馈抑制作用位点。与前人已注册的甘蔗P5CS基因氨基酸序列(ABM30223)比较，在γ-GK保守域(Glu-5-kinase domain)内氨基酸变化较大，而与水稻、小麦的相比，其变化较小。因此，推断为甘蔗P5CS基因家族中的一个新成员。6．用长度分别为384 bp(位置为1318～1701 bp)和954 bp(位置为1163～2166 bp)，包含在甘蔗ScP5CS基因的γ-谷氨酰磷酸还原酶(Gamma-glutamyl phosphate reductase，γ-GPR)区域内的两个甘蔗ScP5CS基因片段反向插入植物表达载体pBI121的克隆位点上，由CaMV35S启动子控制两个基因片段的表达，构建了植物表达载体pBI121／Sc-PCS_1与pBI121／Sc-PCS_2。用甘蔗ScP5CS基因反义植物表达载体遗传转化烟草。甘蔗ScP5CS基因在烟草中的反义表达，部分抑制了烟草P5CS基因的活力。对转基因烟草植株进行NaCl与PEG6000胁迫培养，发现转入ScP5CS反义基因片段的烟草植株矮小，叶片容易发黄，根系发育迟缓，根长缩短，而且转入短片段Sc-PCS_1(384 bp)与长片段Sc-PCS_2(954bp)的转基因植株生长受到抑制效果一样；而转入空载体pBI121的烟草和对照烟草植株一样，叶色和叶片的主脉均较绿，新叶长出正常，发根相对早，根长稍长。
张来军[3]2011年在《转褪黑素合成酶基因林烟草的产生及其抗逆性和外源褪黑素对离体植物生长的影响》文中研究说明褪黑素(N-acetyl-5-methoxytryptamine;Melatonin;MEL)是由松果腺合成的一种广泛存在于动物界的激素,具有调节昼夜节律,促进睡眠,抗氧化、清除自由基等作用。自从1995年首次发现褪黑素存在于植物中后,褪黑素在植物中是否普遍存在及其在植物中的功能引起了广泛关注。相关的报道主要着眼于测定植物及植物不同器官中褪黑素的含量及其变化。已经发现在所检测的100多种植物中普遍含有不同水平的褪黑素。近年来植物褪黑素的功能研究,多着重于研究外源褪黑素对植物生长、形态发生以及对某些环境胁迫的影响。这些研究对于阐明植物褪黑素的功能还是初步的。通过褪黑素合成酶基因转化,有可能提高植物内源褪黑素含量。进而与野生型作比较,有可能进一步研究植物褪黑素的功能。同时,利用离体培养体系研究外源褪黑素对植物生长影响和对胁迫环境的抗性将为阐明褪黑素生理功能提供更多的科学证据。本研究通过农杆菌介导的转化技术,将褪黑素生物合成途径中的两个关键酶芳烷基胺N-乙酰转移酶(Arylalkylamine N-acetyltransferase, AANAT)与羟基吲哚O-甲基转移酶(Hydroxyindole O-methyltransferase, HIOMT)基因,导入林烟草(Nicotiana sylvestris),获得了转基因植株,测定了转基因植物中褪黑素含量,以及UV-B辐射对转基因植物的影响。并研究了外源褪黑素对几种药用植物生长和对盐胁迫及UV-B辐射的影响。所取得的主要研究结果如下：1.以林烟草叶片为材料,通过农杆菌介导法,将褪黑素生物合成酶AANAT与HIOMT基因转入林烟草,获得了转基因再生植株。经PCR、RT-PCR、real-time PCR和1FISH鉴定,证明AANAT和HIOMT基因已经整合到林烟草植物基因组中,并在转录水平上表达。农杆菌浸染浓度、时间对转化频率有明显影响。农杆菌菌液在OD600=0.5条件下对预培养2-3d的外植体感染10-15min,而后在附加120mg/L的庆大霉素(gen)MS选择培养基上培养,获得了林烟草阳性转基因再生植株。2.通过RP-HPLC法测定转基因林烟草不同株系及其亲本(未转基因株系)的褪黑素含量,发现pYXU55质粒(含gen抗性标记和AANAT-HIOMT基因)的转基因株系的褪黑素含量均高于pZP122质粒(仅含庆大霉素抗性标记,不含AANAT-HIOMT基因的空白质粒)的转基因株系和对照株系。在提取植物褪黑素过程中,用固相萃取(Solid Phase Extraction, SPE)小杞对样品进行了纯化和富集,有效避免了分离差、峰形不良等现象,使样品得到了较好的色谱分离效果。3.对彗星电泳方法进行了优化,简化了传统的“叁明治”胶版制备方法。将“扩展片”引用于胶版制备中,使用“扩展片”将细胞和低熔点胶混合液扩展开,使每张载玻片上的样品数由以前的1个增加至5-7个,铺胶速度快,不脱胶,胶层薄,提高了实验效率用改良后的彗星电泳程序分析比较了转基因林烟草及对照植株叶肉原生质体对UV-B辐射损伤的效应,发现0.5 W·m-a辐射强度下,在0s-10s的时间内,代表DNA损伤程度的TailDNA%值在转基因植株中总是低于相同辐射剂量下的非转基因对照株,且转基因林烟草原生质体所耐受的UV-B辐射剂量最高达到30s,而非转基因林烟草所能耐受的辐射剂量为10s。反映出AANAT-HIOMT基因在转基因株系中的表达减缓了细胞对UV-B辐射引起的DNA损伤。4.比较了盐(NaCl浓度为0、50、100、200mM)胁迫条件下转基因和野生型林烟草悬浮培养细胞成活和死亡率,证明转基因系细胞显示较高的耐盐性。100mM的NaCl溶液使两种类型细胞的凋亡率均达到最高值,野生型(对照组)悬浮细胞的凋亡率为87.5%,转基因林烟草细胞凋亡率为63.3%,而所有盐浓度下的转基因细胞的死亡率总是低于对照。5.研究了外源褪黑素对离体培养的几种药用植物生长和抗逆境胁迫的影响。(1)以浓度为0,3μM,6μM,12μM和24μM的褪黑素处理离体培养的虎杖(Polygonum cuspidatum)茎段,发现培养基中添加低浓度的褪黑素(3μM,6μM)对虎杖茎段生根和苗的生长有明显的促进作用,浓度为6μmM时,促进虎杖生长的效果最为显着,苗高达到(7.63±1.45)cm,叶面积为(31.8±6.55)cm2,平均根数为(2.44±1.42)个,根长度为(2.79±1.20)cm。而对照组的苗高为(4.07±2.19)cm,叶面积为(18.99±6.88)cm2,平均根数为(1.67±1.53)个,根长度为(2.66±1.58)cm。然而高浓度(24μM)则对苗的生长有抑制作用。褪黑素的促进生长作用类似于IAA。(2)培养基中添加外源褪黑素对滇黄芩(Scutellaria amoena)愈伤组织生长有明显影响。培养基上附加的褪黑素浓度为0时,愈伤组织增长率为84%,不定芽分化率为5.63%,低浓度的褪黑素(0.1μM,1.0μM,10.0μM)促进愈伤组织的增殖和不定芽分化,附加0.1gM褪黑素时,愈伤组织的增长率最高,达到171%。1.0μM的褪黑素作用下得到最高分化率,为30.4%。而高浓度(100.0μM)时,则对愈伤组织的增殖和不定芽分化有抑制作用。(3)应用彗星电泳技术研究了外源褪黑素对大叶秦艽(Gentiana macrophylla)愈伤组织原生质体在UV-B辐射下DNA损伤的影响。UV-B辐射强度为0.5 W·m-2时,在0s-30s的时间范围内,代表DNA损伤程度的TailDNA%值在褪黑素处理的组中总是低于相同辐射剂量下的对照组。而且对同一剂量(40s)UV-B辐射后的培养不同时间的原生质体测定发现,外源褪黑素处理组TailDNA%值低于相同培养时间下未用褪黑素处理的组,表明外源褪黑素提高了UV-B辐射引起的细胞DNA损伤修复能力,降低DNA损伤的程度。这种修复效应与外源褪黑素浓度密切相关,高浓度褪黑素(10.0μM)明显优于低浓度褪黑(1.0μM)
王丹[4]2011年在《农杆菌介导小麦锌转运蛋白基因转化烟草及其抗逆性研究》文中指出锌是一种重要的生命元素，生命过程中的每个重要阶段都可发现锌的作用。研究发现，细胞锌转运途径主要由锌铁调控转运体ZIP和助阳离子扩散体CDF两大锌转运体家族来完成。植物体中锌的吸收、胞外到胞内的转运以及细胞内锌的转移，ZIP转运体起着重要的作用。有研究报道已经在拟南芥、小麦、西红柿、大豆、水稻等多种植物中鉴定出ZIP转运体家族成员。其中对小麦中锌转运相关基因的研究主要集中在基因克隆和表达特性上，但它们的转基因研究还未见报道。所以，本试验将已克隆到的一个小麦锌转运蛋白（以下简称ZIP）基因转化到烟草中，研究小麦ZIP基因在烟草中的作用，为全面的理解小麦ZIP基因在转基因应用中的功能、培育多抗性的作物品种提供科学依据。本文根据GenBank上已提交的序列（AY864924）设计引物，克隆到小麦ZIP基因片段长度为1083bp，并构建了烟草表达质粒载体，将其转入农杆菌C58C1中。以烟草叶片为外植体，通过农杆菌的介导将小麦ZIP基因导入烟草中，经过组织培养，获得了转基因植株。通过对转基因植株进行RT-PCR检测和GUS组织化学染色检测，证明小麦锌转运蛋白基因已导入烟草中。通过对烟草的干旱胁迫、高盐胁迫和铜胁迫试验，测定胁迫后的相对含水量、脯氨酸含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、保护酶类活力和丙二醛含量6种生理生化指标。结果表明，转基因组烟草对干旱的耐受程度和对高盐环境的抵御能力较强于对照组烟草，铜对转基因烟草产生的毒害较对照组烟草低。
殷东旭[5]2009年在《SsNHXI和PDH45基因在苜蓿中的表达及耐盐性研究》文中研究表明紫花苜蓿是世界上非常重要的牧草之一。由于近年来土壤盐渍化程度的加重,使苜蓿大幅减产,培育高耐盐性苜蓿新品种就显得至关重要。目前利用转基因技术能够快速有效的获得抗盐苜蓿新品种。SsNHXI基因是来源于盐地碱蓬的一个编码Na+/H+逆向转运蛋白的基因,其可将Na+区隔到液泡中,从而提高植物的耐盐性。近几年研究还发现,解旋酶在植物抗逆性方面也起着至关重要的作用。PDH45是来源于豌豆的一种DNA解旋酶,该基因转化烟草后可大幅提高其抗盐能力。本论文对实验室已构建的质粒pBISsNHXI和pBIDH45进行重组,构建了同时含有SsNHXI和PDH45基因的植物双元表达载体,利用根癌农杆菌介导法将其双元载体转入紫花苜蓿中,以期获得耐盐性好的苜蓿材料。通过卡那霉素初步筛选得到80株抗性植株,PCR技术显示目的基因已经整合到紫花苜蓿基因组中。选择其中20株转基因材料进行耐盐生理功能检测,用250mM NaCl同时处理非转基因型和转基因型植株5周,结果表明,尽管盐胁迫下转基因植株与非转基因植株的生长均受抑制,但转基因植株的生长状况明显好于非转基因型植株。与此同时,转基因植株的脯氨酸含量约是非转基因型植株的20倍,其叶绿素含量约高于非转基因型植株40%,且其细胞膜损伤程度低于非转基因型植株90%。这些实验结果表明过量表达SsNHXI与PDH45基因确实显着提高了紫花苜蓿的耐盐性。本研究为通过转基因技术培育紫花苜蓿耐盐新品种提供了新的材料基础。
王雷[6]2007年在《转玉米ZmPIS基因棉花获得及其抗逆性的初步研究》文中研究说明磷脂酰肌醇(PI)是真核细胞中主要的磷脂成分，磷脂酰肌醇途径(PI pathway)在植物生长、发育和感受刺激并对之应答的过程中发挥重要的作用。磷脂酰肌醇合成酶(PIS)是磷脂酰肌醇合成途径中的关键酶，它的功能是催化myo-肌醇和CDP-DG反应产生磷脂酰肌醇。ZmPIS基因是从玉米克隆而来的，其编码产物磷脂酰肌醇合成酶的基本功能是催化myo-肌醇和CDP-DG反应产生磷脂酰肌醇，磷脂酰肌醇在通过后续酶的作用下形成多种信号因子，它们与逆境胁迫下的信号传导有关，可提高植株在逆境条件下的抗性。作为重要的经济作物，棉花转基因工作在抗虫、抗除草剂、抗病、品质改良等方面已取得到了积极进展，但有关棉花耐盐抗旱的转基因研究工作不多，因此有必要加强利用基因工程方法培育耐盐抗旱棉花新种质的工作。本研究以棉花黄化小苗裸露茎尖为受体，通过农杆菌介导的方法，将来自玉米的磷脂酰肌醇合成酶ZmPIS基因(正义和反义)导入鲁棉研19、鲁棉研21，以期培育出抗逆性提高的棉花育种新材料。本研究取得的主要实验结果如下：(1)以鲁棉研19、鲁棉研21的黄化小苗裸露茎尖为受体，通过农杆菌介导的茎尖遗传转化法进行转化，将肌醇磷脂信号传导途径中的关键酶基因、来自玉米的磷脂酰肌醇合成酶ZmPIS基因(ZmPIS(+)、ZmPIS(-))转化到棉花植株中。Southern杂交结果表明ZmPIS基因已经整合到棉花基因组中，获得了转ZmPIS基因棉花。(2)对已获得的转ZmPIS基因的棉花株系进行了耐旱性分析。以鲁棉研19的四个T_1代转基因株系(3个转ZmPIS(+)基因株系、1个转ZmPIS(-)基因株系)和未转基因的鲁棉研19为材料，在苗期利用8％(w／v)的PEG-6000进行渗透胁迫处理，在处理0、2、4、6天时测定生理生化指标的变化。通过分析转基因材料的叶片相对含水量、细胞膜损伤、叶绿素含量、丙二醛含量、脯氨酸含量、可溶性糖含量、光合速率、蒸腾速率、气孔导度等指标，可以看出转ZmPIS(+)基因株系各指标总体上优于未转基因株系和转ZmPIS(-)基因株系，其中转ZmPIS(+)基因株系3(L3)抵抗渗透胁迫的能力较强；转ZmPIS(-)基因株系与未转基因株系间差异不显着。结果表明转ZmPIS(+)基因株比未转基因的鲁棉研19具有更好的抵抗渗透胁迫的能力。本工作把来自玉米的肌醇磷脂信号传导途径中的关键酶ZmPIS用农杆菌介导法导入优良的抗虫棉鲁棉研19、鲁棉研21中，得到了转基因株系，对鲁棉研19的转基因T1代的4个株系在PEG渗透胁迫下生理生化指标的检测分析表明，转ZmPIS(+)株系抗渗透胁迫能力得以提高。本工作为研究PIS在逆境信号转导中的作用提供了材料，也为棉花的耐盐抗旱育种提供了新的种质资源。
张毅[7]2009年在《转NtAOX1a基因烟草的获得及其抗逆性分析》文中进行了进一步梳理高等植物线粒体电子传递链主要有两条,一条是对氰化物敏感的细胞色素途径,另一条是抗氰化物的交替氧化途径,后者由位于线粒体内膜上的交替氧化酶(alternative oxidase, AOX)所催化。AOX由一个小的核基因家族所编码。AOX基因和AOX蛋白的表达受到多种生物和非生物胁迫的诱导。研究表明,AOX在维持各种条件下植物体内的动态平衡以及保护植物免受活性氧(ROS)的伤害中起到非常重要的作用。AOX能对低温做出响应,而且参与植物的抗病毒过程。但是,AOX是否会影响低温和病毒侵染时的ROS积累,以及AOX是否还有别的生物学功能仍然知之甚少。本研究从叁生烟草中克隆了交替氧化酶基因(NtAOX1a),构建含NtAOX1a基因的2种植物表达载体,通过农杆菌介导转化叁生烟草,获得了含不同NtAOX1a表达水平的转基因植株,并对这些转基因株系的T3代植株进行了生物学功能分析。具体结果如下:1、根据已报道的AOX1基因核苷酸序列,设计特异引物,采用RT-PCR的方法,从叁生烟草中克隆了交替氧化酶基因(NtAOX1a),cDNA全长为1071bp。2、构建2种植物表达载体,即含正义NtAOX1a的载体pBI-S- NtAOX1a,含反义NtAOX1a的载体pBI-AS-NtAOX1a。通过农杆菌介导将2种载体分别转化叁生烟草,同时转化pBI121空载体作为对照,从而获得3种不同基因型的转基因叁生烟草植株。3、对不同基因型转基因烟草当代(T_0代)所结的种子,经卡那霉素筛选,并结合转基因株系的T_1代植株PCR鉴定结果,初步证明在被检验的转基因株系中,转基因在T_1代中的遗传基本符合3:1的分离规律。4、筛选符合3:1分离规律的T_1代植株,分别进行Northern杂交和Western杂交分析,表明在T_1代转基因烟草中,NtAOX1a已经成功表达。5、在T_1代转基因烟草中选出有代表性的株系繁殖至T_3代,Northern杂交和Western杂交分析验证NtAOX1a在T_3代株系中稳定表达;然后对T_3代植株进行呼吸测定,结果表明AOX途径呼吸速率随NtAOX1a表达水平的改变而改变。6、在分子鉴定的基础上,对T_3代转基因植株进行了生物学功能分析。低温胁迫下,转正义NtAOX1a的株系清除过氧化氢(H_2O_2)的能力较野生型显着提高,受到ROS的伤害也较小;接种烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)后,与野生型相比,转反义NtAOX1a的株系具有明显的抗病性,而且AOX在抗病中的功能似乎与其对H_2O_2的清除作用有关;种子萌发实验表明,当细胞色素途径被抑制后,AOX过量表达能够显着提高种子对H_2O_2的抗性,表明AOX在植物的早期发育阶段也起到一定作用。
张蜜[8]2014年在《脯氨酸代谢在甘菊和切花菊抵御非生物胁迫中的作用机制》文中指出作为高等植物体内一种广泛存在的渗透调节物质,脯氨酸代谢在植物响应逆境胁迫及生长发育过程中发挥多种保护功能。为了更好地利用脯氨酸代谢调控机制进行菊花(Chrysanthemum×morifolium Ramat.)的抗逆性改良,本研究利用比较基因组学的方法,对抗逆性强的菊属近缘野生种—甘菊[Chrysanthemum lavandulifolium (Fisch. ex Trautv.) Makino]和耐盐性不同的切花菊品种—‘雪山’(C.×morifolium 'Xueshan')、‘粉贵人’(C.×morifolium 'Fenguiren')和‘神马’(C.×morifolium 'Jinba')的游离脯氨酸积累特点、脯氨酸代谢相关基因表达模式及关键基因的功能进行研究,以期为脯氨酸代谢在菊花响应逆境胁迫及生长发育中的价值予以更清晰的评价,为菊花抗逆性研究和分子育种奠定基础,同时也为高等植物脯氨酸代谢调控机制的研究提供新的证据。本研究得到的主要结果如下：(1)对甘菊在非胁迫及干旱、盐、冷、热胁迫下中部叶片中游离脯氨酸含量的测定发现,甘菊中部叶片中游离脯氨酸含量在胁迫后期(冷胁迫除外)急剧增加。对甘菊不同器官中游离脯氨酸含量的测定发现,非胁迫下,甘菊花蕾和花序中游离脯氨酸含量最高；不同胁迫条件下,游离脯氨酸在最易受到胁迫伤害的器官中增加最为明显,且含量较高。(2)比较分析不同程度盐胁迫下切花菊品种—‘雪山’、‘粉贵人’和‘神马’不同器官中的游离脯氨酸水平发现,叁者游离脯氨酸含量的变化特点存在明显差异：耐盐性强的切花菊‘神马’和‘粉贵人’能够在盐胁迫后期有效积累脯氨酸。盐胁迫后期3个切花菊品种中部叶片中的游离脯氨酸含量显着低于甘菊中部叶片中的游离脯氨酸含量。与甘菊中相同,盐胁迫下3个切花菊品种根和茎中的游离脯氨酸显着增加,且明显高于叶片中的游离脯氨酸含量。(3)利用课题组前期已建立的甘菊转录组数据库,从甘菊中分离到了2个脯氨酸合成酶基因(CIP5CS1和CIP5CS2)、1个脯氨酸降解酶基因(CIPDH)和4个脯氨酸转运体基因(ClProT1-4)。两个同源的ClP5CS呈组成型高丰度表达；CIPDH仅在花序中高丰度表达,其在多种胁迫条件下甘菊叶片中的表达(热胁迫除外)被抑制；4个同源的ProT的表达呈现一定的器官特异性和差异性。其中,ClProT2仅在地上部器官中表达,尤其在花序中表达丰度最高,并能够明显地被不同胁迫诱导表达。这些基因的表达模式与甘菊游离脯氨酸的积累特点是一致的。(4)利用同源克隆的方法,分别在3个切花菊品种中分离到了ClP5CS1、 clP5Cs2、ClPDH、ClProT2和ClPmT3的同源基因。盐胁迫下,游离脯氨酸积累水平较高的切花菊‘雪山’中脯氨酸合成和转运相关基因的表达水平也较高。(5)在野生型拟南芥中分别异源表达ClP5cS1、ClP5CS2和ClProT2的研究表明,甘菊中两个P5CS同源基因的功能不是冗余的,clP5CS1在提高抗逆性中作用明显,ClP5CS2在促进开花中发挥关键作用,各转基因株系的抗氧化能力增加。ClProT2启动子的表达分析结果表明其特异性地在成花转变中发挥作用。综合分析上述结果,本研究得到如下结论：甘菊和不同切花菊品种在遇到非生物胁迫时其体内均大量积累游离脯氨酸,游离脯氨酸积累水平的差异主要是由脯氨酸代谢合成和转运基因在转录水平上的差异引起的；脯氨酸转运体在甘菊脯氨酸积累及响应胁迫过程中发挥了重要作用；甘菊脯氨酸代谢还有可能和其开花和花发育过程密切相关。因此,脯氨酸代谢在甘菊和切花菊响应和抵御非生物胁迫中发挥了积极的作用。
司丛丛[9]2010年在《普通烟草K~+通道NKT5的克隆、序列分析及转基因载体的构建》文中认为钾素对烟草的产量和品质有着重要的作用。提高烟草中的钾含量能提高烟草的抗逆能力。K+通道是烟草吸收K+的主要途径。本文采用RACE的方法从普通烟草中克隆得到K+通道基因NKT5,对NKT5进行序列分析和生物信息学分析;并构建了NKT5的转基因载体,为后续研究提供技术支持和理论基础。本研究运用已经获得的1条490bp的普通烟草K+通道基因的中间片段来设计特异性引物,应用RACE方法获得3’末端和5’末端cDNA序列。通过叁段cDNA序列拼接结合及全长克隆测序验证,获得一个未报道的普通烟草K+通道基因,并将其命名为NKT5(NCBI登录号为HM010922)。NKT5的cDNA全长为2365bp,其中5’非编码区190bp、3’非编码区249bp、编码区1926bp,编码641AA。通过NKT5的结构保守域、蛋白跨膜区及蛋白质空间结构的分析,得出关于K+通道基因NKT5的相关生物信息学的分析;并构建了烟草、拟南芥及相关植物K+通道的系统进化树。对该基因进行了序列分析及功能预测,为进一步阐明烟草K+通道基因NKT5在烟草吸钾、抗逆过程中的分子机制,以及研究烟草K+通道基因的功能表达等奠定基础。以K+通道基因NKT5的核苷酸序列为模板,设计带有酶切位点的特异性引物,通过RT-PCR的方法,从普通烟草中克隆到全长的NKT5基因,测序分析与已经报道的NKT5基因序列一致。然后将其构建到经过酶切处理后的植物表达载体pCAMBIA1300、pCAMBIA1302上,经过连接转化、PCR及酶切鉴定表明转基因表达载体构建成功,接下来可以转化到农杆菌中,用于后续的转基因的试验,来进一步揭示烟草K+的吸收特性和抗逆机制。
吴炼[10]2015年在《聚合MtDREB1C和RcXET基因转化月季及其抗逆性研究》文中提出月季是世界叁大切花花卉之一,我国是世界上月季切花栽培面积和产量的大国,月季作为绿化苗木的应用也较广泛。然而受非生物逆境胁迫,如干旱、盐碱、低温和高温等问题影响,月季的产量和推广受到一定的限制。我们迫切需要选育新的月季品种满足市场和消费者的需求。但经过长期的杂交选育,许多现代月季品种已失去了浓郁的香味,综合抗逆性大大降。20世纪90年代发展起来的转基因技术在其它作物的应用成功,无疑为月季育种提供了一条新途径。而建立再生体系和遗传转化体系是对植物进行转基因操作的重要前提条件,长期以来月季的低转化率一直是制约其基因功能研究的主要障碍。我们以‘月月红’月季为试验材料,通过改良光照和培养基,大大的提高了月季的体胚发生和再生转化率：构建MtDREB1C和RcXET基因聚合表达载体并遗传转化月季,大大的提高了转基因植株的耐逆性,并克服了由于抗逆基因表达导致植株矮小的问题。主要的研究结果如下：1)优化了‘月月红’月季幼茎腋芽微繁体系,采用幼叶、幼茎诱导愈伤,发现了适宜月季幼叶愈伤诱导培养基为SH+3%糖+2,4-D3.0 mg.L-1+TDZO.5 mg·L-1,且在暗中诱导,单独使用2,4-D2.0 mg·L-1,2,4-D 3.0 mg·L-1可以100%得到愈伤组织,幼茎适合诱导愈伤组织的培养基为SH+2,4-D 3.0 mg·L-1,诱导率达到83.21%筛选出‘月月红’月季愈伤组织分化不定芽最佳培养基。叶片愈伤组织分化培养基为MS+TDZ1.0 mg·L-1+6-BA1.0 mg·L-1愈伤组织可以直接分化出不定芽,分化率达到5.0%;2)研究了光和植物生长调节剂对‘月月红’月季体细胞胚发生的影响,红光条件下诱导培育下产生了大量的带有膨大子叶的双子叶型体胚和单子叶型体胚,黑暗条件下则诱导出大量的无子叶的体胚；2.5mg.L-1浓度ABA培养基对于双子叶型体细胞胚增殖和萌发的提高是最有效的,随着ABA(从0-5.0 mg·L-1)的浓度的升高,异常的多子叶体细胞胚产生比例也在升高；双子叶型体细胞胚获得的再生植株的比例最高,达到了41.8%；TDZ、2,4-D在月季体胚诱导中起到决定性的作用,红光对体胚子叶形态的形成有积极作用,ABA对体胚子叶的数目有影响；3)设计合适的引物,采用长引物PCR法快速构建基因聚合表达载体,构建了MtDREBlC和RcXET基因聚合表达载体,将两个基因聚合构建到同一表达载体中,它是一种不依赖酶切连接的基因剪切和连接方法,大大提高了基因聚合的转化效率和连接效率。4)同时将聚合基因通过农杆菌介导法转化到植株上胚性愈伤组织再分化成苗；获得了10株抗性月季再生植株,经PCR检测,Southern检测5株为阳性转化植株,其中2株是多拷贝。MtDREB1C和RcXET基因聚合表达能同时增强转基因月季的耐非生物逆境能力和生长势,可以克服因为MtDREB1C基因过量表达而导致植株矮小的问题。
参考文献：
[1]. 转基因烟草的遗传稳定性分析及其抗逆性测定[D]. 冯翠莲. 华南热带农业大学. 2004
[2]. 甘蔗脯氨酸积累与△~1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（ScP5CS）基因克隆及转化研究[D]. 黄诚梅. 广西大学. 2007
[3]. 转褪黑素合成酶基因林烟草的产生及其抗逆性和外源褪黑素对离体植物生长的影响[D]. 张来军. 西北大学. 2011
[4]. 农杆菌介导小麦锌转运蛋白基因转化烟草及其抗逆性研究[D]. 王丹. 河南工业大学. 2011
[5]. SsNHXI和PDH45基因在苜蓿中的表达及耐盐性研究[D]. 殷东旭. 东北师范大学. 2009
[6]. 转玉米ZmPIS基因棉花获得及其抗逆性的初步研究[D]. 王雷. 山东大学. 2007
[7]. 转NtAOX1a基因烟草的获得及其抗逆性分析[D]. 张毅. 山东农业大学. 2009
[8]. 脯氨酸代谢在甘菊和切花菊抵御非生物胁迫中的作用机制[D]. 张蜜. 北京林业大学. 2014
[9]. 普通烟草K~+通道NKT5的克隆、序列分析及转基因载体的构建[D]. 司丛丛. 中国农业科学院. 2010
[10]. 聚合MtDREB1C和RcXET基因转化月季及其抗逆性研究[D]. 吴炼. 湖南农业大学. 2015
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