湘潭市中心医院湖南湘潭411100
【摘要】目的：探究miR210在皮肤慢性溃疡愈合中的作用。方法：选取我科皮肤慢性溃疡患者，取其溃疡组织进行细胞培养作为实验组，对照组为正常皮肤组织细胞，qRT-PCR法检测两组表皮细胞内miR210相对表达量的变化；利用RNA干扰技术沉默miR210基因，转染溃疡细胞，CCK-8试剂盒检测转染后细胞活性变化；结果：qRT-PCR法检测实验组细胞12h、24h、48hmiRNA-210相对表达量分别为1.2、1.7、2.9，与对照组相比差异具有显著性（P＜0.05）；miRNA-210基因沉默后转染细胞4h后，实验组细胞活力为0.75，转染6h后活力下降为0.63，与对照组相比差异具有显著性（P＜0.05）。结论：皮肤溃疡与miR210相对表达相关，且miR210沉默后能够抑制受损细胞的活性，促进溃疡修复。
【关键词】miR210；皮肤慢性溃疡；溃疡愈合；RNA干扰
随着人口老龄化趋势的增长，慢性皮肤溃疡发病率逐渐升高，临床上治疗周期长，难以根治，且复发率高，严重影响患者的身心健康，因此如何有效治疗慢性皮肤溃疡是当前的重要任务[1]。miRNA是一类皮肤调控因子通过与mRNA相结合调控相应基因的表达，在维持皮肤更新、功能平衡和皮肤损伤修复方面发挥着重要的调控作用[2]。miR210是一类缺氧相关miRNA，参与DNA损伤修复及细胞的增殖凋亡生理过程[3]。为研究miR210在皮肤慢性溃疡愈合中的作用，选取我科皮肤慢性溃疡患者溃疡组织20份作为研究对象，通过RNA干扰技术沉默miR210基因后检测miR210在皮肤慢性溃疡愈合的分子机制，为治愈皮肤慢性溃疡提供一定的理论基础。
1.实验材料
1.1研究对象
选取我院皮肤科皮肤慢性溃疡患者20人作为研究对象
1.2仪器与试剂
含10%小牛血清、双抗RPMI164培养基、胰蛋白酶购自于美国Hyclone公司；Opti-MEM、DMEM培养基购自于上海拓然生物科技有限公司；Lipofectamine2000细胞转染试剂购自于美国Invitrogen公司；2×SYBRGreenMix订购于Takara公司；CCK-8细胞增殖检测试剂盒购自于美国同仁公司；CO2细胞培养箱、订购于美国Thermo公司，CFX96Real-TimePCR仪购自于美国Bio-Rad公司。
2.方法
2.1细胞培养
采集患者表皮溃疡组织放入PBS溶液中，清洗3次，加入10%小牛血清的RPMI164培养基5mL，置于5%CO2培养箱内培养，当细胞贴壁生长数目达到80%，加入胰蛋白酶消化30min，小心吸取细胞液，加入新鲜DMEM培养基，800rpm离心5min，收集细胞，按照1：3的比例进行传代培养，第3代细胞可用于后续试验。
2.2qRT-PCR法检测细胞内miRNA-210表达
将收集后的细胞参照RNA提取和反转录试剂盒进行细胞RNA提取和反转录，miRNA-210荧光定量引物序列为：F：5'-CGCAAGGATGACACGCAAAT-3'R：5'-TTACCTAGCGTATCGTTGAC-3'，以GADPH为内参其序列为：F：5'-GGATGATGTTCTGGAAGAGCC-3'R：5'-AACAGCCTCAAGATCATCAGC-3'，反应体系：10uL2×SYBRGreenMix，上下游引物各1uL，ddH208uL，10×cDNA模板1uL。按照反应程序95℃3min，94℃10s、60℃20s，72℃2min，30cycles，72℃10min。利用CFXmanager3.0软件进行Cq值分析，以GADPH作为内参基因按照2-ΔΔCq算法进行基因相对定量表达分析。
2.3miRNA-210基因过表达后对细胞的抑制
根据miRNA-210基因序列设计其siRNA引物：F：5'-AATCTGTGCGTGTGACAG-3'，R：5'-TTACCTAGCGTATCGTTGAC-3'，将2.5uLsiRNA、1uLLipofectamine2000分别加入Opti-MEN培养基55ul中，静置5min，混匀加入溃疡组织细胞培养液中，反应20min后，分别转染4h、8h后，弃去转染试剂，加入完全培养基培养细胞。采用CCK-8试剂盒检测细胞活性，以未转染的正常细胞为对照，计算细胞相对增殖活力。
2.4统计学分析
采用SPSS18.0软件对实验所得数据进行处理分析，计数资料采用率表示，采用检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
3.结果
3.1qRT-PCR法检测细胞内miRNA-210相对基因表达
细胞培养后12h、24h后实验组细胞内miRNA-210相对表达量1.2、1.7，与对照组相比表达量有所升高，但差异不具有显著性（P＞0.05）；48h后miRNA-210相对表达量为2.9，表达量升高有显著性差异（P＜0.05）。结果表随着处理时间的加大，溃疡组织中细胞内miRNA-210基因相对表达量逐渐升高。见表1。
注：与对照组相比，*P＜0.05。
4.讨论
miR210属于miRNA皮肤调控因子中的一员，miRNA皮肤调控因子广泛参与机体细胞的增殖、分化、凋亡生命活动，此外研究发现miRNA在免疫调节、炎症反应也起到了重要的调控作用。Biswas研究证实在体内缺血性受损细胞内miR210表达上调，且受到HIF-1α的刺激后，miR-210基因相对表达量升高，抑制E2F3表达，使细胞无法从G1期进入S期，降低细胞增殖效率，受损组织恢复能力降低[4]。本文通过沉默miR210后转染溃疡组织细胞，结果显示，随着转染时间的延长，溃疡组织的增殖活力下降，这一现象可能与miR-210调控角质形成细胞的增殖修复受损伤口愈合相关。此外皮肤修复也与内皮细胞的增殖和毛细血管的形成相关，当受伤组织长期处于缺氧环境中，miR210表达量逐渐增加，抑制靶基因EFNA3的表达，加速皮肤基底层细胞毛细管的形成及上皮细胞的转移，促进伤口的愈合[5]。本研究通过细胞培养溃疡组织细胞，miR-210基因相对表达量比正常表皮组织中高，这一结果与以往研究结果相符合。
综上所述，皮肤慢性溃疡与miR210相对表达调控相关，miR-210基因能够一定程度上改善皮肤溃疡病灶细胞增殖，这一研究结果为进一步临床治疗慢性皮肤溃疡提供理论数据。
参考文献：
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