巴氏固氮梭菌甘氨酸核糖开关传感器的构建及定向改造

论文摘要

核糖开关（Riboswitch）是位于基因5’端非翻译区的RNA功能元件,其无需其他蛋白或转录因子的参与即可特异性地结合代谢物,实现高效动态调控基因表达。然而,天然的核糖开关响应底物浓度的范围较为有限,且响应方式单一,极大地限制了核糖开关在代谢工程与合成生物学中的广泛应用。基于核糖开关的特性,开展其在动态调控产物合成途径方面的研究有着重要的科学意义与良好的应用前景。甘氨酸核糖开关是目前已知的20多种天然的核糖开关中唯一的激活型（ON）核糖开关。甘氨酸核糖开关位于编码甘氨酸剪切酶系的gcvTHP操纵子上游非编码区,包含能结合甘氨酸的两个串联适体区域。巴氏固氮梭菌的工业应用价值颇高,是当前实际生产过程中不可或缺的厌氧型工业微生物,在代谢工程以及合成生物学的实际应用中有着广阔的应用前景和重要的科学研究意义。本研究旨在构建巴氏固氮梭菌甘氨酸核糖开关报告载体,确定调控基因表达的甘氨酸浓度范围;并进一步对巴氏固氮梭菌甘氨酸核糖开关进行定向改造,最终阐明该核糖开关动态调控基因表达的机制,为巴氏固氮梭菌的代谢工程及合成生物学研究提供新的技术与工具。本篇论文以大肠杆菌W3110为宿主,分别构建甘氨酸核糖开关与半乳糖苷酶基因（lacZ）基因和红色荧光蛋白基因（mRFP）的融合载体,通过测定半乳糖苷酶的酶活与荧光强度,确定天然的甘氨酸核糖开关响应甘氨酸的有效浓度范围为10 mM-60mM。随后,基于红色荧光蛋白报告载体,确定在对基因表达的调控方面,适体-2比适体-1更为重要。基于此,通过应用核糖开关双向筛选技术,进一步地将天然的活型（ON）核糖开关定向改造为阻遏型（OFF）核糖开关,并获得一系列能响应不同浓度的甘氨酸核糖开关。

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摘要

ABSTRACT

第一章绪论

1.0 前言

1.1 代谢工程中基因的调控方式

1.1.1 静态调控

1.1.2 动态调控

1.2 核糖开关

1.2.1 核糖开关的简介

1.2.2 核糖开关的研究进展

1.2.3 甘氨酸核糖开关的研究意义

1.2.4 甘氨酸核糖开关的研究进展

1.3 核糖开关的检测方法

1.4 核糖开关的筛选方法

1.5 巴氏固氮梭菌简介

1.6 论文研究目标及思路

第二章基于巴氏固氮梭菌甘氨酸核糖开关的报告载体的研究

2.1 实验仪器与试剂

2.2 相关溶液的配制

2.3 实验方法

2.3.1 E.coli W3110-RED重组技术

2.3.1.1 氯化钙法制备野生型E.coli W3110的感受态细胞

2.3.1.2 通过酶切的方式验证质粒结构

2.3.1.3 将pKD-46转化到E.coli W3110感受态细胞

2.3.1.4 制备电转感受态细胞

2.3.1.5 电转片段的制备

2.3.1.6 电转化

2.3.1.7 菌落PCR

2.3.2 筛选生物传感器检测技术平台的构建

2.3.2.1 E.coli W3110-△lacZ感受态细胞的制备

2.3.2.2 甘氨酸核糖开关-半乳糖苷酶（GRBS-lacZ）质粒的构建

2.3.2.3 通过蓝白斑筛选的方式对目的质粒进行初筛

2.3.2.4 甘氨酸核糖开关-红色荧光蛋白（GBRS-RFP）质粒的构建

2.3.2.5 提取质粒

2.3.2.6 半乳糖苷酶酶活测定方法的建立

2.3.2.7 半乳糖苷酶生物传感器检测法的建立

2.3.2.8 红色荧光蛋白生物传感器检测法的建立

2.3.2.9 甘氨酸核糖开关动态调控范围的确定

2.4 实验结果

2.4.1 RED基因重组的结果

2.4.2 pCPRS-lacZ质粒构建结果

2.4.3 半乳糖苷酶测活法检测结果

2.4.4 实验检测方法的确定

2.4.5 甘氨酸核糖开关的动态调控范围

2.4.6 红色荧光蛋白检测法建立的结果

第三章甘氨酸核糖开关适体功能的确定

3.1 实验方法

3.1.1 PCR法得到含有不同适体域的质粒

3.1.2 适体功能的确定

3.2 实验结果

第四章甘氨酸核糖开关天然激活型（ON）的优化及阻遏型（OFF）定向改造

4.1 实验所用溶液的配置

4.2 实验方法

4.2.1 激活型（ON）和阻遏型（OFF）适体的突变体库建立

4.2.1.1 激活型（ON）和阻遏型（OFF）核糖开关筛选质粒模板的构建

4.2.1.2 激活型（ON）和阻遏型（OFF）核糖开关筛选质粒的构建

4.2.2 关于镍离子以及四环素最适筛选浓度的确定

4.2.3 激活型（ON）和阻遏型（OFF）核糖开关的筛选

4.2.4 采用红色荧光蛋白检测法筛选目的核糖开关

4.3 实验结果

4.3.1 筛选文库的建立

4.3.2 镍离子以及四环素最适筛选浓度的确定

4.3.3 响应不同甘氨酸浓度不同类型的核糖开关

4.3.3.1 响应0.1 mM甘氨酸浓度的核糖开关的筛选结果

4.3.3.2 响应0.5 mM甘氨酸浓度的核糖开关的筛选结果

4.3.3.3 响应1 mM甘氨酸浓度的核糖开关的筛选结果

4.3.3.4 响应5 mM甘氨酸浓度的核糖开关的筛选结果

4.3.3.5 响应10 mM甘氨酸浓度的核糖开关的筛选结果

第五章结论

参考文献

附录1 基因序列

附录2 实验所用仪器

附录3 实验相关试剂

附录4 基础试剂

致谢

研究成果及发表的学术论文

导师和作者简介

附件

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 李志栋

导师: 曾安平,王志亮

关键词: 核糖开关,甘氨酸,动态调控,双向筛选,巴氏固氮梭菌

来源: 北京化工大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 北京化工大学

分类号: Q78

DOI: 10.26939/d.cnki.gbhgu.2019.000677

总页数: 96

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