磁性纳米粒子对脂肪酶CRL的固定化

论文摘要

脂肪酶（EC3.11）作为绿色生物催化剂,广泛应用于生物制药、食品加工、化学分析等领域。固定化为提升酶重用性及稳定性提供了一种有效的解决途径,而以磁性纳米粒子为固定化载体可以更为方便快捷地回收酶。本文围绕磁性纳米粒子,制备出三种复合载体,包括化学共沉淀法制备得到磁性氧化石墨纳米复合物（MGO）、表面活性剂改性磁性氧化石墨烯（SMGO）和表面活性剂改性Fe304磁性纳米粒子（Span/Tween Fe304）,探讨三种载体用于褶皱假丝酵母脂肪酶（CRL）的固定化效果,并重点研究表面活性剂改性载体对脂肪酶催化特性的影响。采用正交实验对MGO载体的制备进行优化,以酶活与比活为考察指标,得到MGO的最佳制备工艺。傅里叶红外光谱（FT-IR）与扫描电镜（SEM）表征分析表明MGO制备成功,GO表层的羧基官能团在强碱条件下被部分还原,导致MGO表面羧基含量明显减少。在最优固定化条件下,固定化酶活力回收率及蛋白回收率分别为92.41%、88.2%。固定化酶重复利用第二次相对酶活下降至40%左右,推测MGO载体上固定的脂肪酶大部分为物理吸附,极少部分为共价固定。采用化学共沉淀法制备MGO,直接在反应体系中加入Span系列表面活性剂,一锅法制备得到表面活性剂改性磁性氧化石墨烯（SMGO）。X射线衍射仪（XRD）、SEM和FT-IR表征结果表明SMGO制备成功,且具有良好的磁分离性能。以戊二醛（GA）为交联剂,褶皱假丝酵母脂肪酶（CRL）为模型酶,共价固定CRL于SMGO载体上。Span40MGO固定化酶酶活回收率为116.5%±1.7,为MGO固定化酶的6倍;比活可达32.5U/mg,为游离酶的1.6倍;Keat/Km也有较大的提升,高于游离酶50%。储存稳定性及热稳定性得到提高,用于水解反应6批次后仍然保留73.60%的相对酶活力。初步分析认为MGO经改性后表面从亲水性转为疏水性,使得CRL在共价固定化过程中同时发生疏水界面活化,这是酶活性提高的原因之一。此改性策略可为类似载体改性提供新思路。对于Span/Tween Fe3O4载体来说,,Span系列改性Fe3O4制备的固定化酶蛋白回收率及酶活回收率均高于Tween系列改性,认为原因在于Tween/Span系列表面活性剂改性载体表面亲疏水性能的差异。动力学测定表明,Span Fe304固定化酶拥有更高的催化效率,Span40Fe3O4固定化酶Kcat/Km为33.38s-1.mM-1,为游离酶的1.7倍,为Fe304固定化酶的6.9倍,说明脂肪酶CRL在固定在疏水性Span40 Fe3O4载体表面时其催化活力中心被更多的暴露于底物,酶催化性能得到激活,疏水性表面活性剂改性磁性纳米粒子更适用于脂肪酶的固定化。在最佳固定化条件下,固定化酶活力回收为112.8%,总酶活为19.2U,固定化酶重用6次依然保留72.7%的相对酶活力,固定化酶储存稳定性,热稳定性均得到一定程度的提升。Span40 Fe304制备方法简单且廉价易得,能够在共价固定脂肪酶的同时实现脂肪酶的界面活化,从而提升固定化酶催化性能,为固定化酶的工业化应用提供了一种可行的固定化策略。

论文目录

摘要

ABSTRACT

符号说明

第一章绪论

1.1 脂肪酶

1.1.1 脂肪酶的催化特性

1.1.2 脂肪酶的固定化方法

1.1.3 固定化载体特性

1.2 纳米材料在固定化中的应用

1.2.1 氧化石墨烯简介

1.2.2 磁性纳米粒子

1.3 表面活性剂对酶催化的影响

1.3.1 表面活性剂简介

1.3.2 表面活性剂与酶的作用方式及影响

1.4 本课题研究意义与内容

1.4.1 课题研究意义

1.4.2 课题研究内容

第二章磁性氧化石墨烯固定化脂肪酶CRL的研究

2.1 前言

2.2 实验试剂与仪器

2.2.1 实验试剂

2.2.2 实验仪器

2.3 实验方法

2.3.1 磁性氧化石墨烯的制备

2.3.2 脂肪酶的固定化

2.3.3 蛋白测定

2.3.4 酶活测定

2.3.5 正交实验

2.3.6 载体表征方法

2.3.7 固定化时间、初始酶液浓度、温度对固定化效果的影响

2.3.8 固定化酶重复利用性能测定

2.3.9 固定化酶储存稳定性测定

2.4 实验结果

2.4.1 载体特性表征

2.4.2 磁性氧化石墨烯制备方法对固定化效果的影响

2.4.3 正交实验结果

2.4.4 固定化条件（时间、酶液浓度、温度）对固定化效果的影响

2.4.5 固定化酶重复利用性能

2.4.6 固定化酶储存稳定性

2.5 本章小结

第三章表面活性剂改性磁性氧化石墨烯共价固定脂肪酶CRL

3.1 前言

3.2 实验试剂与仪器

3.2.1 实验试剂

3.2.2 实验仪器

3.3 实验方法

3.3.1 Span系列表面活性剂改性磁性氧化石墨烯的制备

3.3.2 脂肪酶的固定化

3.3.3 蛋白测定

3.3.4 酶活测定

3.3.5 动力学测定

3.3.6 材料表征测定条件及方法

3.3.7 pH及反应温度对固定化酶催化性能影响测定

3.3.8 固定化酶热稳定性及储藏稳定性测定

3.3.9 固定化酶重复利用性能测定

3.4 实验结果与讨论

3.4.1 材料表征结果

3.4.2 Span系列表面活性剂改性MGO对固定化酶性能的影响

3.4.3 反应动力学

3.4.4 pH及反应温度对固定化酶催化性能的影响

3.4.5 固定化酶热稳定性稳定性及储存稳定性

3.4.6 固定化酶重复利用性能

3.5 本章小结

第四章表面活性剂改性磁性纳米粒子固定化酶

4.1 前言

4.2 实验试剂与仪器

4.2.1 实验试剂

4.2.2 实验仪器

4.3 实验方法

4.3.1 Span/Tween系列表面活性剂改性磁性纳米粒子的制备

4.3.2 脂肪酶的固定化

4.3.3 蛋白测定

4.3.4 酶活测定

4.3.5 动力学测定

4.3.6 材料表征测定条件及方法

4.3.7 Span40用量对载体固定化酶性能的影响

4.3.8 载体氨基功能试剂APTES用量及反应时间对固定化效果的影响

4.3.9 交联剂GA用量对固定化效果的影响

4.3.10 固定化时间及酶浓度对固定化效果的影响

4.3.11 pH及反应温度对固定化酶催化性能影响测定

4.3.12 固定化酶热稳定性及储藏稳定性测定

4.3.13 固定化酶重复利用性能测定

4.4 实验结果

4.4.1 材料表征结果

3O₄对固定化酶性能的影响'> 4.4.2 Span/Tween系列表面活性剂改性Fe₃O₄对固定化酶性能的影响

4.4.3 固定化酶、游离酶动力学参数

4.4.4 Span40浓度对载体固定化酶酶活回收率的影响

4.4.5 载体制备条件优化

4.4.6 GA浓度对固定化酶酶活回收率的影响

4.4.7 固定化条件优化

4.4.8 酶浓度对固定化酶酶活回收率的影响

4.4.9 pH与温度对固定化酶活性的影响

4.4.10 固定化酶、游离酶热稳定性及储存稳定性

4.4.11 酶浓度对固定化酶重复利用性能的影响

4.5 本章小结

第五章结论与展望

5.1 结论

5.2 展望

参考文献

附录

致谢

攻读硕士期间发表的学术论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王艳娥

导师: 刘幽燕

关键词: 磁性氧化石墨烯,固定化,脂肪酶,界面活化

来源: 广西大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,材料科学

单位: 广西大学

分类号: Q55;TB383.1

总页数: 82

文件大小: 8680K

下载量: 149

磁性纳米粒子对脂肪酶CRL的固定化

论文摘要

论文目录

文章来源

相关论文文献

猜你喜欢