应用甜菜碱醛脱氢酶基因工程提高马铃薯抗逆性的研究

应用甜菜碱醛脱氢酶基因工程提高马铃薯抗逆性的研究

张宁[1]2004年在《应用甜菜碱醛脱氢酶基因工程提高马铃薯抗逆性的研究》文中研究表明干旱和盐碱是影响植物生长发育最主要的非生物胁迫因子,许多重要的农作物如水稻、马铃薯、烟草等对干旱和盐碱比较敏感,缺乏有效的耐旱机理,经常因干旱和盐碱造成严重的产量损失。培育抗旱耐盐农作物新品种是利用干旱盐碱地最为经济、有效的措施。随着现代分子生物技术的飞速发展,通过基因工程技术改良农作物抗旱耐盐性工作取得了很大的进展。高等植物适应环境胁迫的重要生理机制之一是渗透调节,甜菜碱是其中最重要的渗透调节物质之一。而且它的合成途径简单,对细胞无毒害,具有稳定酶和细胞膜结构,清除过氧化物等非渗透保护功能,被认为是最有希望的渗透调节物质之一。许多农作物如水稻、马铃薯、烟草、番茄等自身并不能积累甜菜碱,如果利用基因工程技术,把与甜菜碱合成相关的基因转入农作物,使其积累甜菜碱,将有可能达到增强农作物抗旱耐盐性的目的。迄今为止,已有不少植物被成功地导入了与甜菜碱合成相关的基因,并在不同程度上提高了这些植物的抗旱耐盐性。本研究的主要目的是从菠菜中分离合成甜菜碱的关键酶甜菜碱醛脱氢酶(Betaine aldehyde dehydrogenase,BADH)基因,从拟南芥中分离干旱、盐碱、低温及ABA诱导型启动子rd29A,构建CaMV 35S 和rd29A启动子驱动的BADH基因表达载体,然后转入优良马铃薯栽培品种中,提高其抗旱耐盐性。同时,研究不同启动子驱动的外源基因在逆境胁迫下高效表达的分子机理,为丰富植物转基因理论和培育抗逆作物新品种提供理论依据。取得的主要研究结果如下:1.从菠菜叶片中分离了BADH基因的cDNA,序列分析结果表明该基因含有1494 bp长度的开放阅读框,编码497个氨基酸。核酸序列同源性分析表明,该cDNA与已发表的菠菜BADH基因具有99.87%的同源性,与其它植物的BADH 基因也有80%以上的同源性。Northern杂交结果表明,BADH mRNA转录水平随盐浓度的增加而提高,经500 mmol/L NaCl持续处理4 d 时,BADH基因的转录约为对照水平的4倍。随着干旱胁迫天数的增加,菠菜叶片中BADH mRNA含量明显增加。这些实验结果表明菠菜BADH 基因的表达受盐胁迫和干旱胁迫的诱导。2.从拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组中用PCR技术分离了rd29A基因上游824 bp的调控序列,序列分析表明该片段与已报道的rd29A启动子有99.39%的同源性,包括缺水诱导表达元件DRE、ABA作用元件ABRE等顺式作用元件。将此片段与GUS基因连接构建了植物表达载体pBIrd,用农杆菌介导法获得了转基因马铃薯植株。对转基因植株进行的GUS基因Northern杂交和GUS活性组织染色的分析结果是一致的,未受诱导处理的转基因植株GUS基因有微弱表达,而逆境4℃低温、100 μmol/L ABA、缺水和250 mmol/L NaCl胁迫处理24 h均可诱导GUS大量表达,且rd29A启动子驱动的GUS基因表达无组织特异性。3.将BADH基因分别与组成型启动子CaMV 35S和逆境诱导表达型启动子rd29A融合,构建了植物表达载体pBIBB和pBIrB,通过冻融法导入根癌农杆菌LBA4404中,经酶切鉴定和PCR检测证明表达载体已导入农杆菌中。4.用组成型启动子CaMV 35S驱动的BADH基因表达载体pBIBB转化烟草,获得了卡那霉素抗性植株。经PCR、Southern、Northern杂交,证明BADH基因已整合到烟草基因组中并在转基因植株中转录和表达。对获得的转基因植株叶片中甜菜碱醛脱氢酶活性进行了测定,结果显示未转基因的对照植株没有BADH酶活性,转基因植株的各个株系间甜菜碱醛脱氢酶比活力差异较大,范围在0.1-1.0 U/mg之间,转BADH基因的烟草在盐胁迫和PEG条件下,生长状态良好,生长势强于未转基因的植株。说明本实验克隆的BADH基因能在异源植物中进行正常翻译表达。5.以两个马铃薯栽培品种甘农薯2号和Favorita的试管薯为供体材料,分别用组成型启动子CaMV 35S和逆境诱导表达型启动子rd29A驱动的BADH基因表达载体pBIBB和pBIrB进行遗传转化,获得了转基因马铃薯。通过PCR扩增和Southern杂交表明BADH基因已整合到受体马铃薯的基因组中。Northern杂交分析表明,未转基因的马铃薯对照中检测不到BADH基因的转录产物;转rd29A启动子驱动的BADH基因马铃薯中,BADH基因仅有微弱表达,在受干旱和NaCl胁迫的诱导时BADH基因才会较强地转录;但在转CaMV 35S启动子驱动的BADH基因马铃薯中,BADH基因的表达较强且不受胁迫条件诱导。6.BADH酶活性分析表明,在转CaMV 35S启动子驱动的BADH基因马铃薯中,各转化株系在胁迫前后BADH酶活性近似,但在不同的转基因个体间BADH酶活性差异较大,变化范围在2-11 U之间,而对照检测不到。BADH酶活性与叶片的相对电导率有一定的负相关关系(y=-3.7264x+57.898,r2=0.9202),说明BADH酶活性越强,对植株细胞膜通透性的保护能力越强,证明外源BADH基因的导入,确实提高了转基因马铃薯植株在干旱和盐胁迫条件下的抗性。在转rd29A启动子驱动的BADH基因马铃薯中,植株在未经胁迫时,BADH酶活性很低,但当转化植株分别经NaCl和PEG胁迫后,BADH酶活性显着提高,其活性值在10-12 U之间,而且株系间差异很小,表明转rd29A启动子驱动的BADH基因的不同马铃薯株系抗旱耐盐能力相近。7.对转基因马铃薯植株的形态学观察表明,转基因植?

卢军, 殷红, 张平[2]2012年在《甜菜碱的研究进展及其在烟草中应用前景分析》文中研究说明在外界干旱、低温、盐等逆境胁迫的情况下,某些植物能自身合成甜菜碱有效减轻植物受到的伤害。对于自身不能合成甜菜碱的植物,可以通过基因工程法或外源施入法促进体内甜菜碱的积累,从而达到同样的缓解伤害效应。笔者概述了甜菜碱的发现、生物合成途径、在植物中的应用研究进展,同时对甜菜碱在烟草作物上的研究现状、存在问题和应用前景进行了可行性评价分析,认为甜菜碱具有成本低、用量少、抗逆性强等特点,在烟草种植中已经具备了推广应用的潜力。

孟凤, 郁松林, 郑强卿, 刘冬冬, 王华磊[3]2008年在《甜菜碱与植物抗逆性关系之研究进展》文中研究指明甜菜碱是高等植物重要的渗透调节物质,在调节植物对环境胁迫的适应性,提高植物对各种胁迫因子抗性等方面具有重要的生理作用。本文综述了近几年来甜菜碱与植物抗逆境(水分、盐、温度、离子等)胁迫的关系和甜菜碱合成酶基因的转化在植物抗逆性中的作用等方面的最新研究进展,并指出了存在的问题和发展趋势。

高亚迪[4]2010年在《农杆菌介导的P5CS基因转化东农303马铃薯的研究》文中进行了进一步梳理干旱、盐碱、高温、低温等环境条件是影响植物生长发育的重要因素,这些非生物因素通过渗透胁迫(osmotic stress)影响植物细胞膨压从而导致植物的不良生长。在渗透胁迫下,植物将产生一些渗透调节物质抵抗该胁迫,包括脯氨酸和甜菜碱。脯氨酸主要来源于谷氨酸合成途径,△1-二氢吡咯-5-羧酸合成酶(Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase, P5CS)是脯氨酸合成的关键酶。为了提高我国马铃薯栽培品种对环境胁迫的适应能力,本论文实施了来自拟南芥的P5CS基因转化我国马铃薯栽培品种东农303的研究。首先通过不同植物生长调节剂组合的试验,优化了东农303马铃薯品种的高效再分化体系;其次采用农杆菌介导法将P5CS基因转化到马铃薯基因组中,并通过PCR、PCR片段BLAST、Southern blot检测,验证了目的基因已转入到马铃薯基因组中。另外,探讨了转基因植株在干旱和盐胁迫条件下的生长势和生理生化变化。1、分别利用马铃薯脱毒试管苗和薯块为试验材料,通过吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)、玉米素(ZT)、潮霉素(Hy)的不同组合优化了遗传转化体系。结果表明,最适再分化培养基为MS+ZT 3.5mg/L+IAA l.Omg/L,再分化条件中最适潮霉素筛选压力为6mg/L;最适生根培养基为1/2 MS培养基,生根潮霉素筛选压力为10mg/L。2、对潮霉素抗性株系进行了分子生物学检测。利用特异性引物进行了P5CS基因的特异性PCR扩增,获得了一条701bp的所需目的条带;将所获得的目的条带进行连接、转化、测序、BLAST比对,发现目的条带与拟南芥P5CS基因同源性为100%;分别用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ消化抗性株系和未转化株系的总DNA,通过进一步的Southern杂交实验,抗性株系获得一条阳性条带,推测P5CS基因在马铃薯基因组中有一个拷贝,最终获得了一个转基因株系。3、探讨了转基因株系在1.5% NaCl盐和60%、40%、20%干旱胁迫下的植株的生长势和生理生化变化。结果表明,转基因株系在叶片伸展度、根系的发达程度以及在结薯量上均优于非转基因株系。生理生化方面,转基因植株在盐胁迫时产生脯氨酸的含量比未处理时增加了25倍,是未转基因植株的1.7倍,MDA含量的增加仅为未转基因植株的0.4倍,SOD活性则是未转基因植株的2.6倍;在60%、40%、20%的干旱胁迫程度下,转基因植株脯氨酸含量分别是未转基因植株的1.2倍、1.4倍和2.1倍,转基因植株丙二醛含量的增加均是未转基因植株的0.6倍,转基因植株SOD活性分别为未转基因植株的2.5倍、2.8倍和5.6倍。以上试验结果表明转P5CS基因马铃薯的抗旱和耐盐性均得到了提高。

杨春霞[5]2007年在《南林895杨转抗旱耐盐基因研究》文中认为杨树在我国分布广泛,生长较快,适应性强,繁殖容易,并且其基因组小,在传统和分子操作上要比大多数树种简单,是林木育种研究的模式树种。DREB1C转录因子(Dehydration Responsive Element Binding)是一类与逆境胁迫相关的转录因子,它能够识别与干旱、高盐及低温等胁迫应答相关基因启动子区域中的DRE(dehydration responsive element)顺式作用元件并与之结合,从而启动下游抗逆基因的表达,提高植物的抗逆性。开展杨树抗干旱耐盐碱转DREB1C基因研究对于我国干旱、盐碱地区的造林绿化、扩大杨树的栽培区、改善生态环境等方面均具有重要的现实意义。本研究以南林895杨(美洲黑杨I-69×欧美杨I-45杂种F1中选育出的优良无性系)为受体材料,采用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法转化抗逆转录因子DREB1C基因;同时,同源克隆拟南芥逆境胁迫诱导性启动子rd29A,构建植物表达载体pDR2-rd29A并转化杨树,主要试验结果如下:1.根据NCBI上报道的rd29A启动子序列设计引物,从拟南芥中同源克隆rd29A启动子,构建植物表达载体pBrd,并转化烟草进行活性验证。转基因烟草的GUS组织化学染色及PCR分析结果表明,在低温、干旱及高盐等胁迫诱导下,rd29A启动子可增强GUS基因表达,表明rd29A启动子可应用于植物抗逆基因工程研究。2.构建由逆境胁迫诱导型启动子rd29A启动目的基因DREB1C表达的植物表达载体pDR2-rd29A,双酶切鉴定结果表明,rd29A启动子成功地插入载体pDR2中;采用液氮冻融法将载体pDR2-rd29A导入农杆菌LB4404中,菌液PCR扩增出目的条带,证明该植物表达载体pDR2-rd29A已转入农杆菌LB4404中。3.进行选择性抗生素潮霉素的敏感性试验,分别对叶片分化及生根本底浓度进行敏感性试验,结果表明,3mg/L潮霉素(Hyg)可作为芽再生的临界筛选浓度;1.5mg/L Hyg可作为芽生根的筛选浓度。4.用农杆菌介导法将由两种启动子(组成型启动子35S和逆境胁迫诱导型启动子rd29A)启动的目的基因DREB1C导入南林895杨中。经过潮霉素筛选,得到潮霉素抗性的转35S::DREB1C基因的杨树80株,转rd29A::DREB1C基因的杨树40株。抗性植株的PCR与实时定量PCR分子检测结果,转35S::DREB1C基因杨树有30株呈阳性,转rd29A::DREB1C基因杨树有15株呈阳性,初步证明外源目的基因DREB1C已经整合到南林895杨基因组中。5.对转基因杨树植株的形态学观察表明,两类转基因植株形态正常,没有发生畸形突变,即没有引起植株的矮化现象。在干旱和高盐胁迫下,两类转基因植株均能正常生长,其生长势优于未转基因植株。这表明两类转基因植株的抗旱耐盐能力均强于对照植株。

周陈力[6]2010年在《杨树转AtGolS2和SRK2C基因的遗传转化研究》文中指出非生物胁迫如干旱、极端温度和盐胁迫,严重影响林木生长和产量。我国有叁亿亩属于盐碱地,且干旱面积在不断增加,所以如何解决非生物胁迫是林木植物研究迫切需要解决的重要问题。AtGolS2基因(肌醇半乳糖苷酶基因)是拟南芥中GolS基因家族中的一员,受干旱和盐胁迫诱导。SRK2C基因是SnRK基因家族中的一员,SnRK(蔗糖非发酵相关蛋白激酶)通过多种复杂的信号传递途径对干旱、高盐、低温胁迫作出响应,激发抗逆基因表达,提高植物的抗逆性。本研究以南林895杨为材料,运用农杆菌介导法,开展了抗逆相关基因AtGolS2基因和SRK2C基因的遗传转化研究,主要研究结果如下:1.遗传转化中选择压的确定。本研究采用的筛选标记基因是潮霉素磷酸转移酶(hpt)基因,在遗传转化中采用潮霉素作为筛选转化植株的选择剂。经过分析比对试验,结果表明采用Hyg2.5mg/L作为筛选时的选择压。2.遗传转化体系的优化:分析比较了影响农杆菌转化的多个因素(预培养时间、菌液浓度、侵染时间、共培养时间等),获得杨树合适的遗传优转化条件:预培养3d,菌液浓度OD6000.8左右,侵染时间15~20min,共培养时间4d。3.通过遗传转化条件的优化及潮霉素筛选获得了一批转AtGolS2基因和SRK2C基因的南林895杨植株,并对转基因植株进行了分子生物学鉴定和耐盐性试验。4.分子生物学鉴定(包括PCR和RT-PCR分析)结果显示目的基因已经整合进杨树基因组中。耐盐性初步试验表明转基因植株耐盐性有一定提高。

朱晶莹[7]2011年在《转SsBHMT基因拟南芥的抗逆性评价和玉米S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因家族成员的表达分析》文中认为甲硫氨酸是一种必需氨基酸,哺乳动物体内不能自身合成,它的含量经常限制农作物的营养价值。甲硫氨酸除了在蛋白质合成和起始mRNA翻译中发挥重要作用外,也间接参与调节许多细胞代谢过程。在动物体内,甜菜碱在甜菜碱高半胱氨酸-S-甲基转移酶的催化作用下生成甲硫氨酸,目前植物中尚未发现此酶。在植物中,甲硫氨酸不仅是主要细胞代谢产物,而且作为S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)的底物合成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)。SAM是生物内主要的甲基供体,参与生物体内的初级代谢和次级代谢,如合成脂质、DNA、RNA、蛋白质、生物碱、植物甾醇类、叶绿素,木质素和软木脂等。因此本研究分析了转化SsBHMT基因拟南芥的抗逆性和玉米SAMS基因的表达,为研究植物体内甲硫氨酸的合成与代谢机制、提高植物的抗逆性提供理论依据。具体试验结果如下:1.转SsBHMT基因拟南芥的RT-PCR结果显示,3个样品均出现和预期结果一致的特异性扩增条带(1224bp),而非转化植株无扩增条带,表明SsBHMT基因在转化植株体内有效表达。2.甘露醇和盐胁迫条件下,转基因拟南芥的种子萌发率优于野生型。100mmol/L甘露醇胁迫下转基因型种子相对萌发率的平均值是野生型的1.6倍;100mmol/L NaCl胁迫下转基因型种子相对萌发率的平均值是野生型的2.6倍。正常条件和甘露醇胁迫下,转基因幼苗的主根长度大于野生型,侧根较多。干旱胁迫下,转基因拟南芥幼苗死亡率也显着低于野生型。叶绿素含量测定显示,盐胁迫下,转基因植株的叶绿素含量随盐浓度的增加始终高于野生型。另外,丙二醛(MDA)含量和超氧物歧化酶(SOD)活性测定表明,高浓度NaCl处理下的转基因拟南芥呈现出较高的SOD活性。随着NaCl浓度的增大,野生型植株的MDA含量呈现显着上升趋势,转基因植株呈现先上升后下降的趋势,这与SOD活性趋势相反。上述结果证明了SsBHMT基因的导入提高了拟南芥的抗逆性。3.玉米SAMS基因4个家族成员在正常生长和盐胁迫条件下都表达,对照根茎中的表达量大于叶中。SAMS1受盐胁迫后,茎中表达量降低,而叶中表达量略有增加,根中无明显变化。SAMS2和SAMS4受盐胁迫明显诱导。SAMS3似乎不受盐胁迫诱导,处理植株与对照株相比均无差异。4.亚硫酸氢盐法测定具有亲缘关系的玉米材料H04-36、Y52叶片中SAMS基因启动子区域的甲基化状态,分析结果显示H04-36和Y52的都未发生甲基化。

周祥明[8]2003年在《欧美杨等再生体系的建立及其抗逆境基因转化的研究》文中研究指明杨树是重要的工业用材树种。由于其基因组小,有性和无性繁殖容易,在传统和分子操作上要比大多数树种简单,所以它是林木基因工程育种的理想模式树种。本研究以我国现有的杨树优良品种(品系)欧美杨等为受体,采用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法对其进行抗逆基因(透明颤菌血红蛋白基因Vgb,大麦胚后期丰富蛋白基因HVA1和果聚糖合成酶基因SacB遗传转化,以期培育出抗逆境的基因工程杨树新品系。主要实验结果如下: 1.以5个杨树优良新品种为实验材料,分别对其建立了较理想的植株再生体系。其中,1~#欧洲黑杨(Populus nigra‘96/57’)杨树叶片诱导不定芽分化培养基:MS+BA(1.0mg/L)+NAA(0.05 mg/L),2~#欧洲黑杨(P.nigra)杨树叶片诱导不定芽分化培养基MS+BA(1.0mg/L)+NAA(0.5mg/L),5~#欧美杨108(P.×euramericana ‘Guariento’)杨树叶片诱导不定芽分化培养基MS+BA(1.0 mg/L)+NAA(0.05 mg/L),16~#陕林4号(P.deltoids cl. ‘Lux’×P.cathayana)杨树叶片诱导不定芽分化培养基MS+BA(1.5 mg/L)+NAA(0.12mg/L),17~#山青杨(P.canadensis cv. ‘Shanhaiguanensis’×P.cathayana)杨树叶片诱导不定芽分化培养基MS+BA(0.5 mg/L)+NAA(0.05 mg/L),1~#杨树生根培养基:1/2MS+NAA(0.02mg/L)+IBA(0.02 mg/L)。 2.通过卡那霉素抗性筛选试验,确定了5个杨树品种卡那霉素的选择压。其中,2~#杨叶片分化不定芽卡那霉素选择压为50mg/L,其余4种杨树卡那霉素选择压均为40mg/L;16~#杨生根卡那霉素选择压为20mg/L。 3.经PCR分子检测,获得呈阳性反应的转透明颤菌血红蛋白基因(Vgb)植株3个,并正在对其基因表达进行RT-PCR分析。 4.获得一批转大麦胚后期丰富蛋白基因(HVA1)和果聚糖合成酶基因(SacB)抗卡那霉素植株,正在进行PCR分子检测。

权瑞党[9]2003年在《农杆菌介导的玉米转化技术的改进及转betA基因玉米抗逆性分析》文中研究说明基因枪轰击法和农杆菌介导法是植物遗传转化的两大主流方法。农杆菌介导法与基因枪轰击法、电穿孔法、PEG法等其它DNA直接转移方法相比具有很大的优越性,例如可以转移大片段DNA,整合的外源基因拷贝数较少,并且基因重排频率较低。玉米作为一种单子叶植物不是农杆菌的天然宿主,农杆菌介导的玉米转化难度较大,其发展落后于农杆菌介导的双子叶植物的转化,目前玉米遗传转化的常用方法在大多数实验室仍为基因枪轰击法。尽管农杆菌介导的玉米模式种质A188自交系和Hi-Ⅱ杂交种(来源于A188×B73)的转化获得突破,建立了高效的转化体系,但是具有生产价值的玉米骨干自交系大部分难以通过农杆菌介导法转化。而且随着玉米分子生物学的发展,玉米基因组学研究也需要一种高效的玉米遗传转化方法。因此,建立农杆菌介导的玉米骨干自交系高效遗传转化体系不仅具有理论意义,而且具有重要的实用价值。 在本研究中,以农杆菌LBA4404侵染玉米骨干自交系齐319、掖515、掖502、DH4866等胚性愈伤组织,经过潮霉素筛选后由抗性愈伤组织再生植株,自交结实。研究发现,侵染时农杆菌悬浮液浓度、共培养时间、真空渗入处理、愈伤组织部分酶解和超声波处理等能影响转化率。 农杆菌悬浮液浓度OD_(600)0.5-0.7,侵染5 min,共培养3-4天,掖515和齐319胚性愈伤组织的转化率较高(约6%)。而增加或减少农杆菌悬浮液浓度,延长或缩短共培养时间,转化率均降低。原因可能是增加农杆菌悬浮液浓度使吸附在愈伤组织上的农杆菌数目增加,延长共培养时间使农杆菌增殖增加,但同时伴随着玉米愈伤组织死亡率的增加;而减少农杆菌悬浮液浓度,吸附在愈伤组织上的农杆菌数目减少,玉米细胞转化率下降;缩短共培养时间可能造成农杆菌不能有效完成T-DNA的转移和整合过程。 农杆菌侵染玉米胚性愈伤组织时,在50kPa下真空渗入5min,掖515和

骆业巧[10]2012年在《基因枪法介导OsCBF1、Mangrin基因小麦遗传转化研究》文中研究指明小麦是世界上主要的粮食作物之一,高盐、干旱和低温等非生物逆境影响了小麦的种植面积和产量。生物学对基因的研究和认识产生了转基因生物技术,就是利用重组DNA技术将克隆到的优良目的基因导入植物细胞或组织并培育成苗,外源基因并在其中进行表达,从而获得具外源基因控制的新性状的植物。利用转基因技术,选育抗旱、耐盐、抗冻的新品种小麦,已成为小麦品质改良的手段之一。在干旱、高盐和低温等逆境胁迫下,植物能感知、传递逆境信号,诱导相关功能基因的表达。其中转录因子在逆境信号的传递、调控相关功能基因表达等方面发挥重要作用。OsCBF1转录因子基因来源于水稻,属于AP2/EREBP家族转录因子,主要参与植物的抗旱、耐盐和低温的胁迫应答反应。转化抗逆功能基因也是提高植物抗逆能力的另一重要方面。Mangrin是来源于红树植物海莲的耐盐相关基因。该基因编码由265个氨基酸残基组成的蛋白质,这个蛋白质中从16位到86位的70个氨基酸组成了与LEA蛋白相似的富含丝氨酸区域。LEA蛋白的富含丝氨酸区域在植物逆境胁迫时起到保护细胞膜结构和蛋白质的作用。本研究以OsCBF1、Mangrin基因的cDNA构建表达载体YM7252、YM7262。以基因枪介导法,将OsCBF1、Mangrin基因转化到小麦中。通过对转基因植株后代的分子检测和抗逆性鉴定,筛选出具有良好抗逆性的转基因植株。期望能提高小麦的抗逆能力,获得抗旱、耐盐及抗寒的新品种。本研究获得如下结果:1.抗逆基因的小麦遗传转化(1)小麦基因型的差异是影响小麦组培苗再生的重要因素之一。在相同的实验条件下,虽然参与分化的宁麦13幼胚愈伤组织数小于参与分化的农33小麦愈伤组织,但宁麦13成苗数达115棵,农33未能成苗。(2)以相同基因型的宁麦13幼胚作为受体材料,转化不同基因的结果差异较小。转化OsCBF1基因共获得115株T0代植株,其中PCR初步检测为阳性的植株共9株,转化该基因的小麦幼胚分化率为6.65%,阳性转化率为0.52%;转化Mangrin基因共获得40株T0代植株,经PCR初步检验共鉴定出5株为阳性植株,转化该基因的小麦幼胚分化率为8.23%,阳性转化率为1.02%。2.转基因T1代植株的基因表达及抗逆性检测OsCBFl基因转化小麦幼胚共获得115株T0代植株,其中成活并收获种子的阳性植株共9株,通过RNA表达水平PCR检测,转化OsCBFl基因9株阳性植株中有7株基因得到表达。实时定量PCR结果表明,OsCBFl基因转化小麦后在T1代中的均有表达,但在不同的植株中表达量有差异。与对照组相比,转基因植株N13-CBF38、N13-CBF89的相对表达量在290倍以上,转基因植株N13-CBF55相对表达量约72.1倍,转基因植株N13-CBF105相对表达量约16.5倍,其它的转基因植株表达量约在3倍左右。T1代转基因植株的生理实验结果:(1)脯氨酸实验结果表明:转基因植株N13-CBF36、N13-CBF86,N13-CBF87, N13-CBF89, N13-CBF105脯氨酸含量显着高于对照组,说明转化的外源抗逆转录因子OsCBFl增加了小麦的抗逆性。(2)丙二醛实验结果表明:转基因植株N13-CBF38、N13-CBF55、N13-CBF87、 N13-CBF89和N13-CBF105在不同时段积累的丙二醛含量均显着低于对照组,说明转化的外源抗逆基因OsCBF1基因增加了小麦的抗逆性。(3)超氧化物歧化酶实验结果表明:转基因植株N13-CBF38、N13-CBF55、N13-CBF87和N13-CBF89的超氧化物歧化酶活性显着高于对照组,说明转化的外源基因增强了小麦的抗逆性。这几组转基因实验组测得的丙二醛含量也显着低于对照组,说明超氧化物歧化酶活性可能是影响丙二醛含量的因素之一。(4)过氧化物酶实验结果表明:植株N13-CBF38的过氧化物酶活性显着的高于对照组。其他组别的超氧化物酶活性与对照组相比差异不显着。3Mangrin功能基因转化小麦幼胚共获得40株T0代植株,经PCR初步检验共鉴定出5株为阳性植株,现种植于实验田中,有待进一步鉴定其阳性及抗性生理。

参考文献:

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应用甜菜碱醛脱氢酶基因工程提高马铃薯抗逆性的研究
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