Meg8-DMR基因编辑小鼠生长发育指标及相关基因的表达研究

Meg8-DMR基因编辑小鼠生长发育指标及相关基因的表达研究

论文摘要

小鼠Dlk1-Dio3印记基因簇作为一个重要的印记簇,存在于12号染色体末端占基因组区域1Mb左右。含括父本表达蛋白编码基因Dlk1、Rtl1和Dio3,多种母本表达非编码RNA基因,此外还分布着大量的miRNAs及snoRNAs。这一印记基因簇在小鼠胚胎发育、细胞重编程和遗传性疾病的发生等过程起着重要作用,若区域内印记基因发生异常会致使生长发育紊乱,甚至死亡,故对此区域的研究非常重要。目前,Dlk1-Dio3印记基因簇内已发现的三个主要差异甲基化区:IG-DMR、Gtl2-DMR和Dlk1-DMR,都为父本甲基化。本实验室前期发现研究现命名为Meg8-DMR为此区域第一个母本甲基化的差异甲基化区,可能有重要的印记调控功能。本课题基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建的Meg8-DMR敲除鼠模型,初步探究Meg8-DMR对于区域内印记基因的影响。首先对课题组前期所获Meg8-DMR敲除的杂合子(Meg8-DMR+/-或Meg8-DMR-/+),纯合子(Meg8-DMR-/-),野生型(Meg8-DMR+/+)小鼠胚胎期相关生长发育指标进行观测分析表明,与野生型相比,Meg8-DMR的缺失对小鼠胚胎形态、体重及平均产子数未产生明显影响,但会导致一定比例的胎儿致死。Meg8-DMR单等位敲除小鼠自交,会导致子代小鼠野生型比率偏低(13.98%)。其次通过半定量及定量检测Meg8-DMR敲除对小鼠发育中后期E12.5胚胎及E15.5各组织中相关印记基因表达的影响,提示Meg8-DMR的敲除对区域内基因表达总体未产生明显影响,无统计学差异。但在Meg8-DMR母本敲除及Meg8-DMR亲本双等位敲除小鼠胚胎中,Irm的表达有显著上调趋势。最后通过SNP测序的方法检测Meg8-DMR敲除对于区域内主要印记基因的印记模式影响,结果显示,Meg8-DMR的缺失并不改变区域内主要印记基因Dlk1、Gtl2及Rian的印记模式。综上所述,Meg8-DMR的缺失未对小鼠胚胎形态体重等产生明显影响,但会导致一定比例的胎儿致死。在分子水平上,Meg8-DMR的缺失并不影响区域内主要印记基因的印记模式,也未对区域内印记基因表达量产生明显影响,只有同位于Rian内的Irm在Meg8-DMR-/+及Meg8-DMR-/-小鼠中表达量显著上调。研究提示Meg8-DMR可能作为Rian的调控区会明显调控邻近基因的表达量。本研究有助于了解Meg8-DMR在胚胎发育过程中的生物学功能,有助于进一步阐明Meg8-DMR的转录调控机制。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第1章 绪论
  •   1.1 课题来源和研究目的及意义
  •   1.2 表观遗传学与基因组印记
  •     1.2.1 表观遗传学
  •     1.2.2 基因组印记定义及特点
  •     1.2.3 印记基因作用
  •   1.3 基因组印记调控机制
  •     1.3.1 差异甲基化区的调控
  •     1.3.2 长非编码RNA的调控
  •   1.4 Dlk1-Dio3印记基因簇
  •     1.4.1 印记簇内印记基因简介
  •     1.4.2 印记簇内印记基因研究现状
  •     1.4.3 区域内已知差异甲基化区研究
  •   1.5 区域内新母本差异甲基化区Meg8-DMR研究进展
  •   1.6 研究内容及技术路线
  •     1.6.1 主要研究内容
  •     1.6.2 技术路线
  • 第2章 实验材料与方法
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 实验动物
  •     2.1.2 实验菌株及载体
  •     2.1.3 实验试剂与试剂盒
  •     2.1.4 主要实验仪器
  •     2.1.5 生物信息学网站及数据分析软件
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 Meg8-DMR敲除小鼠的繁殖
  •     2.2.2 小鼠胚胎及各组织的获取
  •     2.2.3 小鼠基因组提取
  •     2.2.4 小鼠基因型的鉴定
  •     2.2.5 小鼠基因型的测序验证
  •     2.2.6 小鼠胚胎及各组织总RNA的提取及反转录实验
  •     2.2.7 实时定量PCR
  •     2.2.8 印记分析
  •     2.2.9 统计学分析
  • 第3章 Meg8-DMR敲除小鼠胚胎相关生长发育指标观测分析
  •   3.1 引言
  •   3.2 Meg8-DMR敲除鼠的繁殖与鉴定
  •   3.3 Meg8-DMR敲除鼠胚胎形态及体重分析
  •   3.4 Meg8-DMR各基因型鼠交配后代胚胎遗传比例分析
  •   3.5 各合笼类型平均胚胎数及致死率统计
  •   3.6 讨论
  •   3.7 本章小结
  • 第4章 Meg8-DMR敲除对区域内印记基因表达量影响
  •   4.1 引言
  •   4.2 Meg8-DMR敲除对E12.5全胚胎中印记基因的表达量影响
  •     4.2.1 半定量检测E12.5胚胎及羊膜中各印记基因表达
  •     4.2.2 定量检测E12.5胚胎中各印记基因表达
  •   4.3 Meg8-DMR敲除对E15.5各组织中印记基因表达量影响
  •   4.4 甲基转移酶的检测
  •   4.5 讨论
  •   4.6 本章小结
  • 第5章 Meg8-DMR敲除对所在区域基因印记模式影响
  •   5.1 引言
  •   5.2 检索区域内印记基因SNP位点
  •   5.3 印记样品获取
  •   5.4 印记模式变化分析
  •   5.5 讨论
  •   5.6 本章小结
  • 结论
  • 展望
  • 参考文献
  • 附录
  • 致谢
  • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 潘雪

    导师: 吴琼

    关键词: 基因编辑小鼠,印记基因,基因表达

    来源: 哈尔滨工业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学,生物学,生物学

    单位: 哈尔滨工业大学

    基金: 国家自然科学基金面上项目(项目批准号 31771601)

    分类号: Q343.1;Q78

    DOI: 10.27061/d.cnki.ghgdu.2019.003594

    总页数: 70

    文件大小: 3205K

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