李宏增[1]2003年在《髓鞘碱性蛋白免疫表位肽诱导的淋巴细胞与神经元细胞的相互作用研究》文中研究表明背景： 多发性硬化症(multiple sclerosis，MS)是以局灶性脱髓鞘为特征的中枢神经系统(CNS)感染性疾病，被认为是髓鞘特异性T细胞介导的自身免疫性疾病。全世界约有110万患者，女性是男性的两倍。MS病因不明，认为环境和基因因素都起了重要的作用，发病率因区域不同而有明显差别；基因组研究发现MS易感基因主要与第6号染色体上的HLA-DR和HLA-DQ的某些等位基因相关。细胞和体液免疫反应都参与了MS的病理损害过程，髓鞘蛋白自身反应性T细胞在MS自身免疫过程中起了非常重要的作用，研究认为髓鞘碱性蛋白(MBP)反应性T细胞可使脑白质内的髓鞘破坏，并引起灰质内神经元继发变性坏死。动物研究证实MS病程中CNS的灰质和白质中都有凋亡细胞出现，凋亡细胞中更多的是淋巴细胞，且凋亡的T淋巴细胞主要是MBP特异性淋巴细胞。 MBP是髓鞘蛋白的主要成分之一，约占髓鞘蛋白质总量的30％。MBP能引起MS的动物模型—实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)。MBP(85-99)免疫表位是MS患者的免疫优势表位，能和HLA-DRB1*1501分子结合，其复合物晶体结构已确定，MS患者的TCR识别DRB1*1501-MBP(85-99)复合物而激活T细胞，T细胞进入CNS后克隆扩增，引起一系列免疫反应导致MS发病，在MS病灶中可以检测到DRB1*1501-MBP(85-99)复合物抗体。 MS病理研究发现，患者脑白质病灶中有T细胞、巨噬细胞的浸润和局部脱髓鞘病变，MS新鲜病灶内T淋巴细胞浸润更多，病理改变不仅累及白质，亦可累及灰质，MS的脑病变不仅有白质髓鞘的脱失，其灰、白质内的神经元细胞也受到侵害。传统理论认为神经元的变性是由髓鞘损害继发引起的，但研究发现活动期MS患者脑脊液(CSF)和CNS病损区有大量的CD4+、CD8+细胞沉积，这些T细胞到底起那些作用，能否直接损害神经元，没有实验研究证实。目的: 对MS病人自身免疫过程中的自身反应性T细胞的研究虽然很多，但自身反应性T细胞作用于CNS神经元细胞和髓鞘的形态学研究却匾乏，其引起MS的作用方式亦大都是理论上的假说，尤其对神经元的直接研究更加不足。本实验旨在体外研究观察N正P诱导的淋巴细胞能否直接作用于人脑神经元细胞，使神经细胞变性坏死;如有直接损害作用，那么鉴定CD4+细胞、CDS+细胞、NK细胞等T细胞亚群到底那种更起到明显的直接损害作用;检测对神经元和髓鞘直接作用的MBP诱导的淋巴细胞亚群有无不同，以便进一步探讨MS发病的细胞学机制。方法: 首先合成MBP免疫优势表位肤段83一ENPVVHR日。qvTpRTp一99肤段;用MTT法测定MBP合成肤的淋巴细胞转化率并找到其合适的工作浓度;流式细胞仪测定MBP合成肤诱导的T细胞亚群的变化;用MBP合成肤诱导培养的淋巴细胞与人脑神经元细胞共同混合培养，进行了扫描电镜观察，以发现MBP特异性淋巴细胞对神经细胞和髓鞘有无明显的聚集、薪附和攻击作用，神经元和髓鞘有无损伤;最后用CD分子荧光单克隆抗体染色方法，鉴定作用于神经元和髓鞘的MBP特异性T细胞的亚群种类，以便明确CD4+、CDS+细胞和自然杀伤T细胞(NK细胞)中，叨阵一个亚群起到更明显的直接作用，并比较作用于神经元和髓鞘的T细胞亚群是否不同。结果: M竹法测得的MBP(s3一99)合成肤可较好地诱导淋巴细胞转化，其合适的工作浓度在12.5u留ml以上;流式细胞仪测定MBP合成肤诱导的淋巴细胞中CDS+细胞比例升高;CD4+，NK细胞变化不明显;扫描电镜观察发现，MBP合成肤诱导的淋巴细胞与人脑神经元细胞和髓鞘有明显的聚集、薪附和攻击作用，MBP特异性淋巴细胞不仅直接作用于轴突的髓鞘，造成髓鞘脱失，还可能直接作用于人脑神经元，使神经细胞变性坏死;荧光抗体染色法检测到:MBP特异性淋巴细胞中CD4十、CDS+细胞和NK细胞亚群都对神经细胞有砧附作用，CD4+、CDS+细胞绝对数较多，NK细胞数较少，还可见到少量的CD3+l CD56+细胞，但具体作用部位需进一步确定，对神经元和髓鞘直接作用的MBP诱导的淋巴细胞亚群暂未发现有明显不同。结论: 合成的MBP(83一99)免疫优势表位肤段能诱导淋巴细胞转化，并使T淋巴细胞亚群的比例发生变化;MBP特异性淋巴细胞不仅直接作用于轴突的髓鞘，造成髓鞘脱失，还可能直接作用于人脑神经元，使神经细胞变性坏死;MBP特异性淋巴细胞中CD4十、CDS十细胞和NK细胞亚群都对神经细胞有薪附作用，可能这些细胞中的一种或两种直接作用于人脑神经元，使神经细胞变性坏死，CDS+淋巴细胞可能直接作用于轴突的髓鞘，造成髓鞘脱失，淋巴细胞的杀伤作用还需进一步探索;淋巴细胞也存在凋亡现象，多伴随着神经元变性和髓鞘脱失而发生。这种可能的细胞直接杀伤作用，尤其是对神经元的杀伤作用研究，是一个崭新的观点，进一步说明了MBP自身反应性淋巴细胞在MS发病过程中起重要作用。这种直接作用可能是多发性硬化症早期的发病机制之一。 此研究创新之处:在MS发病过程中，MBP特异性淋巴细胞不仅直接作用于轴突的髓鞘，造成髓鞘脱失，还可能直接作用于人脑神经元，使神经细胞变性坏死，而且可能不只一种T淋巴细胞亚群发挥作用。这?
丁茜[2]2012年在《靶向免疫细胞的脂质载体的研究》文中研究表明在过去几十年的脂质体有各种医疗应用，包括分子成像，药物输送，以及靶向性治疗。脂质体表面积大，结构具有弹性，有很大的修饰改良的潜力，其在体内的药代动力学表现出独特的性质。传统脂质体易被网状内皮系统吞噬，通过EPR效应实现被动靶向到肝脏，肺等特定组织；长循环脂质体经过高亲水双性分子的修饰，使得脂质体能够逃避RES的吞噬，延长其在血液中的循环时间，增加药物释放时间和作用时间，但缺乏靶向性，需要对脂质体表面进行额外的靶向配体修饰。目前，针对淋巴细胞的的靶向脂质体研究甚少，而在多种疾病中，治疗的失败往往是由于淋巴系统中隐匿的病灶，由于淋巴系统不同于其他身体器官，使得常规脂质体不能达到有效药物剂量，又或者因为限制性毒性不能达到治疗效果。本研究的重点是采用人工筛选的靶向配体多肽或者由免疫细胞自身剪切的多肽，对淋巴细胞形成靶向，构建淋巴系统靶向的脂质体，使其特异性的作用于淋巴细胞，达到治疗或者预防的效果。在人工筛选多肽配体的脂质体研究中，我们根据CD40/CD40L这一对与自身免疫疾病相关的通路，针对CD40L设计多肽配体，期望借助这配体实现对CD40/CD40L信号通路的阻断，同时对此通路中过度活跃的T细胞实现靶向杀伤。而隐形脂质体作为多肽配体展示以及细胞毒性药物的载体已经有大量的研究，我们结合筛选到的特异性配体，辅以细胞毒性药物，使用脂质体作为两者的载体，使其同时能够完成通路阻断和T细胞靶向杀伤的效果。我们使用计算机辅助模拟，确定受体和配体作用位点，筛选出具有与配体结合潜能的候选肽。后续使用表面等离子共振技术，对计算机虚拟筛选得到的候选多肽进行分子层面筛选。如此得到的多肽，我们再进行细胞层面的结合力筛选，最终确定个靶向多肽来进行CD40L+T细胞靶向毒性的体外和体内实验。实验结果表明，此多肽修饰的脂质体确实可以介导体外CD40L+T细胞的靶向杀伤，同时在对CD40/CD40L信号通路过度活化造成的动物疾病模型的治疗中，多肽修饰的脂质体与非靶向脂质体相比也表现出了较好的治疗效果。在天然表位肽制备脂质体的研究中，我们利用抗原呈递细胞中MHC-II类分子呈递抗原的过程，将抗原蛋白自然剪切成T细胞表位多肽。目前的研究，只能通过人工洗脱得到这些肽段或者计算机模拟后经过化学合成得到表位肽，费时费钱。而我们的研究则将此天然剪切的T细胞表位肽作为整体，通过脂质体重新组装抗原呈递细胞上含有MHC-II分子和表位肽的膜片段，考察这复杂的黑箱系统是否能对下游T细胞进行活化，引起机体的免疫反应。由于脂质体是膜蛋白的良好载体，所以使用脂质体可以很好的保持MHC-II分子和表位肽的生物活性，同时脂质体还是个类细胞系统，使得其装载细胞膜片段后能够实现部分膜蛋白的功能。在此项研究中，我们使用OVA作为模式抗原蛋白，树突状细胞作为模式抗原呈递细胞，通过体外活化的方法使得OVA经过自然剪切产生OVA表位肽，而此表位肽是与树突状细胞上的MHC-II分子结合在一起的。后续提取这表位肽/MHC-II复合物，利用脂质体作为载体，制成靶向CD4+T细胞的表位肽免疫脂质体。该脂质体在体外可以促进MF2.2D9T细胞株分泌IL-2，并且诱导原代CD4+T细胞增殖。将其回输体内，可以引起OVA特异性的体液免疫。经此脂质体免疫后的小鼠，可具有针对OVA的抗肿瘤特性，经分析该抗肿瘤效果是体液免疫和细胞免疫的共同作用结果。说明我们制备的自然剪切的表位肽T细胞靶向脂质体保持了定免疫学活性，并且可以作为种预防性肿瘤疫苗使用。
万昕[3]2018年在《致耐受性人工抗原提呈细胞靶向清除和调节髓鞘蛋白自身反应性T细胞治疗EAE的研究》文中研究表明研究背景:近年来利用仿生微纳米颗粒为载体构建免疫制剂调节和治疗多发性硬化症(multiple sclerosis,MS)及实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)的研究逐渐增多。这些免疫疗法的基本策略是利用仿生微纳米载体装载髓鞘蛋白、自身抗原多肽、毒素或多种调节性细胞因子,通过被抗原提呈细胞的摄取、提呈,经选择性活化途径诱导致耐受性抗原提呈细胞形成,再由后者来诱导调节性T细胞,或抑制致炎性细胞亚群,并间接抑制自身反应性T细胞的分化而产生耐受效应。这类“间接”特异性疗法受到体内多种因素影响而容易使致耐受性抗原提呈细胞的诱导不稳定,从而影响疗效。目前,靶向性清除、抑制或调节自身反应性T细胞的“直接”特异性疗法极少,尤其在EAE治疗中几乎没有相关报道。研究目的:本研究旨在发展一种可以直接靶向调节髓鞘蛋白自身反应性T细胞的致耐受性人工抗原提呈细胞(tolerogenic artificial antigen-presening cell,TaAPC),治疗以髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG)肽段MOG_(35-55)诱导的小鼠EAE模型,通过特异性杀伤或抑制MOG特异性CD4~+和CD8~+T细胞达到缓解EAE病情的目的。研究方法:首先以可生物降解的聚乳酸羟基乙酸共聚物(polylactic-co-glycolic acid microparticles,PLGA)为原料,制备细胞大小的微米球载体(PLGA-MPs),在其中包裹抑制性细胞因子TGF-β1,后在其活化表面共价偶联靶向分子(MOG_(40-54)/H-2D~b-Ig二聚体,MOG_(35-55)/I-A~b多聚体),调节分子(anti-Fas和PD-L1-Fc)以及可抗吞噬的“自我标记”分子CD47-Fc,构建MOG抗原表位特异性的TaAPCs。通过尾静脉输注到EAE小鼠体内,然后对其临床疗效、体内运行规律、体内外免疫细胞接触作用、负载各分子的作用机制以及是否产生副作用等都进行较为系统的探讨。研究结果:(1)细胞大小(直径5.0μm左右)的TaAPCs被成功制备,具有正确表型,5种表面免疫分子均被证实充分偶联于微球表面,而内部包裹的TGF-β1可以长期缓释;(2)TaAPCs在发病后早期的四次尾静脉注射可以显着并持久地降低EAE小鼠神经功能评分至100天,缓解CNS组织中的炎性浸润和髓鞘脱失现象,同时减少局部浸润T细胞的数量;(3)TaAPCs输注后可以通过脉管循环系统进入外周淋巴组织和各种器官,且由于大小限制并不能进入脑部。同时它可以在体内滞留超过36h,且与CD4~+T细胞和CD8~+T细胞存在较多的直接接触,而与其他免疫细胞共定位较少。由于CD47分子的存在,其被吞噬细胞吞噬的现象大幅减少;(4)TaAPCs的两次尾静脉注射治疗可导致外周血、脾脏以及脑脊髓组织中65-79%的MOG_(35-55)特异性CD4~+T细胞以及46-62%的MOG_(40-54)特异性CD8~+T细胞发生凋亡;同时,显着抑制MOG特异性T细胞的活化和增殖,显着减少MOG特异性Th1、Th17和Tc17细胞的数量,并诱导脾脏中Treg频率升高。此外,TaAPCs还可以显着抑制脾脏中促炎性细胞因子IFN-γ和IL-17A的分泌,而上调调节性细胞因子IL-10和TGF-β1的表达,但不能改变脑组织中这些细胞因子的水平;(5)TaAPCs治疗并未明显抑制机体的整体免疫功能,包括机体的抗肿瘤能力、对无关髓鞘蛋白多肽抗原和第叁方移植抗原的免疫应答能力等。结论:装载6种免疫分子的TaAPCs可以通过多种配体表面呈递和细胞因子旁分泌释放的共同作用在体内直接清除和调节自身反应性T细胞,从而持续缓解EAE病情。本研究为T细胞介导的自身免疫性疾病提供了一种新型的抗原特异性免疫疗法和免疫制剂。
裴纬亚[4]2018年在《致耐受性纳米颗粒直接靶向清除和调节自身反应性T细胞治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎的研究》文中研究说明背景:目前许多纳米材料已被报道用于治疗多发性硬化症(MS)或其疾病模型实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE),但大多数纳米制剂是通过递送髓磷脂抗原、细胞毒素或细胞因子等来诱导耐受性抗原呈递细胞的形成,从而间接地诱导T细胞耐受。其主要的不足是在体内诱导APCs存在多种不确定性。因此,自体反应性T细胞的直接和靶向清除及调节更值得深入研究。目的:本研究旨在制备负载多种调节性分子的致耐受性纳米颗粒(tolerogenic nanoparticles,tNPs),在MOG_(35-55)肽诱导的EAE小鼠体内直接靶向调节MOG自身反应性CD4~+和CD8~+T细胞,从而达到改善和缓解EAE病情发展的目的。方法:以可生物降解的聚乳酸-羟基乙酸聚合物(PLGA)为载体材料,经双乳化挥发法制备粒径为200 nm左右的PLGA纳米颗粒(PLGA-NPs),在其内部包裹TGF-β1后通过化学修饰法使其表面功能化,继而在表面装载分别靶向识别MOG_(35-55)特异性CD4~+T细胞和MOG_(40-54)特异性CD8~+T细胞的pMHC多聚体以及两种负调节分子(anti-Fas-mAb、PD-L1-Fc)和抗吞噬分子(CD47-Fc),最终制备成装载5种免疫分子的多功能的致耐受性纳米颗粒(tNPs),并通过静脉输注到EAE小鼠体内,研究其治疗效果,在体内的时空分布及相关作用机制等。结果:(1)成功制备了平均粒径为217 nm的多功能致耐受性纳米颗粒tNPs,具有正确表型,且包裹在内部的TGF-β1能够持续释放;(2)四次尾静脉输注tNPs可以有效缓解和改善EAE小鼠的临床症状,减轻其脑脊髓局部炎性细胞浸润和脱髓鞘程度以及T细胞的浸润;(3)活体成像观察结果显示tNPs可经血流分布各主要脏器,滞留36 h左右,并可突破血脑屏障,进入EAE鼠脑组织;免疫荧光染色证实tNPs在大脑皮层可与CD3~+T细胞相结合;(4)脾脏免疫荧光染色显示tNPs主要分布于边缘区和红髓,并靶向结合CD4~+和CD8~+T细胞,同时较少被巨噬细胞及DC细胞吞噬;(5)tNPs治疗明显促进EAE鼠脾脏中T细胞的凋亡,抑制T细胞的同种增殖,降低MOG反应性Th1、Th17、Tc1以及Tc17细胞的频率,并促进调节性T细胞的增殖。同时,tNPs治疗还能上调脑脊髓组织匀浆和脾细胞培养上清中TGF-β1和IL-10等抑制性细胞因子的表达。结论:装载5种免疫分子的tNPs可通过表面呈递和旁分泌方式对自身反应性T细胞进行直接地靶向调节,有效抑制EAE的发展。本研究为T细胞介导的自身免疫疾病提供了一种新的特异性主动免疫疗法。
参考文献：
[1]. 髓鞘碱性蛋白免疫表位肽诱导的淋巴细胞与神经元细胞的相互作用研究[D]. 李宏增. 中国人民解放军第一军医大学. 2003
[2]. 靶向免疫细胞的脂质载体的研究[D]. 丁茜. 上海交通大学. 2012
[3]. 致耐受性人工抗原提呈细胞靶向清除和调节髓鞘蛋白自身反应性T细胞治疗EAE的研究[D]. 万昕. 东南大学. 2018
[4]. 致耐受性纳米颗粒直接靶向清除和调节自身反应性T细胞治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎的研究[D]. 裴纬亚. 东南大学. 2018
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