畅文军[1]2004年在《苦荞过敏蛋白TB24kDa的原核表达纯化及免疫活性的鉴定》文中研究指明荞麦具有较高营养品质和药用价值，并富含多种生物活性物质，在防治现代文明病诸如糖尿病、高血压等心脑血管疾病和风湿性关节炎等方面有一定的功效。然而荞麦中含有的过敏性成份又使许多接触或食用它的人产生过敏症状。近些年来，一些国外的科学家对甜荞(common buckwheat CB)中的过敏成分进行了研究。但在苦荞(tartary buckwheat TB)过敏成分研究方面的报道却不多，有关苦荞过敏蛋白基因的重组表达和抗原决定簇的研究尚属空白。 TB24kDa蛋白是苦荞中的主要过敏蛋白，确定此蛋白中的抗原决定簇并对其进行免疫学和分子遗传学上的研究，将有助于了解过敏反应机制并为荞麦过敏症的免疫治疗和低敏品种的培育提供科学依据。本研究的目的在于表达重组的苦荞主要过敏蛋白(TB24kDa)，并对其进行纯化和免疫活性的测定，从而为进一步寻找其抗原决定簇奠定坚实的基础。 本实验以pQE-31为表达载体，M15为表达菌株，使用IPTG诱导，在37℃获得了以包涵体形式存在的表达产物。经Western Blotting检测，证明表达条带N端带有Histidine tag。使用8mol／L尿素初步纯化和进一步的Hitrap Chelating HP亲和纯化后，得到了纯度在90％以上的目的蛋白。对包涵体蛋白进行了透析复性和Ni~(2+)柱亲和固定复性，得到了可溶性的蛋白。 为了制备抗血清，用于检测重组蛋白的免疫活性，从苦荞种子中提取并纯化了天然的TB24kDa，并对小鼠进行了免疫。通过对小鼠血清IgE的检测，得到了可用于下一步重组蛋白免疫活性鉴定的小鼠抗血清。利用此抗血清，通过竞争ELISA检测重组蛋白的免疫活性，发现重组蛋白与IgE抗体有结合活性。
郭彦飞[2]2011年在《苦荞16kDa主要过敏原的原核表达纯化、免疫活性分析及转化拟南芥研究》文中进行了进一步梳理苦荞具有很高的营养价值和药用价值,其蛋白质、脂肪和纤维素都普遍高于其他粮食作物,而且它还含有其他作物所没有的叶绿素和生物类黄酮物质。然而,苦荞中过敏成分的存在大大阻碍了苦荞食品的开发利用。近年来,国内外的许多学者对甜荞中的过敏成分进行了广泛的研究,其中报道的比较多的是甜荞16kDa过敏原。甜荞16kDa过敏原是2S清蛋白家族成员,被认为是甜荞中的主要过敏原之一,其具有强的抗胃蛋白酶活性。也有文献报道,甜荞16kDa过敏原与过敏性休克相关。关于苦荞中的过敏成分,国内外的相关报道较少,目前鉴定出的大多是高分子量过敏性蛋白。本研究以苦荞种子发育期cDNA文库中分离筛选的EST序列(GenBank登录号为:GO496294)为基础,进行核酸序列分析及功能结构预测,结果显示该基因包含450bp的读码框(ORF),全基因编码149个氨基酸残基的分子量为17.2kDa的蛋白,N端具有19个氨基酸的信号肽。同源分析显示,其氨基酸序列与报道的甜荞16kDa过敏原具有83%的相似性。叁级结构和二级结构的预测结果都显示该基因编码的蛋白是由4个α-螺旋组成的紧凑结构。功能结构预测发现其编码蛋白具有α-淀粉酶抑制剂(AAI)结构域。抗原表位预测显示,其具有6个可能的线性表位。分别以全长基因(450bp/149aa)和去掉信号肽的部分基因(384bp/23-149aa)为编码框,分别构建原核表达载体pET47b-TBW16和pET47b-cTBW16,并转化大肠杆菌进行原核表达。结果显示,两个基因对应的蛋白(rTBW16和rcTBW16)都以包涵体的形式分别在大肠杆菌Rosetta gami 2(DE3)和BL21 star(DE3)中高效表达。分别对表达的蛋白进行包涵体纯化、复性研究及钴柱亲和层析纯化。包涵体复性过程中发现,与rcTBW16相比,rTBW16出现大量沉淀,复性效率低。用竞争性ELSIA分别对苦荞天然16kDa过敏原(ncTBW16)和rcTBW16进行免疫活性检测,结果显示ncTBW16和rcTBW16都具有较高的免疫活性。用两个荞麦过敏患者的血清和两个对照血清对苦荞种子总蛋白和重组rcTBW16分别进行IgE免疫印迹分析,结果发现,两个阳性血清在16kDa处都有杂交信号,证明该蛋白为苦荞16kDa的过敏原。该苦荞16kDa过敏原被国际免疫学会联盟(IUIS)过敏原命名小组委员会命名为Fag t 2.以rcTBW16为抗原制备了高效价的多克隆抗体。用所制备的多克隆抗体对苦荞种子总蛋白、清蛋白、球蛋白和HCl提取蛋白进行了Western Blotting分析。结果显示,苦荞16kDa过敏原存在于清蛋白中,说明它是2S清蛋白家族的成员。苦荞种子胚和胚乳样品的Western Blotting分析结果表明,苦荞16kDa过敏原只存在于胚中。利用PAGE结合Western Blotting检测、胶回收等技术从苦荞种子中分离出ncTBW16,并进行N端氨基酸测序以及质谱鉴定。结果表明,所测N端氨基酸序列与天然成熟的甜荞16kDa过敏原的N端序列完全相同,并且质谱鉴定结果也表明所分离的苦荞16kDa蛋白与重组蛋白完全对应。利用SDS-PAGE和ELSIA技术对复性的rcTBW16和ncTBW16的热稳定性进行分析发现,在中性条件下二者在100℃加热150min后仍然以可溶状态存在,并且仍具有94%的IgE结合活性。利用Satoru等人的方法对rcTBW16和ncTBW16进行了胃蛋白酶消化实验,结果表明,rcTBW16和ncTBW16具有胃蛋白酶抗性。此外,用3, 5-二硝基水杨酸法测定rcTBW16的α-淀粉酶抑制剂活性,结果显示rcTBW16没有明显的抑制α-淀粉酶的活性。构建了植物表达载体pBIN438-TBW16,并且通过农杆菌介导转化到拟南芥中。通过卡那抗生素筛选初步得到了阳性植株。
侯晓军[3]2003年在《苦荞过敏蛋白TB22kDa的cDNA片断克隆、原核表达及初步纯化》文中认为荞麦具有较高营养品质和药用价值，并富含多种生物活性物质，在防治现代文明病诸如糖尿病、高血压等心脑血管疾病和风湿性关节炎等方面有一定的功效。然而荞麦中含有的过敏性成份又使许多接触或食用它的人产生过敏症状。近些年来，一些国外的科学家对甜荞(common buckwheat CB)中的过敏成分进行了研究。但在苦荞(tartary buckwheat TB)过敏成分研究方面的报道却不多，有关苦荞过敏蛋白的基因克隆及表达调控的研究尚属空白。 TB22kDa蛋白是苦荞中的主要过敏蛋白，对此蛋白中抗原决定簇免疫学和分子遗传学的深入研究，将有助于了解过敏反应机制并设计抑制荞麦过敏蛋白的表达或使患者脱敏的方法。本研究的目的在于分离克隆苦荞中的主要过敏蛋白(TB22kDa)基因，并表达纯化出其结构基因编码的蛋白。从而为进一步研究过敏蛋白TB22kDa的结构与功能，寻找其中的抗原决定簇，探讨过敏原与其相应抗体相互作用机理提供依据。 本研究根据先前分离纯化所得天然TB22kDa蛋白经MALDI-TOF-MS(质谱法)测得的氨基酸序列和文献报道的过敏蛋白核苷酸序列设计引物，扩增克隆了该过敏蛋白结构基因的编码序列；根据测得的序列设计特异性引物，并利用3’-RACE方法结合巢式PCR扩增得到基因的3’末端；依据同源性比较的结果选用一段保守序列为5’引物，并根据结构基因内部序列设计3’特异性引物，进一步获得了该基因5’端的部分序列。已得到的基因序列长度为1311bp。从已有的5’部分序列到该过敏蛋白编码区为543bp，编码181个氨基酸。开放阅读框588 bp，包括编码区的585bp及一个终止密码，可编码一个由195个氨基酸组成的功能蛋白。3’端非编码区包括180个碱基，富含AT(70％)。 采用上述方法获得的TB22kDa核苷酸序列与甜荞过敏性贮藏蛋白及豆球类蛋白的同源性分别达到94％和90％；氨基酸序列与来自甜荞中的球蛋白，刀豆蛋白有93％-83％同源性。TB22kDa蛋白与已知过敏原氨基酸序列比较显示，其中183—188位的序列KEEEKE在不同过敏原中都有存在，推测可能为潜在的抗原决定簇。 目前，此过敏蛋白TB22kDa的结构基因与3’端基因序列已在GenBank登录，登录号为AY044918。来源于苦荞中的过敏蛋白基因序列在国内外尚属首次报道。 根据已知的序列设计特异性引物，PCR扩增TB22kDa蛋白编码区，并将其连接在表达载体pQE-31上，获得重组质粒pQE-31(H1-H2)。将此质粒转化E.coliM15感受态细胞，构建工程菌E.coli M15／pQE-31(H1-H2)，于37℃在LB培养基中培养至OD_(600)=0.5-0.7，加入IPTG至终浓度为0.5mmol／L诱导表达。SDS-PAGE分析表明，重组菌在分子量20-30kDa处出现一高表达蛋白条带，此诱导表达的蛋白在沉淀中以包涵体形式存在。对此表达蛋白变性处理后，经HiTrap~(TM) Chelating亲和柱初步纯化，纯度达90％。
参考文献：
[1]. 苦荞过敏蛋白TB24kDa的原核表达纯化及免疫活性的鉴定[D]. 畅文军. 山西大学. 2004
[2]. 苦荞16kDa主要过敏原的原核表达纯化、免疫活性分析及转化拟南芥研究[D]. 郭彦飞. 西北农林科技大学. 2011
[3]. 苦荞过敏蛋白TB22kDa的cDNA片断克隆、原核表达及初步纯化[D]. 侯晓军. 山西大学. 2003