王勤英[1]2004年在《嗜线虫致病杆菌杀虫蛋白的分离纯化及杀虫蛋白基因克隆》文中指出昆虫病原线虫共生菌属于肠杆菌科、革兰氏阴性菌，包含两个属—Xenorhabdus和Photorhabdus，分别与Steinernematidae和Heterorhabditidae科的昆虫病原线虫互惠共生。二者联合可以侵染并快速杀死多种昆虫。通常共生菌依靠线虫将其携带进入寄主昆虫体内并释放到昆虫体腔中，共生菌在昆虫血腔内大量繁殖并产生杀虫毒素，导致寄主昆虫迅速死亡(约48h之内)。同时共生菌产生的抗生素抑制杂菌生长，为线虫生长、发育和繁殖提供理想的环境和合适的营养。昆虫病原线虫—共生菌复合体对昆虫具有的强致病力，共生菌在其中起着关键性作用。已有的研究表明许多共生菌不仅能产生血腔毒素，同时还能产生杀虫谱广、杀虫活性高的胃毒素。因此分离筛选高毒力的共生菌菌株、对其杀虫毒素及其杀虫基因进行深入研究，有助于发掘新的杀虫蛋白及杀虫基因，有可能为改变当前害虫防治和转基因抗虫植物的培育中杀虫蛋白或杀虫基因匮乏的局面开辟一条新的途径。 本研究利用大蜡螟和黄粉虫土壤诱集法，从河北省各地的719份土样中的28份诱集到了昆虫病原线虫，有线虫率为3.89％。经初步鉴定25个为异小杆属线虫(Heterorhabditis)、3个为斯氏属线虫(Steinernema)。土样有线虫率与植被有关。以果园内最高，为8.64％，其次为菜地7.27％，杂草等未耕地为3.28％，大田作物为1.68％。通过取被感染大蜡螟血淋巴涂平板的方法，分别从这28个线虫品系中分离出28个共生菌菌株。 对从河北省分离的28个菌株和4个本室保存的菌株的部分16S rDNA序列进行PCR扩增和测序，与共生菌已知种的同源序列进行比较分析，构建了系统进化树，初步确定了这32个共生菌的分类地位。这些菌株明显分成嗜线虫致病杆菌和发光光杆菌2个簇，区别Photorhabdus和Xenorhabdus两个属的DNA碱基差异在383和503的位置(E.coli numbering)，所有的Xenorhabdus为G和A，而所有的Photorhabdus为A和C。 从河北省分离到的发光光杆菌大部分与P.luminescens关系密切，归属于叁个亚簇。其中HB89和HBgy相似性达100％，二者与P.luminescens laumondii亚种相似性达99％。来自河北省的HBxhl、HBxh5、HB3、HB140、HB8、HB06、HB36、HB73、HB141、HB202、HB231、HB237、HB287、HB288、HB301和HB352菌株很有可能是P.luminescens中的新亚种或新种。GZ139与P.temperam相似性为100％，可能是该种的一个品系。D1菌株与已知的P.luminescens akhurstii亚种同源性很高，可能为同一亚种。HB310和HBml均为X.nematophila中的品系；gw15可能是Xenorhabdus中的一个新种。 HB310菌株的Ⅰ型菌与Ⅱ型菌部分16S rDNA序列的相似性是100％。但是HB310菌株的I型菌与n型菌的形态特点、生理生化指标测定及杀虫活性存在较大的差异。I型菌的胃毒活性和血腔活性远远高于n型菌。11型菌的蛋白组份发生了很大的变化，H型菌的native一PAGE蛋白图谱上没有发现叁种与杀虫活性有关的蛋白区带，但是从I型菌和n型菌的基因组DNA中都扩增出同样大小的毒素基因片段。 x nemat叩hila HB310、Srio、HBml、A24和p luminesense HB202、DI、HBgy等多株共生菌对棉铃虫和小菜蛾等有较高的口服胃毒活性，其中X nem“toPhila所有品系的杀虫活性均高于其它种类的菌株。不同属、种及同种不同品系的共生菌对同种昆虫的胃毒活性差别很大，同一菌株对不同昆虫的毒力差别也较大。小菜蛾对共生菌是比较敏感的，尤nematOPhila HB3 10、Srio、HBml和p luminesense HBZoZ、DI、HBgy等6个菌株的发酵液在72h均可100%杀死小菜蛾2龄幼虫。 对HB310菌株杀虫活性的深入研究表明，该菌的杀虫谱较广，对鳞翅目和鞘翅目的10种昆虫都有胃毒活性，特别是小菜蛾、菜粉蝶、云斑粉蝶和马铃薯二十八星瓢虫等幼虫有很强的胃毒活性，其发酵液对四种幼虫在72h的致死率达到100%。对棉铃虫、甜菜夜蛾、玉米螟等幼虫的生长有很强的抑制作用。HB310菌株在对数生长初期已开始产生杀虫毒素，在对数生长中后期(15h)其杀虫活性己达到最高。 HB310菌株发酵液中的细胞和胞外上清蛋白提取物中都含有较强的血腔注射杀虫活性物质和口服胃毒素。通过native一PAGE从胞内蛋白提取物中分离出2种有胃毒活吐的蛋白组份(toxinx和toxin 11)和1种血腔注射活性的蛋白组份(toxin 111)，同时从胞外蛋白提取物中也分离到这叁种毒素。SDS一PAGE电泳图谱显示两种胃毒素分别含有3一4个多肤，而血腔毒素只看到一条带，可能是一种单体蛋白。纯化的血腔毒素对5龄大蜡螟幼虫血腔注射LD50为1 81 .sng/头。血腔毒素耐70℃处理10 min;胃毒素耐50℃处理10 min，对其杀虫活性无影响。血腔毒素能够破坏血细胞成碎片。 构建了X nematoPhila HB310基因组DNA粘粒文库。通过生物测定方法从Xnematophila HB310中筛选到对棉铃虫初孵幼虫有口服胃毒活性的2个克隆:pwEBZ16和pWEB338，pWEBZ16克隆的杀虫活性显着高于pWEB33s。pWEBZ16克隆对棉铃虫幼虫的口服毒力LCS。为9.5xlo’ocells/mL。 根据GenBank中x nematoPhila PMF12%致病岛上5个杀虫基因序列，设计了9对引物。用pCR的方法对pWEB216和pWEB338两个克隆进行了鉴定，从pWEB216?
杨保军[2]2005年在《嗜线虫致病杆菌北京变种CB6菌株杀虫蛋白的分离和纯化》文中认为嗜线虫致病杆菌北京变种(Xenorhabdus nematophila var.pekingensis)CB6菌株是从北京郊区土壤中分离的小卷蛾斯氏线虫(Steinernema carpocaposae)肠道内所分离到的共生细菌,已经鉴定并定名。研究表明该菌株具有良好的杀虫活性。为挖掘这一本土细菌资源,本研究将其与另9个昆虫病原线虫共生细菌菌株进行了杀虫活性比较,对10个不同来源的昆虫病原线虫共生菌菌株胞内和胞外产物进行分离,将各产物的可溶性蛋白提取,并分别进行生物测定,结果表明CB6菌株产杀虫蛋白性能好。在此基础上以CB6菌株作为研究材料,分离纯化其胞内和胞外的杀虫活性蛋白,建立一套纯化该活性蛋白的技术参数,并对杀虫蛋白的特性进行了初步鉴定。现将主要研究结果总结如下: 1.测定的10个菌株发酵液均对棉铃虫和甜菜夜蛾幼虫有口服毒性,活性物质的产生部位在菌体胞内和胞外均有。不同菌种或同一菌种的发酵液、胞内或胞外产物和菌体碎片的杀虫活性不尽相同,一般胞内产物的活性要高于胞外。胞内胞外总蛋白的生测结果初步断定10个供试菌株所表现出的杀虫活性物质主要是蛋白类。 2.建立了一条有效纯化CB6菌株杀虫蛋白的技术路线,通过该纯化层析方案能获得纯化倍数较高的目标蛋白。其基本参数包括: 硫酸铵盐析:最佳硫酸铵饱和度为20～50%;离子交换层析:使用DEAE Sepharose FF层析柱,洗脱低盐为25mM Tris-HCl(pH7.4),高盐为1mol/L NaCl;洗脱高盐体积范围15～30%;疏水层析:使用Butyl FF层析柱,洗脱高盐为3mol/L NaCl+25mM Tris-HCl(pH7.4),低盐为25mM Tris-HCl(pH7.4)。凝胶层析:使用Sephacryl S-200 16/10层析柱,洗脱buffer:25mM Tris-HCl(pH7.4)。 通过该纯化技术路线所获得的目标蛋白浓度为4.134μg/mL,表现出对棉铃虫初孵幼虫97.9%的生长抑制率。 3.从CB6菌株胞内和胞外所获得的目标蛋白native-PAGE表明分子量都大于669kD,电泳带位置相同。该目标蛋白SDS-PAGE表明,2个目标蛋白都只出现一条分子量约为220kD的带。纯化该目标蛋白的层析技术完全相同。这说明CB6菌株胞内和胞外所产的目标蛋白可能是同一种蛋白。 4.目标蛋白的紫外吸收光谱在250～290nm下有吸收值。蛋白染色试验结果表明,目标蛋白不是脂蛋白,也不是糖蛋白。 CB6菌株发酵液中具有杀虫活性的物质为蛋白质,该种蛋白质具有较高的生物活性,严重抑制棉铃虫幼虫的取食和生长发育。本研究首次报道了CB6菌株胞内和胞外所产杀虫蛋白具有相似性,为开展胞内胞外杀虫蛋白的来源关系的研究奠定基础。本研究所建立的纯化该类杀虫蛋白的技术路线,为研究该菌株杀虫蛋白的作用机理以及为该杀虫蛋白基因的克隆提供了依据和基础。
杨君[3]2008年在《嗜线虫致病杆菌血腔毒素的纯化及其致病机理的研究》文中提出嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila)是与小卷蛾斯氏线虫(Steinernemacarpocapsae)共生的昆虫病原细菌,为革兰氏阴性菌,属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)。侵染期的昆虫病原线虫能够灵活地寻找到靶标昆虫,将携带的共生菌释放到寄主血腔内。嗜线虫致病杆菌在侵入到寄主昆虫血腔后能够成功地逃避或抑制寄主昆虫的免疫反应并快速杀死昆虫。为深入了解嗜线虫致病杆菌的杀虫机理,明确关键的致病因子,作者应用盐析和制备型非变性凝胶电泳等方法,从嗜线虫致病杆菌HB310菌株的细胞内分离纯化了两种对大蜡螟(Galleriamellonella)幼虫具有高血腔注射活性的蛋白——Tp40(toxin protein of 40 kDa)和Tp60(toxin protein of 60 kDa)。经SDS-PAGE电泳分析,Tp40和Tp60蛋白分别只显示出一条分子量约为42kDa和60kDa的多肽,它们对5龄大蜡螟幼虫48 h血腔注射的LD_(50)分别为68.54 ng/头和181.5 ng/头。Western印迹分析表明Tp40蛋白与已知的Txp40蛋白同源,并且仅存在于共生菌细胞内。编码T040蛋白的基因开放读码框全长1107 bp(GenBank登录号:EU095326),编码368个氨基酸残基,预测分子量为41.5 kDa,等电点为8.66,与GenBank中的其余13株昆虫病原线虫共生菌所包含的相似基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列比较,同源性分别为85%～99%和70%～99%。Tp40蛋白具有很高的血腔杀虫活性,其基因序列具有较强的保守性。当以不低于(70±0.02)ng/头的剂量注射Tp40,大蜡螟幼虫均在20 min内死亡;注射后试虫马上开始快速爬动,表现出兴奋症状;几分钟后大部分试虫运动减少,头胸部翘起,口器持续一张一合;10 min后试虫表现强烈的痉挛症状,足和口器微颤,体躯前后抽搐,有的扭曲翻滚,最后死亡。试虫尸体发软但无脱水现象,体色不发生改变。继续放置6 h后,发现试虫尸体从其头部到胸部变黑,但身体其它部分不变色。在注射LD_(50)剂量的Tp40蛋白后,试虫体内羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶活力都明显的高于对照(尸<0.05),而酚氧化酶活力显着低于对照(P<0.05)。经质谱鉴定,Tp60与已知蛋白GroEL高度匹配,故推测Tp60属于GroEL蛋白。注射Tp60的大蜡螟幼虫体色变黑(30 min内),血淋巴呈灰黑色,并且暴露于空气中后不再继续黑化。用Tp60蛋白处理大蜡螟幼虫,其体内多酚氧化酶活性开始急剧升高,6 h之后又急剧下降,直到48 h其活性均显着低于对照;而羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶活性明显增强。对大蜡螟幼虫中肠的组织病理学研究显示:这种42 kDa和60 kDa的蛋白都能够破坏试虫的中肠组织,导致其肠壁细胞出现排列紊乱、脱落和围食膜消失。据此推测,Tp40和Tp60蛋白可能与嗜线虫致病杆菌对寄主昆虫的免疫抑制有关,寄主中肠组织是其作用靶标之一。
尹富仕[4]2010年在《拒食蛋白XnAFP2功能结构域分析与作用机理初步研究》文中提出拒食蛋白XnAFP2是一种从嗜线虫致病杆菌CB6菌株中分离纯化的毒性蛋白,对多种农业害虫具有拒食、抑制生长发育的作用。为了进一步研究拒食蛋白XnAFP2,本文克隆了拒食蛋白基因xnAFP2,对其进行了功能结构域分析,分别克隆、表达、纯化了各结构域片段,并进行了生物活性测定,得到了拒食蛋白XnAFP2的主效活性区域。同时,还对取食XnAFP2的玉米螟体内主要酶系活性变化进行了测定,为XnAFP2作用机理的研究奠定基础。全文主要研究结果如下:1.拒食蛋白XnAFP2的基因克隆、表达通过AKTA分离纯化得到拒食蛋白XnAFP2,利用质谱测序的方法,得到XnAFP2的部分肽段序列,然后进行NCBI数据库比对,根据保守序列设计引物,克隆得到拒食蛋白基因xnAFP2,并尝试对该基因进行表达。2.拒食蛋白XnAFP2功能结构域的划分与各结构域表达载体的构建拒食蛋白XnAFP2全长2524氨基酸,对该蛋白进行表达非常困难,为了研究其主效活性区域,对其进行结构域预测和划分,用PCR方法扩增了出3个结构域片段:DomainI,DomainII,DomainIII,并构建了各结构域片段的融合表达载体。3.拒食蛋白XnAFP2叁个结构域的表达与纯化将XnAFP2叁个结构域片段的表达载体转入E.coli BL21(DE3)细胞,经IPTG诱导表达,获得了拒食蛋白叁个结构域片段的表达蛋白。用蛋白纯化系统(AKTA Explorer10.0)对表达蛋白进行His?Tag亲和层析纯化和脱盐处理,得到纯化蛋白。4.拒食蛋白XnAFP2叁个结构域片段表达蛋白的功能比较与分析通过拒食蛋白各蛋白片段对棉铃虫、玉米螟、小菜蛾叁种幼虫的生长抑制作用的测定,比较分析其功能差异,以期得到拒食蛋白主效活性区域。结果表明,叁个蛋白片段对棉铃虫叁龄幼虫的生长抑制率分别为17.4%、39.8%和20.2%,对玉米螟叁龄幼虫的生长抑制率分别为20.2%、38.6%和21.7%,对小菜蛾叁龄幼虫的非选择性拒食率分别为25.7%、44.1%和26.8%。叁个结构域片段的表达蛋白对棉铃虫和玉米螟的叁龄幼虫均表现出不同程度的生长抑制活性,对小菜蛾的叁龄幼虫具有不同程度的拒食效果。其中以Domain II活性最高,无论是对棉铃虫和玉米螟叁龄幼虫的相对生长抑制率还是对小菜蛾叁龄幼虫的非选择性拒食率,均高于40%;而Domain I、Domain III生长抑制活性或拒食效果较低,均低于27%,与Domain II相比差异显着。因此,Domain II是拒食蛋白XnAFP2的主效活性区域。5.拒食蛋白XnAFP2对玉米螟体内主要酶系活性的影响用拒食蛋白XnAFP2饲喂玉米螟3龄幼虫,检测了拒食蛋白对玉米螟生长发育的影响,并通过生化分析研究其对玉米螟幼虫体内解毒酶、保护酶和中肠蛋白酶活性的影响,测定比较了取食XnAFP2后幼虫体内乙酰胆碱酯酶、谷胱甘肽S-转移酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和中肠总蛋白酶的活力。结果表明:取食拒食蛋白XnAFP2 (50μg/ml)72h后玉米螟幼虫相对生长抑制率达69.88%,体内谷胱甘肽S-转移酶活力明显低于对照;而乙酰胆碱酯酶活力显着高于对照(3.5倍),保护酶系、中肠总蛋白酶的活性在取食36h后都有一个诱导上升的过程,但随着时间的延长,昆虫生长发育受到明显抑制,体内主要酶系活性都大大降低。
杨君[5]2012年在《Xenorhabdus budapestensis D43菌株杀虫蛋白的分离纯化及致病机理的研究》文中进行了进一步梳理昆虫病原线虫共生菌是一种重要的微生物资源，它能够产生多种具有杀虫、抑菌、抗肿瘤等功能的代谢产物，在农业和医药卫生领域显示出巨大的开发潜力和应用前景。特别是昆虫病原线虫共生菌能够产生多种杀虫蛋白，不仅可以直接作为蛋白质农药，而且能够为转基因抗虫植物和杀虫工程菌株的发展提供更多新颖的基因资源。本研究以从中国东北土壤样品获得的拟双角斯氏线虫中分离的共生菌Xenorhabdusbudapestensis D43为试验材料，对该菌株细胞内的蛋白进行了纯化和筛选，并对筛选到具有杀虫活性的蛋白进行了鉴定、基因克隆、序列生物信息学分析、重组蛋白的表达和纯化，以及致病机理等方面的研究，得出主要研究结果如下：1、昆虫病原线虫共生菌X. budapestensis D43菌株细胞内含有大量的蛋白种类，本研究利用制备型凝胶电泳的方法成功纯化到4种，其中一种对大蜡螟幼虫具有血腔注射活性，命名为HIP57。生物测定结果显示，该蛋白对5龄大蜡螟幼虫的LD50为206.81ng/头；当以不低于490ng/头的剂量注射时，试虫体色会在15min之内变黑，48h死亡率为100%。2、经过双向电泳分析和质谱鉴定，HIP57的分子量约为60kDa，等电点4~5，与GroEL蛋白具有较高同源性。GroEL虽为分子伴侣，但在本研究中，来自于共生菌X.budapestensis D43菌株的HIP57显示出杀虫功能。克隆获得HIP57基因全长1647bp（GenBank accession no. JN863588），编码548个氨基酸残基（GenBank accession no.AEU10771）。3、生物信息学分析结果显示，HIP57蛋白的相对分子量为57379.7Da，理论等电点为4.77，与电泳结果相吻合；该蛋白序列中不含信号肽，属于稳定的水溶性蛋白；同时采用4种不同的预测原理分析了HIP57的二级结构，特别是运用同源模建构建了精确度较高的HIP57蛋白叁级结构；通过HIP57蛋白与其他4种同样来源于昆虫病原线虫共生菌的GroEL蛋白进行序列比对发现，该蛋白拥有一些特有的氨基酸残基；根据GroEL蛋白氨基酸序列的同源性，本研究成功构建了43种肠杆菌科细菌的系统发育树，将X. budapestensis D43聚类至致病杆菌属，显示出GroEL蛋白序列具有在细菌分类学和进化学应用的潜在性。4、对HIP57、GFP和HIP57-GFP进行了原核表达，同时获得了纯度较高的3种重组蛋白。经western blotting分析，这些重组蛋白与其相应的抗体都能够发生特异性结合。与天然HIP57蛋白引起试虫通体黑化现象和高致死活性相比，HIP57和GFP重组蛋白没有显示出这样的功能；而HIP57-GFP重组蛋白虽不对试虫具有致死活性，但是能够引起试虫体内出现大量的黑色结节。5、HIP57蛋白对大蜡螟幼虫致病机理的研究结果包括：其一，HIP57能够引起大蜡螟幼虫强烈的免疫反应，包括PO活力显着升高，血细胞数量显着降低，以及血细胞包囊反应；其二，大蜡螟注射HIP57后，有23种血淋巴蛋白的表达量发生显着变化，其中4种获得成功鉴定，分别为ApoLp-III、Serpin、P27K和GST；其叁，捕获2种与HIP57具有潜在结合作用的血淋巴蛋白，分别为芳基贮存蛋白和β-1，3-葡聚糖识别蛋白前体。虽然在昆虫病原线虫共生菌复合体侵染寄主昆虫过程中，HIP57是否被分泌的问题本研究未能给出答案，但HIP57显示出非常高的致病性，如果在昆虫病原线虫共生菌复合体致病过程中能够被分泌到寄主血腔中，应为一种重要的致病因子；即便在线虫共生菌致病过程中不能分泌到寄主血腔，HIP57作为一种拥有较高致病性的蛋白，其研究价值和应用潜力仍然十分值得关注。本研究结果不仅为揭示HIP57蛋白的杀虫机理奠定了基础，而且为该蛋白的合理利用提供了理论依据。
张超[6]2012年在《昆虫病原线虫共生菌的分离及其活性和肿瘤靶向性研究》文中研究表明昆虫病原线虫共生菌是一类与昆虫病原线虫互惠共生的革兰氏阴性细菌,属肠杆菌科,存在于昆虫病原线虫肠道内,分为两个属——致病杆菌属(Xenorhabdus sp.)和发光杆菌属(Photorahbdussp.),分别与斯氏线虫(Steinernema)和异小杆线虫(Heterorhabditis)共生,具有广谱高效杀虫、抑菌及抗肿瘤等生物活性,体外培养过程中会发生不可逆的表型改变,由初生型(Ⅰ型)转变为次生型(Ⅱ型)。本研究完成了昆虫病原线虫共生菌的分离与鉴定,研究了分离菌株的多功能生物活性和生长培养特性,探索了将其作为抗肿瘤靶向菌剂的抗肿瘤效果和作用方式,得到了分离菌株产生的具有高效抗肿瘤活性的小分子次级代谢产物。采用大蜡螟诱集法从长沙岳麓区和常德德山区采集回来的土样中直接分离得到3株昆虫病原线虫共生菌,通过菌落形态观察、镜检、全蛋白质图谱比对以及16S rRNA基因同源性分析等一系列方法鉴定3株细菌均属致病杆菌X. stockiae,分别命名为X. stockiae HN_xs01, X. stockiae HN_ds01和X. stockiae HN_dsO2,并将16S rRNA基因序列提交上Genbank,获得登陆号分别为HQ840745.1、 JQ219853.1和JQ219854.1。根据初步的生物功能检测,选取X.stockiae HN_xs01,对其生长曲线、最适pH值、最适生长温度、培养过程中pH值变化情况及抗生素抗性等生长特性进行了研究。对比分析了X. stockiae HN_xs01两种型态菌株的抑菌、杀虫及抗肿瘤活性。结果表明该细菌对金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、赖氨酸芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、产气肠杆菌等多种病原细菌具有较强的抑菌作用,初生型菌株较次生型具有更强的抑菌活性；对棉铃虫、大蜡螟等农业害虫具有高效杀虫毒性,两型态菌株间的杀虫毒性没有明显差异；对小鼠黑色素瘤细胞B16、人宫颈癌细胞Hela.人类上皮癌细胞A431和人类慢性骨髓瘤细胞K562等肿瘤细胞具有较高的细胞毒性,在细胞培养液中只需加入2.78%的X.stockiae HN_xs01 72 h发酵培养液上清原液即可达到对B16细胞的半抑制剂量,两型态菌株间的抗肿瘤细胞毒性没有明显差异。本论文首次尝试了将昆虫病原线虫共生菌致病杆菌作为一种抗肿瘤靶向菌剂,并取得了较好的效果。研究了X.stockiae HN_xs01通过瘤内注射和静脉注射C57BL/6荷瘤小鼠后,对小鼠自身及其肿瘤生长的影响,发现该细菌在一定的注射剂量范围内,能积聚于小鼠肿瘤内生长繁殖并能明显抑制小鼠肿瘤生长及肺转移,同时,具有非常强的肿瘤靶向性和较小的毒副作用,在肝、肾和脾等器官内,能被机体免疫系统完全清除。通过HE染色,初步推断该细菌在机体内主要以抗肿瘤微血管生成、诱发肿瘤部位炎症反应和产生抗肿瘤活性次级代谢产物等叁种作用方式达到抗肿瘤效果。通过吸附层析、离心、过滤、萃取、高效液相色谱、液质联用质谱和核磁共振等技术方法,从X.stockiae HN_xs01 72 h发酵培养液中分离纯化并鉴定了4种具有较高抗肿瘤活性的小分子次级代谢产物XS560、XS674、XS787和XS845,其中XS845为大环内酯类化合物,XS560、XS674、XS787为苯乙酰胺类衍生物,XS787抗肿瘤效果最强,对人类慢性骨髓瘤细胞K562半抑制剂量为1.5 μg/ml。
彭刘亮[7]2017年在《嗜线虫致病杆菌两种型态的某些生理特性和差异蛋白研究》文中研究说明嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophilus)(致病杆菌)是一种在病原线虫肠道内能与小卷蛾斯氏线虫互利共生的革兰氏阴性菌,因其能产生杀虫毒素、抑菌、抗癌等多种活性物质而倍受瞩目。其具有初生型和次生型两种型态。初生型致病杆菌(初生菌)极不稳定,在传代培养过程中容易转变成次生型致病杆菌(次生菌)。它们不仅形态不同,多种生理特性也存在很大差异,因而限制了次生菌在农业上的应用。本论文基于致病杆菌型态变异的特性对初生菌和次生菌的某些生理特性和差异蛋白做了研究。主要研究内容如下:1、致病杆菌的筛选和鉴定。从线虫幼虫、线虫成虫和侵染后的大蜡螟中筛选初生菌,发现从侵染后的大蜡螟中筛选初生菌是种最优的筛选分离方法,操作简便、菌落纯,效率高。而次生菌不仅可以从线虫成虫和侵染后的大蜡螟中筛选得到,而且还能在初生菌的多次传代培养过程中获得。形态学鉴定结果显示初生菌平均长度4-5μm,呈杆状,表面凹凸不平。16S rDNA鉴定结果表明目的菌株与X.nematophilusATCC19061的同源性达99%,表明成功筛选到目的菌株。2、致病杆菌的某些生理特性研究。研究制定了致病杆菌的生长曲线,研究了温度和pH对致病杆菌生长速度的影响,同时还对菌株生长过程中培养液pH值的变化、菌株形态变化以及糖利用情况进行了研究。结果发现温度和p H对初生菌的生长影响较大。当温度低于25℃或pH呈弱酸性时,其生长速度极慢。当温度高于25℃和pH呈中性或弱碱性时,初生菌生长比次生菌均晚8-16小时进入对数生长期,在培养24 h时后初生菌逐渐向次生菌转化,72 h时则已全部转化为次生菌。它们在生长过程中只能分解葡萄糖产生有机酸,而不能利用乳糖和蔗糖。3、初生菌和次生菌的差异蛋白研究。利用iTRAQ技术共检测到367种差异蛋白,其中除了其他学者研究过的Xcn蛋白和Xnph1蛋白外,初生菌蛋白质组中还发现了以下几种特异性蛋白:与抗菌性相一致的Xcn蛋白和Xnph1蛋白、与致病杆菌附着点相关的鞭毛蛋白、菌毛适配器蛋白、菌毛粘附素和荚膜合成调节元件B蛋白;多个代谢通路中起重要作用的谷氨酸合成酶;具有肿瘤药物耐药性、且对正常细胞和恶性细胞产生的细胞毒化合物具有防护作用的多药耐药蛋白。
杨君, 王勤英, 宋萍, 南宫自艳, 崔龙[8]2008年在《嗜线虫致病杆菌血腔毒素Tp40的纯化和特性分析》文中进行了进一步梳理【目的】嗜线虫致病杆菌是一种昆虫病原线虫共生菌,它能够产生多种杀虫毒素。本研究旨在从嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophila HB310菌株的细胞内纯化新的杀虫蛋白毒素,并对其进行基因克隆和序列分析。【方法】应用盐析和制备型非变性凝胶电泳等方法纯化蛋白,再通过对5龄大蜡螟幼虫血腔注射进行活性筛选。对获得的目的蛋白与已知蛋白进行同源分析,克隆出该目的蛋白的基因序列,从而进行相应的基因和氨基酸序列分析。【结果】本研究纯化的Tp40蛋白对大蜡螟LD50为68.54ng/头,其SDS-PAGE电泳图谱只显示出一条分子量约为42kDa的多肽。Western印迹分析表明Tp40与已知的Txp40为同源蛋白,并且仅存在于细胞内。编码该蛋白的基因开放读码框全长1107bp(GenBank登录号:EU095326),编码368个氨基酸残基,预测分子量为41.5kDa,等电点为8.66,与GenBank中的其余13株昆虫病原线虫共生菌所包含的相似基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列比较,同源性分别为85%～99%和70%～99%。【结论】Tp40蛋白具有很高的血腔杀虫活性,其基因序列具有较强的保守性,是昆虫病原线虫共生菌复合体杀虫过程中的一种关键因子。
陶科[9]2006年在《粘质沙雷氏菌杀虫蛋白的分离纯化及其基因的克隆与表达研究》文中指出蝗虫是一种主要的草地害虫，对我国农牧业的造成了极大的损失，我国目前控制蝗虫危害的手段主要是采用化学药剂来降低虫口密度，但是过度的使用化学农药对环境造成了相当的危害，迫切需要采用一些生物防治手段来作为替代。因此，蝗虫的生物防治技术应运而生，并日益受到重视。 本实验从蝗虫自然病死虫尸中分离纯化得到一较高毒性的病原菌HR-3，通过形态学观察、生理生化特征分析和分子鉴定将其鉴定为为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)，为细菌杀虫剂的研究开发提供了新的菌株来源。微生物杀虫剂由于所使用的病原微生物不同，其杀虫原理和机制有所不同，粘质沙雷氏菌HR-3的杀虫活性实验表明，其杀虫活性物质是存在于细菌上清液中的杀虫蛋白。将细菌发酵上清液进行Milipore超滤，除去40kDa以下和80kDa以上的蛋白，获得40-80kDa的杀虫粗蛋白。进一步经过硫酸铵分级沉淀，DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析，Sephacryl S-200凝胶过滤，获得电泳纯的杀虫蛋白。每升发酵液中可获得约10ml杀虫蛋白溶液，冻干可获得4.5mg活性蛋白，SDS-PAGE电泳和凝胶过滤实验表明该杀虫蛋白为单体，分子量约为60kDa。 粘质沙雷氏菌分泌的许多着名的胞外蛋白，分别为核酸酶、磷脂酶、溶血素、含铁细胞、几丁质酶、含铁细胞、蛋白酶、脂肪酶，其中的一种或几种蛋白有可能是杀虫活力因子。通过酶活检测结果表明，纯化的杀虫蛋白仅具备蛋白酶活性，杀虫蛋白应是一种蛋白酶。用EDTA和1-10-phenanthrolin可以抑制杀
薛仁风[10]2009年在《伯氏嗜线虫致病杆菌蛋白酶抑制因子基因的克隆、表达及生物活性的研究》文中研究表明天然的蛋白酶抑制因子(PI)是一类对蛋白水解酶有抑制活性的小分子蛋白质。它们能与蛋白酶的活性部位或变构部位结合,抑制酶的活性。昆虫体内存在着大量蛋白酶,在食物的消化等很多新陈代谢过程中起重要作用。昆虫摄食蛋白酶抑制因子后,导致其消化功能失调,生长发育受阻,易受环境中不利因素的影响,以至昆虫发育不正常甚至死亡。因此,蛋白酶抑制因子在农业害虫防治中具有十分重要的作用,本项研究应用基因工程手段,克隆了伯氏嗜线虫致病杆菌蛋白酶抑制因子基因,构建了高效重组表达载体,进行了重组蛋白的纯化及生物活性的研究,结果表明重组蛋白对桃蚜(Myzus persicae)、绿盲蝽(lygus lucorum Meyer-Dur)及白粉虱(Trialeurodes vaporariorum)都具有良好的防治效果,而且对哺乳动物细胞和植物本身没有不良影响。本实验取得如下研究结果:1参照Genbank中已知的蛋白酶抑制因子基因序列和ATG起始位点、TAA终止位点,设计合成了两条寡核苷酸引物,以伯氏嗜线虫致病杆菌BJFS-526菌株的基因组DNA为模板,进行聚合酶链式反应(PCR)扩增得到长度约为360bp的蛋白酶抑制因子基因片段,命名为Xbpi-1(Xenorhabdus bovienii protease inhibitor gene 1)。2将扩增出的目的片段插入pMD18-T Vector克隆载体获得重组质粒pT-PI。重组质粒经大肠杆菌转化后进行抗生素筛选,提取阳性菌落的质粒进行PCR检测和酶切鉴定,结果所得片段大小和目的片段一致。鉴定后的菌株送交北京叁博远志生物技术有限责任公司测序并进行blast比对分析。结果表明所克隆的插入片段长360bp,与预期设计的大小一致,同已知基因序列相似性达到78%。3设计合成两条5’端分别含有限制性内切酶NedI和XhoI酶切位点的寡核苷酸引物,以pT-PI为模板,进行PCR获得目的片段,将扩增出的目的片段插入pMD18-T Vector克隆载体获得重组质粒pT-PI-NX。重组质粒经大肠杆菌转化后进行抗生素筛选,提取阳性菌落的质粒进行PCR检测和酶切鉴定,结果所得片段大小和目的片段一致。将重组质粒pT-PI-NX和重组表达载体pET42a(+)经限制性内切酶NedI和XhoI双酶切,通过T4DNA连接酶,构建重组表达载体pET42a-PI,提取阳性菌落的质粒,酶切鉴定确定Xbpi-1基因已成功插入到表达载体中。4利用IPTG进行化学诱导并筛选最佳表达条件,使目的基因获得高效表达;对含有表达载体的大肠杆菌总蛋白进行电泳和Western blotting分析表明,外源基因获得高效表达,利用Ni SepharoseTM6 Fast flow(GE Healthcare)纯化柱进行纯化,以含有40mM咪唑的wash buffer上样,以含250mM咪唑的elution buffer洗脱,获得纯度较高的表达蛋白;将表达蛋白煮沸30min,没有明显改变蛋白的溶解度,说明重组表达蛋白是一种热稳定蛋白。5生物活性测定表明重组蛋白能明显抑制桃蚜和绿盲蝽的生长和发育,提高其死亡率,有效降低桃蚜繁殖数量,而且对绿盲蝽体内的蛋白酶活性具有明显的抑制作用,同时对温室中白粉虱也具有很好的防治效果,而对正常的哺乳动物细胞生长和植物本身蛋白酶活性没有影响。
参考文献：
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[3]. 嗜线虫致病杆菌血腔毒素的纯化及其致病机理的研究[D]. 杨君. 河北农业大学. 2008
[4]. 拒食蛋白XnAFP2功能结构域分析与作用机理初步研究[D]. 尹富仕. 中国农业科学院. 2010
[5]. Xenorhabdus budapestensis D43菌株杀虫蛋白的分离纯化及致病机理的研究[D]. 杨君. 安徽农业大学. 2012
[6]. 昆虫病原线虫共生菌的分离及其活性和肿瘤靶向性研究[D]. 张超. 湖南师范大学. 2012
[7]. 嗜线虫致病杆菌两种型态的某些生理特性和差异蛋白研究[D]. 彭刘亮. 湖南工业大学. 2017
[8]. 嗜线虫致病杆菌血腔毒素Tp40的纯化和特性分析[J]. 杨君, 王勤英, 宋萍, 南宫自艳, 崔龙. 微生物学报. 2008
[9]. 粘质沙雷氏菌杀虫蛋白的分离纯化及其基因的克隆与表达研究[D]. 陶科. 四川大学. 2006
[10]. 伯氏嗜线虫致病杆菌蛋白酶抑制因子基因的克隆、表达及生物活性的研究[D]. 薛仁风. 中国农业科学院. 2009