查莉, 于姣姣, 许斌[1]2018年在《天然免疫检查点CD47-SIRPα在恶性肿瘤中的研究进展》文中提出针对CTLA-4/B7和PD-1/PD-L1的免疫检查点抑制剂现已广泛应用于临床,其他检查点抑制剂也正在开发中。CD47是广泛表达于正常细胞表面的蛋白质,在肿瘤细胞中呈过表达状态,其受体为髓系抑制性免疫受体SIRPα。阻断CD47与SIRPα之间的相互作用可增强巨噬细胞和中性粒细胞的吞噬作用进而消灭肿瘤细胞。此外,越来越多的证据表明阻断CD47-SIRPα轴还可以增强抗原呈递细胞的功能,从而刺激T细胞介导的抗癌免疫。随着该领域研究的发展,CD47-SIRPα轴的临床应用将会是未来肿瘤免疫治疗的热点之一。
李丹, 余涛, 曾智, 叶鹏, 吴杰[2]2018年在《基于Oncomine和GEO数据库分析SIRPα基因在乳腺癌中的表达意义以及丹参酚酸B的干预作用研究》文中进行了进一步梳理目的通过挖掘Oncomine和GEO基因芯片数据库中的相关数据,分析信号调节蛋白α(SIRPα)基因在乳腺癌中的表达及其临床意义,并探讨丹参酚酸B对乳腺癌细胞中SIRPα基因的干预作用。方法检索Oncomine和GEO数据库中有关乳腺癌和丹参酚酸B干预乳腺癌的数据集,对所获取的数据资料进行数据挖掘,并结合文献资料综合分析。考察丹参酚酸B作用于乳腺癌MCF7细胞的基因表达谱。结果对Oncomine数据库中共收集的9项关于乳腺癌和乳腺正常组织SIRPα基因有差异表达的研究数据进行分析,发现乳腺癌组织中SIRPα基因的表达明显低于乳腺正常组织,差异具有统计学意义(P<0.05)。通过生存分析发现低表达SIRPα基因乳腺癌患者无病生存期明显差于高表达者,高表达患者的预后更好(P<0.05)。通过挖掘GEO数据库中的数据集GSE85871发现丹参酚酸B能够上调乳腺癌细胞SIRPα基因的表达(P<0.01)。结论SIRPα基因在乳腺癌组织中呈现低表达,并与乳腺癌患者的预后相关,该基因可能是丹参酚酸B干预乳腺癌细胞的一个新靶点。
王美亮[3]2016年在《重组SIRPα-Fc融合蛋白的表达及其体外活性鉴定》文中认为目的:SIRPα(Signal regulatory protein alpha)是一种跨膜蛋白,属于免疫球蛋白超家族成员,其胞外配体是CD47。SIRPα与CD47之间的信号联系在调节巨噬细胞吞噬肿瘤细胞方面发挥重要作用,已有研究证实抗CD47单克隆抗体、重组SIRPα蛋白、CD47胞外蛋白能够促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞。通过对抗CD47单克隆抗体、重组SIRPα蛋白、CD47胞外蛋白抗肿瘤作用机制的研究,我们尝试用原核系统表达出一种重组的SIRPα-Fc融合蛋白,这种蛋白在重组SIRPα蛋白的氨基端再增加两个组氨酸,更有利于目标蛋白的纯化。在重组SIRPα蛋白的羧基端插入经改造后的Fc片段,新的重组蛋白能够通过Fc片段与巨噬细胞表面的Fc受体结合,同时这种融合蛋白中的高亲和性SIRPα能够与肿瘤细胞表面的CD47结合,从而使巨噬细胞和肿瘤细胞牢固结合在一起,那么从理论上讲巨噬细胞对肿瘤细胞的清除作用会更加增强,并且通过这种机制能够减轻巨噬细胞对正常细胞的吞噬。另外,这种蛋白具有可溶性好、分子量小的优点。本课题为进一步研究重组SIRPα-Fc融合蛋白抗肿瘤作用的分子机制奠定基础,对于恶性肿瘤的治疗具有重要意义。方法:(1)原核表达可溶性重组SIRPα-Fc融合蛋白。在已经报道的高亲和力重组SIRPα蛋白的氨基端插入两个组氨酸,羧基端插入经改造后的Fc片段,合成重组DNA,并在重组DNA的5,端加上限制性内切酶NdeI的识别位点,在3,端加上限制性内切酶SailI的识别位点。合成后的全基因片段通过NdeI和SailI双酶切后与同样双酶切的Pmal-p5X载体连接,构建成重组的表达载体pmal-p5x-sirpα-fc,然后将表达载体转化大肠杆菌dh5α,进行质粒扩增,选取具有正确酶切位点的质粒进行测序鉴定,测序结果与全基因合成目的片段序列一致之后,再用感受态细胞bl21(de3)将表达载体pmal-p5x-sirpα-fc进行第二次转化。用异丙基硫化-β-半乳糖苷(iptg)诱导大肠杆菌表达目的蛋白,优化表达条件,提高目的蛋白表达量。然后,进行扩大培养,提取的蛋白用含有his-tag标签的亲和层析柱纯化,最终获得重组sirpα-fc融合蛋白。用sds-page及westernblot分析目的蛋白的表达情况及大小的正确性。(2)重组sirpα-fc融合蛋白体外活性鉴定。为了验证重组sirpα-fc融合蛋白是否能够阻断sirpα-cd47信号通路,重组sirpα-fc融合蛋白能否更进一步促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞。我们用lipofetamine3000将gfp质粒转染到肿瘤细胞中,待肿瘤细胞绿色荧光标记成功之后,将巨噬细胞细胞与肿瘤细胞共培养在无血清的培养基,然后将sirpα-fc融合蛋白添加到上述培养基中。2小时之后,在荧光显微镜下观察巨噬细胞吞噬情况并统计吞噬指标,同时验证重组sirpα-fc融合蛋白的活性及功能。结果:(1)实现了重组sirpα-fc融合蛋白在原核系统中的可溶性表达,获得了纯化的重组sirpα-fc融合蛋白。(2)通过巨噬细胞与肿瘤细胞共培养的方法,发现sirpα组、sirpα-fc融合蛋白组巨噬细胞的吞噬指数明显高于pbs组,但是在sirpα组和sirpα-fc融合蛋白组中,巨噬细胞的吞噬指数没有明显差异,并且对照组和处理组中的吞噬指数均低于文献报道的数据。结论:由于巨噬细胞的吞噬指标低于相关文献报道的数据,但是受时间和经费限制未能作进一步研究。下一步,我们将优化实验条件、改进实验方法,选择不同类型的肿瘤细胞系进行体外实验,并建立小鼠疾病模型进行体内实验,进一步验证重组SIRPα-Fc融合蛋白对巨噬细胞吞噬肿瘤细胞功能的影响,研究其与重组SIRPα蛋白相比的优势和不足。
赵辉[4]2016年在《CD47在非小细胞肺癌转移中的作用及相关机制研究》文中研究说明背景和目的:肺癌在我国发病率极高,据报道近十几年肺癌分别占在我国男性和女性恶性肿瘤发病率的第一和第二位,并且发病年龄也出现了下降的趋势。其中非小细胞肺癌作为肺癌的一个大类发病率也逐年增高,近年来肺癌相关领域基础医学研究及临床诊断治疗方法逐渐进步,越来越多的肺癌患者得到了规范的治疗,使得肺癌的诊治率有了很大的提升,然而由于肺癌表现出较强的侵袭性,尤其是一旦肺癌发生转移,患者即将面临极高的死亡威胁。因此,总体来说,对肺癌的转移情况进行控制仍然是肺癌领域需要解决的重要关键问题。然而目前肿瘤转移相关分子机制仍不清楚。为了探索肿瘤转移的相关分子机制,近年来,CD47分子逐渐引起了大家的关注。其重要原因在于,研究发现肿瘤细胞可以表达―别吃我‖信号,从而使得巨噬细胞对肿瘤吞噬作用减低,出现肿瘤对免疫逃逸现象,这种现象与肿瘤转移密切相关。而肿瘤细胞高表达的CD47分子就是一种―别吃我‖信号分子。当肿瘤细胞表面CD47分子与巨噬细胞的表面SIRPα分子组合成CD47-SIRPα信号复合体时,导致巨噬细胞SIRPα分子的细胞内部结构中免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)发生磷酸化,因此可以传导抑制性信号通路,即―别吃我‖信号来减少巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬活性,这样便产生肿瘤细胞的免疫逃逸现象。而且CD47高水平表达与血液系统恶性肿瘤和部分实体肿瘤的分化程度、转移能力、生存率及预后密切相关。CD47与肿瘤相关性研究得到越来越多关注,然而CD47在肺癌表达及与转移的相关性等研究未见相关报道。另一方面,除了研究者关注的CD47-SIRPα信号复合体引起的肿瘤免疫逃逸现象,另有研究者提出cd47与肿瘤生长和转移的作用仍有其他机制参与其中,然而相关的机制研究甚少。因此,本研究亦将对cd47与转移的相关作用机制进行初步的探讨。我们通过组织标本和肺癌细胞株的cd47表达情况进行分别检测,并利用体内和体外实验分别对cd47与肺癌转移的相关性进行分析验证。最后对cd47与肺癌转移的相关机制进行初步探讨。本研究分以下叁部分进行。研究方法:1.非小细胞肺癌组织cd47的表达及其临床意义选取20例非小细胞肺癌者切除的手术标本,利用westernblotting方法对癌及癌旁组织中的cd47表达水平进行检测。同时采用免疫组织化学检测方法对80例非小细胞肺癌患者的石蜡组织切片对cd47表达水平进行检测,通过免疫组织化学评分将80例患者按照cd47表达水平分为低表达cd47组和高表达cd47组,利用统计学分析的方法对不同cd47表达水平与病理分型、肿瘤分化程度及tnm分期等临床病理特征进行分析。2.cd47在nsclc侵袭转移中的作用本部分研究分别从体外实验和体内实验两方面进行阐述。体外实验部分:首先利用westernblot、real-timepcr和细胞免疫荧光对不同肺癌细胞株的cd47表达情况进行检测。为验证cd47表达水平与细胞转移能力的关系,我们构建了基于微流控芯片技术的转移模型。利用该模型我们可以对细胞在不同情况下的转移情况进行实时的动态观察。利用rna干扰技术和质粒转染技术分别下调或上调肺腺癌细胞株a549和肺鳞癌细胞株nci-h520的cd47表达,将进行不同处理的各组细胞株分别注入微流控芯片转移模型内观察72小时后细胞的转移情况,分析不同cd47表达水平表现出的肺癌细胞体外转移能力的差异和区别。体内实验部分:通过皮下注射构建原位肺癌模型、通过尾静脉注射构建肺癌移植模型,同时利用shrna稳定下调a549细胞的cd47表达,观察在两种动物模型中不同cd47表达的a549细胞的原位成瘤以及肿瘤转移情况,进一步验证cd47与肺癌发展转移的影响。3.cd47促进非小细胞肺癌转移机制的初步探讨为探讨cdc42作为cd47的下游分子参与非小细胞肺癌侵袭和转移我们进行以下研究,利用westernblot方法检测不同肺癌细胞株cd47和cdc42的表达情况;通过rna干扰技术和质粒转染技术分别下调或上调肺腺癌细胞株a549和肺鳞癌细胞株nci-h520的cd47表达,进一步观察cd47表达水平变化是否伴随cdc42表达改变。上调cd47表达的a549和nci-h520细胞株再利用rna干扰技术下调cdc42表达后观察不同处理情况的细胞株在微流控芯片转移平台内细胞转移能力的情况。最后对80例非小细胞肺癌患者的石蜡切片cd47表达与cdc42表达情况进行统计分析。结果:1.非小细胞肺癌组织cd47的表达及其临床意义利用westernblotting蛋白检测方法对20例非小细胞肺癌患者的手术切除组织标本的癌及癌旁组织中cd47表达水平进行检测,发现癌组织的cd47表达水平明显高于癌旁组织(p<0.05)。同时采用免疫组织化学检测方法对80例非小细胞肺癌患者的石蜡切片对cd47表达水平进行检测,结果亦证实癌组织cd47表达明显高于癌旁组织,对不同患者的cd47表达水平进行分组,结果发现高表达cd47与tnm分期密切相关,高表达cd47的患者更易出现淋巴转移和远处转移;另外高表达cd47与临床分期亦相关,高表达cd47的患者临床分期越差。提过提示cd47表达水平与非小细胞肺癌的转移和侵袭相关,对cd47的表达检测将对临床转移和预后的判断具有重要意义。2.cd47在nsclc侵袭转移中的作用为了在体外观察验证细胞的转移能力,我们成功构建了基于微流控芯片技术的细胞转移模型。利用该模型我们可以实时对不同细胞的转移情况进行动态观察。为了更加全面验证的cd47在nsclc侵袭转移中的作用,我们分别选取了肺腺癌细胞株a549和肺鳞癌细胞株nci-h520分别进行检测分析。利用rna干扰技术成功将a549和nci-h520的cd47表达水平下调,进而将未处理和下调cd47表达的a549和nci-h520细胞分别注入微流控芯片转移模型内,观察72小时后细胞的转移情况,结果证实在下调cd47表达的a549和nci-h520细胞转移数量较对照组明显减少,差异具有统计学意义(p<0.05)。为进一步验证,我们利用质粒转染a549和nci-h520细胞稳定上调cd47表达,结果发现在上调cd47表达后a549和nci-h520的细胞转移数量明显增高,差异具有统计学意义(p<0.05)。体内实验进一步观察,稳定下调cd47表达的a549组6只裸鼠的皮下成瘤体积大小较a549组明显减小;在尾静脉注射转移模型小鼠中同样观察到稳定下调cd47表达的a549组形成的肝转移结节数量少于a549组。3.cd47促进非小细胞肺癌转移机制的初步探讨通过westernblot检测了不同肺癌细胞株cd47蛋白表达与cdc42蛋白表达情况,发现在高表达cd47的细胞株中cdc42也呈高表达,反之亦然。为验证cdc42作为cd47的下游分子参与了肺癌细胞的侵袭和转移,我们对a549和nci-h520分别下调或上调cd47表达,利用westernblot检测了cdc42的蛋白表达情况,结果表明cd47表达水平的变化伴随了cdc42表达水平的改变。对80例肺癌患者对组织切片进行免疫组织化学染色观察,发现在高表达cd47的患者中80.4%也存在cdc42高表达;在低表达cd47的患者中85.3%也存在cdc42低表达。表明cd47表达调节了cdc42的表达情况。为进一步验证cd47通过cdc42调节细胞的转移和侵袭,我们利用质粒转染a549和nci-h520上调cd47的表达,再利用rna干扰技术下调cdc42表达,在微流控芯片转移平台内观察下调cdc42表达后细胞的侵袭转移数量较未下调cdc42表达的对照组明显减少,差异有统计学意义(p<0.05)。结论:1.通过westernblot和免疫组织化学染色检测到非小细胞肺癌组织标本的cd47表达癌组织明显高于癌旁组织;cd47表达与患者转移情况、临床分期相关,高表达cd47的患者临床分期越差、更易出现淋巴转移和远处转移。因此提示cd47分子可以在非小细胞肺癌中判断侵袭和转移的一个指标。2.成功构建了可以模拟细胞侵袭转移过程的微流控芯片转移模型。在该芯片模型内可以实现细胞的叁维培养并对细胞的侵袭转移数量进行实时的动态观察,通过比较转移细胞数量的差别来直观验证细胞的转移能力。采用肺腺癌细胞株a549和肺鳞癌细胞株nci-h520作为研究对象,利用rna干扰技术和质粒表达下调和上调两种细胞株的cd47表达,观察两种细胞株在微流控芯片转移模型内处理前后细胞转移数量的差异,证实cd47表达与细胞的转移侵袭能力中发挥重要作用。进一步在体内成瘤以及转移模型中亦证实下调CD47表达,A549细胞体内成瘤和转移能力均降低。说明CD47分子在判定非小细胞肺癌的侵袭和转移现象中起到重要的作用。3.CD47在肺癌细胞株中表达水平的变化伴随Cdc42分子的表达水平改变。在肺癌患者组织标本中我们亦证实Cdc42表达水平与CD47表达相关。利用微流控芯片的转移模型观察到下调Cdc42表达可以干预CD47高表达所引起到细胞转移性增加。这些结果初步阐明了Cdc42作为CD47的下游分子参与了肿瘤细胞的侵袭转移过程,为肺癌的转移机制和临床诊治提供了有益的帮助。
王茜[5]2017年在《基于球不变过程的信道衰落模型性能分析及误差研究》文中研究说明随着无线衰落信道模型的不断提出,如何在统一归类的基础上进行系统化的数学分析成为了难点,球不变随机过程(Spherically Invariant Random Process,SIRP)很好地为该分析提供了理论工具。SIRP是一般化的高斯过程,继承了高斯过程易于处理、线性闭合等诸多优良性质。且已有理论证明,现有的大多数衰落模型均可归类为SIRP。本文主要关注了基于SIRP的无线信道衰落模型,对其参数化特性和系统可靠性进行了讨论,并进一步研究了 SIRP下的系统误差。论文的主要工作包括以下几点:(1)阐述了如何通过梅林变换和H函数对SIRP的参数进行求解,并重点关注小尺度衰落情形,从广义Gamma分布入手,选取了 Nakagami-m和Weibull这两种具有代表性的小尺度衰落信道作为研究对象,分析了在非视距场景下,两种信道中特征变量V的相关特性;(2)依据无线系统性能的统一数学表示,选取误比特率和中断概率作为评价可靠性的主要指标,推导了两者在非视距(Not Line of Sight,NLOS)场景和视距(Line of Sight,LOS)场景中基于球不变衰落的一般公式,分析了 Nakagami-m和Weibull信道下的可靠性。并讨论了一种在SIRP条件的广义矩问题,给出了叁种情形下系统性能的边界结果;(3)分析了在球不变衰落信道下,如何根据实测数据在规定误差范围内选择信道模型X这一核心问题。使用Kullback-Leibler(K-L)距离及其近似估计算法,对存在误差的两种小尺度信道模型进行了评价;(4)提出了球不变随机衰落模型下的两个概念:概率密度函数比率η和关于Gmax(d)的相对误差评判指标r。通过仿真,定量地分析了在所要求的精度内由模型选择不准确带来的系统误差的范围;同时比较了不同信噪比下,当K-L距离为不同量级时与理论模型系统性能的差别并分析了原因;(5)在小尺度衰落的基础上,简单给出了大尺度衰落对SIRP信道的影响。提出了大尺度衰落在SIRP信道下的统一表达方式以及几种受到阴影对数正态分布影响的混合衰落模型。
叶璐夷, 杨启修, 夏荣伟, 荀春志, 赵俸涌[6]2018年在《重组SIRPα1的体外表达及其在红细胞CD47-SIRPα信号通路研究中的应用》文中研究指明目的获得野生型信号调节蛋白α1(SIRPα1)功能结构域重组蛋白,以用于研究正常或异常红细胞的吞噬和清除中CD47-SIRPα信号通路的作用。方法全基因合成人源野生型SIRPα1 IgV结构域编码区;将合成片段构建入携带组氨酸(His)标签的pET-21a大肠杆菌载体,获得重组表达载体。使用大肠杆菌BL21 (DE3)细胞体外表达重组SIRPα1,并通过亲和层析法纯化;利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定重组SIRPα1;采用基于ELISA的红细胞结合试验评估2名Rh缺失表型献血者与正常Rh表型个体对照在红细胞结合水平的差异;流式细胞术检测红细胞CD47表达;采用单因素方差分析对数据做统计分析。结果成功构建重组表达载体,纯化获得野生型重组SIRPα1。成功建立了基于ELISA的红细胞结合试验方法并应用于评估重组SIRPα1与红细胞的结合。伴随CD47表达量的明显降低,Rh缺失表型个体的红细胞和正常个体相比,其与重组SIRPα1的结合能力下降。结论 CD47-SIRPα信号通路可能在Rh缺失表型红细胞的清除中发挥了作用。
赵一蓉[7]2016年在《新型融合蛋白Pro-SIRPα的构建及生物学活性研究》文中研究表明跨膜糖蛋白CD47,属于免疫球蛋白超家族的一种跨膜蛋白,广泛表达于多组织细胞表面,如红细胞、血小板、淋巴细胞、肝细胞及肿瘤细胞等。其生理功能多样,参与细胞与胞外基质的相互作用,与细胞凋亡、增殖、迁移等细胞学过程关系密切并且参与肿瘤免疫逃逸的机制。目前,CD47这一靶点已用于研究治疗多种疾病如白血病、非霍奇金氏淋巴瘤、骨髓瘤及其他实体瘤。信号调节蛋白α(SIRPα,signal regulatory protein-α),作为免疫球蛋白超家族膜蛋白的成员之一,是SIRP家族中一个典型的抑制性受体。其特异性的表达于髓系细胞如巨噬细胞、树突状细胞,以及神经细胞膜表面。CD47是SIRPα的天然配体,CD47-SIRPα信号通路在多种生理机制中发挥作用。其中,以在体内巨噬细胞吞噬过程中发挥的作用为最有特征性的。当巨噬细胞表面的SIRPα在与肿瘤细胞表面的CD47分子结合后,会介导“Don’t eat me”的信号,使肿瘤细胞免于巨噬细胞的吞噬,发生免疫逃逸,进而导致肿瘤进展。然而,在正常血液系统细胞表面也会有少量的CD47表达,CD47-SIRPα信号通路参与红细胞吞噬过程的调节,也一定程度上参与血小板及淋巴细胞的调节。因而,传统的抗CD47抗体类药物都会引起一定程度的血液系统副作用,从而影响靶向CD47抗体药物的临床应用前景。针对这一问题,本研究构建了可在肿瘤部位特异性释放封闭肽的高亲和力新型融合蛋白pro-SIRPα,并对其生物学活性进行了研究。首先利用噬菌体表面展示肽库技术筛选得到与突变型信号调节蛋白SIRPα-cv1活性区特异性结合的短肽(12肽),作为封闭肽(masking peptide)降低SIRPα-cv1与CD47的结合亲和力,从而减少SIRPα-cv1与非肿瘤部位的CD47结合的可能,减少“抗原沉默”(antigen sink effect)现象的发生。然后,通过含有尿激酶(uPA)酶切位点的柔性多肽linker将封闭肽连接在SIRPα-cv1融合蛋白的氨基末端(N-端),构建为完整的pro-SIRPα。在肿瘤微环境下,linker在uPA酶的作用下水解,释放前端短肽,暴露pro-SIRPα与CD47的结合位点,从而起到竞争性结合CD47的作用,有效抑制肿瘤的进展。体外实验中,本研究通过竞争ELISA验证了pro-SIRPα前端封闭肽是否具有封闭效应。实验结果表明:由于氨基端封闭肽的存在,pro-SIRPα与CD47的结合能力显着下降。而用肿瘤微环境中富含的uPA酶水解后,pro-SIRPα氨基末端的linker断裂,使得封闭肽脱离并暴露出完整的SIRPα-cv1,恢复与CD47的结合能力。因此,由于封闭肽的存在,新型融合蛋白pro-SIRPα对肿瘤组织的特异性得到了明显的提高,减少了其与正常血液系统细胞的结合,降低了潜在的血液毒性以及可能引起的抗原沉默(antigen sink effect)现象。此外,本研究还证实,与单独应用抗EGFR的单抗相比,uPA处理后的pro-SIRPα与抗EGFR-单抗联用可显着增强巨噬细胞对A431肿瘤细胞的吞噬作用。靶向阻断肿瘤部位的CD47-SIRPα信号通路,可有效促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用。而pro-SIRPα的研制可能为肿瘤靶向治疗提供新的策略。
王敏[8]2012年在《信号调节蛋白α负性调节IgE诱导的肥大细胞脱颗粒及细胞因子合成》文中研究表明研究背景及目的近几年随着空气污染等环境变化，过敏性疾病的发病率显着上升，其中包括Ⅰ型超敏反应。Ⅰ型超敏反应发病突然，严重时可能威胁生命。在自然界广泛存在能够致敏的抗原性物质，它们可以经呼吸道消化道或皮肤接触等途径进入体内，刺激免疫系统产生抗原特异性免疫球蛋白E（IgE）。随后IgE分子可以同肥大细胞表面受体FcεRI(high-affinity receptor for the Fc region of immunoglobulin E)稳定结合。FcεRI是一条α链、一条β链和两条相同的γ链组成的四聚体。α链是配体结合链，其胞外区能和IgE的Fc段结合；β链和γ链有ITAM区，发生磷酸化后介导下游信号传递。当特异抗原再次进入体内，可以同IgE分子结合并且使相邻的两个FcεRI交联，引起肥大细胞活化。肥大细胞活化后通过脱颗粒和分泌炎性因子等发挥其生物学作用。体内的免疫反应强度和范围受到多种机制调节，其中包括细胞表面激活性受体和抑制性受体平衡所起到的调控作用。信号调节蛋白家族（signal regulatory proteinfamily）就是一类细胞表面的抑制性受体。信号调节蛋白α（signal regulatory protein α，SIRPα）是一种广泛存在的抑制性受体，属于免疫球蛋白受体超家族。SIRPα主要表达在神经元细胞及髓系非淋巴细胞，如肥大细胞。SIRP胞外区具有叁个IgSF样结构域和多个糖基化位点，胞内区带有免疫受体酪氨酸抑制基序（ITIMs），其中含四个酪氨酸残基，磷酸化后能够募集含SH2结构域的分子如蛋白磷酸酶SHP-1和SHP-2。肥大细胞作为过敏反应的效应细胞，抑制性受体SIRPα对其功能的调节尚未见系统性报道。我们研究发现抗原活化肥大细胞后SIRPα蛋白表达水平下降，提示SIRPα对肥大细胞活化可能存在抑制作用。为进一步了解SIRPα在肥大细胞活化过程以及Ⅰ型超敏反应中的作用，本课题通过利用差异表达SIRPα的细胞进行研究，研究了SIRPα在抗原诱导肥大细胞活化中的作用。重点是SIRPα对肥大细胞脱颗粒及分泌细胞因子的影响及相关信号通路的调节。实验方法1．建立稳定高表达Myc-SIRPα和转染空载体对照的肥大细胞系。分离培养小鼠骨髓来源肥大细胞(BMMCs)，合成鉴定具有特异干扰效果siRNA，瞬时干扰SIRPα表达，构建BMMCs siSIRPα和BMMCs control细胞；2．采用特异性磷酸化抗体检测SIRPα差异表达的肥大细胞在抗原刺激后p38、JNK、ERK、Akt、NFAT等信号分子的磷酸化水平变化，反映SIRPα对信号通路活化的调节；3．运用荧光素酶报告基因系统检测SIRPα对NF-κB，NFAT转录活性的调节；4．通过检测肥大细胞活化后β-氨基己糖胺酶的释放，研究SIRPα对肥大细胞脱颗粒的调节；5．采用Real-time PCR方法检测肥大细胞炎性因子的mRNA水平；6．采用荧光探针检测SIRPα对细胞骨架F-actin聚合的调节；7．使用Ca2+指示剂检测SIRPα对抗原引起肥大活化过程中Ca2+流动的调节；8．用Western blot检测SIRPα对细胞骨架微管形成的影响；10.将BMMCs siSIRPα及阴性对照细胞输入肥大细胞缺失小鼠（c-kitwsh/wsh）体内，重构肥大细胞系统。进行被动皮肤过敏反应，体内观察SIRPα对肥大细胞功能的调节。11.采用免疫组织沉淀的方法检测SIRPα与SHP-2的结合，SHP-2与PI3Kp85和IKKβ的相互作用。结果1. SIRPα参与抗原诱导的肥大细胞活化过程：在肥大细胞活化过程中，SIRPα蛋白表达降低,并呈现抗原剂量与时间依赖性。同时，SIRPα发生磷酸化并募集SHP-1和SHP-2。2. SIRPα调节肥大细胞活化后分泌功能：SIRPα显著抑制肥大细胞脱颗粒及细胞因子合成。3. SIRPα抑制肥大细胞活化过程中的细胞骨架改变：SIRPα抑制肥大细胞活化过程中α-tubulin聚合及F-actin解聚。4. SIRPα抑制肥大细胞活化过程中的Ca2+释放，提示SIRPα通过调节Ca2+释放影响肥大细胞骨架改变及脱颗粒过程。5. SIRPα对Ⅰ型超敏反应过程中血管渗出的影响：与对照小鼠相比，输入低表达SIRPα肥大细胞的小鼠皮下渗出更加明显。这进一步说明SIRPα抑制肥大细胞分泌功能。6. SIRPα抑制细胞骨架重构的机制：抗原引起肥大细胞活化过程中，SIRPα明显抑制PLCγ1磷酸化，从而抑制Ca2+释放。此外SIRPα明显抑制Rac-1GTPase及PAK1的活性，进而抑制了微管的形成。7. SIRPα影响肥大细胞细胞因子合成分泌的机制：抗原诱导的肥大细胞活化过程中，SIRPα通过抑制MAPK信号通路磷酸化以及转录因子NFκB和NFAT活性，抑制肥大细胞由抗原诱导的炎性因子合成与分泌。8. SIRPα在抗原诱导的肥大细胞活化过程中发挥负性调节作用的机制：肥大细胞活化后，SIRPα通过Src家族激酶发生磷酸化。随后SIRPα通过竞争结合SHP-2，影响SHP-2与PI3Kp85及IKKβ的结合，抑制Akt与NF-κB信号通路。结论本研究从分子－细胞－动物水平较深入研究了信号调节蛋白SIRPα对肥大细胞功能的调节作用，发现SIRPα负性调节肥大细胞活化，包括抑制肥大细胞脱颗粒及炎性因子合成并对体内的过敏反应能力具有负向调控能力。同时本研究进一步探讨了SIRPα调节相关信号转导通路的作用机制，证明SIRPα可能通过抑制SHP-2与IKKβ及PI3Kp85的结合发挥负向调控作用。
赵一蓉, 徐进, 郭怀祖, 李彦韬, 陈曦[9]2016年在《新型融合蛋白pro-SIRPα的构建及体外活性研究》文中提出筛选获得肿瘤特异性释放封闭肽的高亲和力新型融合蛋白pro-SIRPα并对其体外活性进行了研究。首先利用噬菌体表面展示肽库筛选能与信号调节蛋白SIRPα-cv1活性区结合的短肽,并以含有尿激酶(uPA)酶切位点的linker将其连接在SIRPα-cv1融合蛋白的氨基末端,构建完整的pro-SIRPα。通过竞争ELISA实验验证pro-SIRPα前端封闭肽具有封闭效应。由于氨基端封闭肽的存在,pro-SIRPα与CD47的结合能力显着下降。而肿瘤微环境中富含uPA,可水解pro-SIRPα氨基末端的linker,使得封闭肽解离并暴露出的完整SIRPα-cv1,恢复与CD47的结合能力。因此,pro-SIRPα可特异性作用于肿瘤细胞,减少了与正常血液系统细胞的非特异性结合,降低了毒性以及可能引起的抗原沉默(antigen sink effect)现象。我们的体外实验还证实,与单独应用抗EGFR-IgG1单抗相比,pro-SIRPα与抗EGFR-IgG1单抗联用可显着增强巨噬细胞对A431肿瘤细胞的吞噬作用。pro-SIRPα的研制可能为肿瘤靶向治疗提供新的策略。
李娟[10]2017年在《咳喘宁口服液干预哮喘模型大鼠SIRPα对Th1/Th2的调节作用》文中提出目的:观察咳喘宁口服液干预SIRPα对哮喘模型大鼠Th1/Th2的影响,探讨哮喘中神经系统与免疫系统的相互作用机制,进一步阐明哮喘神经源性炎症机制以及咳喘宁的调节作用机理。方法:(1)哮喘发病时SIRPα及其配体CD 47的表达及咳喘宁口服液对其表达的影响。幼龄Wistar大鼠30只,随机选取5只为正常组,其余动物按幼龄大鼠RSV复合OVA哮喘模型方法造模,于致敏2周后,通过观察大鼠精神状态及心率、呼吸来检测模型是否成功。待造模完成后,将造模成功后的动物按随机数字表法分为5组,每组5只,即哮喘大鼠组(模型组)、哮喘大鼠SIRPα抗体干预组(SIRPα抗体组)、哮喘大鼠咳喘宁低剂量治疗组(咳喘宁Ⅰ组)、哮喘大鼠咳喘宁中剂量治疗组(咳喘宁Ⅱ组)、哮喘大鼠咳喘宁高剂量治疗组(咳喘宁Ⅲ组)。除正常组外,其余5组大鼠分别给药(SIRPα抗体组予以SIRPα抗体腹腔注射,咳喘宁Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别给予咳喘宁低、中、高剂量灌胃),每天1次,共2周。检测各组动物脊髓后角中SIRPα及其配体CD 47分别在mRNA、蛋白质水平上的表达:mRNA水平检测用Real-time PCR技术,蛋白质水平采用Western blotting技术。(2)哮喘发病时SIRPα对Th1/Th2的免疫调节作用及咳喘宁口服液的干预作用。幼龄Wistar大鼠60只,随机选取6只为正常组,其他动物按幼龄大鼠RSV复合OVA哮喘模型方法造模,于致敏2周后,检测模型是否成功。待造模完成后,将动物按随机数字表法分为9组,每组6只。即哮喘大鼠组(模型组)、哮喘大鼠SIRPα干预组(SIRPα组)、哮喘大鼠SIRPα抗体干预组(SIRPα抗体组)、哮喘大鼠不同剂量咳喘宁干预组(咳喘宁Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组)、哮喘大鼠SIRPα+不同剂量咳喘宁干预组(联合Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组)。除正常组外,其余9组大鼠分组给药。哮喘大鼠不同剂量咳喘宁干预组(咳喘宁Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组)、哮喘大鼠SIRPα+不同剂量咳喘宁干预组(联合Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组),此6组均予以咳喘宁口服液灌胃治疗,按临床量效关系观察结果拟定咳喘宁口服液高剂量1ml/100g,中剂量0.3ml/100g,低剂量0.033ml/100g,每日1次,持续2周,直到处死。哮喘大鼠SIRPα干预组(SIRPα组)、哮喘大鼠SIRPα+不同剂量咳喘宁干预组(联合Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组),该4组均给予SIRPα腹腔注射;哮喘大鼠SIRPα抗体干预组(SIRPα抗体组)给予SIRPα抗体腹腔注射。腹腔注射每日1次,共2周。检测大鼠动物模型中血清中IFN-γ、IL-4等炎症因子表达变化:采用酶联免疫吸附法(ELISA)方法。结果:1.哮喘发病时SIRPα及配体CD47的表达:(1)与正常组相比,咳喘宁Ⅱ组SIRPα及其配体CD47的表达稍增高,但差异无统计学意义(P>0.05);(2)与正常组、咳喘宁Ⅱ组相比,模型组、抗体组、咳喘宁Ⅰ组、咳喘宁Ⅲ组SIRPα及配体CD47的表达均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);(3)与咳喘宁Ⅱ组相比,咳喘宁Ⅰ组、咳喘宁Ⅲ组SIRPα及配体CD47的表达均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);(4)与SIRPα抗体组相比,咳喘宁Ⅰ组SIRPα在mRNA上的表达稍增高,咳喘宁Ⅱ组的SIRPα及CD47的蛋白质水平上的表达稍降低,但差异无统计学意义(P>0.05),咳喘宁Ⅲ组、模型组SIRPα及配体CD47的表达均明显增高,且差异具有明显统计学意义(P<0.01);(5)与模型组相比,正常组、SIRPα抗体组、咳喘宁Ⅰ组、咳喘宁Ⅱ组、咳喘宁Ⅲ组SIRPα及配体CD47的表达均明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。其中咳喘宁Ⅱ组的SIRPα及CD47在蛋白质水平上的表达稍低于SIRPα抗体组,但差异无统计学意义(P>0.05)。2.哮喘发病时SIRPα对Th1/Th2的免疫调节作用(IL-4与IFN-γ的含量变化)及咳喘宁口服液的干预作用。(1)正常组、咳喘宁Ⅱ组、抗体组均稍有差异,但差异无统计学意义(P>0.05);(2)与正常组、咳喘宁Ⅱ组、抗体组对比,抗原组、联合Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组、咳喘宁Ⅰ、Ⅲ组的IL-4均明显升高,IFN-γ均明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);(3)与模型组相比,联合Ⅱ组IL-4含量稍降低,IFN-γ稍升高,但差异无统计学意义(P>0.05)联合Ⅰ、Ⅲ组IL-4含量升高且IFN-γ明显降低,抗体组、咳喘宁Ⅱ组的IL-4含量明显降低且IFN-γ含量明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);咳喘宁Ⅰ、Ⅲ组的IL-4明显升高但IFN-γ含量稍降低,差异无统计学意义(P>0.05);(4)抗原组的IL-4含量明显高于其他各组,但IFN-γ明显低于其他各组,且差异有统计学意义(P<0.05);(5)与咳喘宁Ⅰ组相比,咳喘宁Ⅱ组IL-4含量明显降低且IFN-γ升高,且差异有统计学意义,联合Ⅰ、Ⅲ组IL-4含量升高且IFN-γ降低,差异有统计学意义(P<0.05);咳喘宁Ⅲ组IL-4含量稍降低,IFN-γ稍升高,但差异无统计学意义(P>0.05);联合Ⅱ组IL-4含量稍升高,IFN-γ稍降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论:(1)哮喘发病时SIRPα及配体CD47表达明显增高,咳喘宁口服液能抑制SIRPα及配体CD47的表达,中剂量组效果最佳。(2)哮喘发病时Th1/Th2明显失衡,咳喘宁口服液可能通过干预SIRPα来改善Th1/Th2失衡,从而改善哮喘的气道炎症。(3)咳喘宁口服液能有效改善哮喘的Th1/Th2失衡,其以中剂量治疗组效果最佳。
参考文献：
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[9]. 新型融合蛋白pro-SIRPα的构建及体外活性研究[J]. 赵一蓉, 徐进, 郭怀祖, 李彦韬, 陈曦. 现代免疫学. 2016
[10]. 咳喘宁口服液干预哮喘模型大鼠SIRPα对Th1/Th2的调节作用[D]. 李娟. 湖南中医药大学. 2017
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