李志梅[1]2003年在《联合应用神经保护剂对大鼠局灶性脑缺血后梗死体积和神经元凋亡及caspase-3蛋白表达的影响》文中指出目前缺血性脑血管病尚缺乏理想治疗方法。尽管溶栓治疗获得了很大进展，但仍有半数以上以上的患者在应用溶栓治疗后神经功能恢复不理想，且3-6小时的时间窗严格限制了其应用范围。大量研究证实决定缺血区域神经元命运的不仅仅是缺血，更重要的是取决于缺血后的一系列生化反应。脑缺血后神经元的死亡不但有坏死的过程，而且有凋亡的过程。在脑缺血急性期，神经元坏死与凋亡并存，细胞坏死位于缺血中心区，细胞凋亡主要出现在缺血半暗带；而在脑缺血的迟发性神经元死亡期，则以细胞凋亡为主。凋亡可能决定了最终梗死体积。细胞凋亡是在生理和病理条件下的一种主动死亡方式，是受细胞内基因和一些细胞外因子调控的生物学过程。caspase 家族作为特异性的死亡信号转导分子，被认为是凋亡的执行者。其中caspase-3是caspase级联反应中最关键的效应蛋白酶，被称为“杀手蛋白”。缺血后的级联反应决定了神经元的命运。主要涉及氧自由基的产生、兴奋性氨基酸的毒性作用、细胞内钙超载、能量代谢障碍及炎性介质的释放等机制。神经保护剂就是通过抑制上述异常的病理生理过程来达到保护细胞的目的。针对上述各缺血损伤环节的神经保护剂种类繁多，诸如自由基清除剂、兴奋性氨基酸抑制剂、钙拮抗剂、能量<WP=5>代谢支持剂、各种神经生长因子等。众多学者利用多种离体和在体缺血动物模型，应用各种单一神经保护剂均能够不同程度的减轻脑损伤。但令人困惑的是几乎所有的单一神经保护剂在动物模型有效而临床无效或效果很差，有的因严重副作用而限制了应用。这严重限制了神经保护剂的临床应用和治疗效果。缺血性脑损伤是一系列复杂的多因素过程，相互影响，互为因果，但又遵循一定规律。针对任何单一环节的神经保护治疗不可能完全、有效地阻断缺血性脑损伤的级联反应。因此神经保护剂的联合应用正逐步被认识和重视，主要是源于以下优点。首先作用于脑缺血损伤级联反应不同环节的神经保护剂联合应用能更有效地阻断级联反应，达到比任何单一神经保护剂更好的脑保护作用，这一点对于在目前任何单一神经保护剂均无确切临床效果的情况下尤为重要。其次，联合用药可以减少单一药物的有效剂量，降低与药物剂量相关的毒副作用。本课题选择能量制剂1，6-二磷酸果糖（FDP）、N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA）受体拮抗剂MK-801和自由基清除剂－N-乙酰半胱氨酸（NAC）联合应用，采用大鼠局灶性脑缺血模型，利用神经病理学、免疫组织化学、原位末端标记、Western印记等多种技术方法观察联合应用不同类型神经保护剂对大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）后梗死体积、神经元凋亡及凋亡蛋白caspase-3表达的影响。探讨其能否达到协同作用，有效地抑制级联反应，从而达到较单一保护剂更好的脑保护作用及其相关作用机制。为临床神经保护剂的应用开辟新途径。现将各部分研<WP=6>究内容概述如下。一．联合应用神经保护剂对大鼠局灶性脑缺血后梗死体积的影响研究目的 探讨神经保护剂联合应用对大鼠局灶性脑缺血后梗死体积的影响，旨在研究其对缺血性脑损伤是否有更好的保护作用。方法 月龄4～5个月的Wistar雄性大鼠。随机将大鼠分为对照组、FDP组、MK-801组、NAC组和联合组5组。各组又随机分为缺血6小时和24小时两小组，每小组动物为5只。用10%水合氯醛0.4ml/100g腹腔内麻醉，参照Longa等的线栓法统一栓塞大鼠右侧大脑中动脉，制备大脑中动脉闭塞（MCAO）模型。采用Zea Longa评分法，评分为0分和4分者均被剔除，随机补充，保证每组5只不变。各治疗组均于MCAO后0.5小时用药。FDP组： FDP (北京华靳制药)50mg/kg腹腔内注射；MK-801组：MK-801(美国sigma公司)1mg/kg腹腔内注射；NAC组：NAC(美国sigma公司)150mg/kg腹腔内注射；联合组：同时腹腔内注射FDP、MK-801、NAC，剂量不变;对照组腹腔内注射生理盐水1.5ml。将大鼠分别于缺血后6小时和24小时断头取脑，做2mm厚的冠状切片，用TTC染色观察联合疗法对缺血后6小时、24小时梗死体积的影响。结果 缺血后6小时对照组梗死体积为144.65±7.37mm3，各治疗组与对照组相比均有显着性差异（P<0.05），联合组(60.22±12.53 mm3)与FDP组(104.19±17.48 mm3)、MK-801组(94.29±8.94 mm3)和NAC组(99.39±14.16 mm3)相比亦有显着性差异(P<0.05)，而FDP组、MK-801组和NAC组之间无显着性差异<WP=7>(P>0.05)。缺血后24小时梗死体积增大。对照组梗死体积为179.23±22.58mm3，各治疗组与对照组相比均有显着性差异（P<0.05），联合组（81.32±13.66 mm3）与FDP（119.74±7.85 mm3 ）组、MK-801（111.14±6.56 mm3）组和NAC（120.81±13.59 mm3 ）组相比亦有显着性差异(P<0.05)，而FDP组、MK-801组和NAC组之间无显着性差异(P>0.05)。结论 联合应用不同类型的神经保护剂—能量制剂1，6-二磷酸果糖（FDP）、N-甲基-D-天门冬氨酸（NMDA）受体拮抗剂MK-801和自由基清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC），能明显缩小大鼠局灶性脑缺血后不同时间点（6h、24h）的梗死体积，与各单一用药组有显着性差异（P<0.05），证实联合应用不同类型神经保护剂对脑缺血有明显保护作用。二．联合应用神经保护剂对大鼠局灶性
任小巧[2]2003年在《老龄大鼠脑缺血/再灌注细胞凋亡及相关基因表达和脑脉通对其影响》文中指出缺血性脑血管病是老年人常见病，随着老年人口的增多及老龄化社会的到来，发病人数将进一步增加。其病理基础与缺血后引起的神经元坏死和迟发性神经元死亡密切相关。其治疗主要是溶栓、应用神经保护剂（包括谷氨酸拮抗剂、钙通道阻滞剂等）、外科治疗等，虽然取得了一定疗效，但因缺乏满意效果或安全性使其临床应用受到限制。新的神经保护剂正在试验中。中医认为正虚血瘀，浊毒内蕴是老年缺血性卒中发生的前提，肝风旋动，挟浊毒损伤脑络是老年脑缺血损伤的发展的关键；解毒降浊、益气活血法是治疗老年脑缺血/再灌注损伤的主要方法。而目前中医药、西医药及中西医结合方法防治缺血性脑血管病的实验研究中多以青年动物为对象，忽视了人类脑血管疾病中增龄因素的重要性。这对于探讨老年缺血性脑血管病病理生理特点及用于指导临床防治方面有一定的差距。因此，本课题以老龄大鼠脑缺血/再灌注后神经细胞凋亡的特征、细胞凋亡调控基因表达变化及其与中医气虚血瘀，浊毒损络的关系为研究的切入点,用“益气活血”、“解毒降浊”的脑脉通进行干预以阻断缺血损伤因果转换、恶势循环，保护神经细胞。采用大脑中动脉栓塞（线栓）致缺血3h、再灌注3 h、6h、12h、24h、72h为模型，用病理形态学、免疫组织化学法、免疫荧光法、分子生物学技术等实验方法，从整体、细胞、分子、基因表达水平上，动态观察不同时间点青年与老龄大鼠脑缺血/再灌注后神经细胞凋亡的特征及凋亡调控基因表达的异同,并进一步研究了脑脉通对老年脑缺血/再灌注后神经细胞凋亡及凋亡调控基因表达的影响。主要实验内容与结果如下。1 老龄大鼠脑缺血/再灌注后神经细胞凋亡特征及脑脉通的保护作用应用整体观察包括神经功能评分、脑组织含水量、梗塞面积等及一般形态学方法包括HE染色、尼氏染色、透射电镜,琼脂糖凝胶电泳等技术对比研究了老龄与青年大鼠脑缺血/再灌注后不同时间点整体和形态学变化特征的异同及脑脉通对其影响。结果发现老龄大鼠容易遭受缺血/再灌注损伤, 其损伤出现的时间早，损伤程度重,缺血损伤后梗塞面积大,其损害可随着缺血及再灌注时间的延长而加重,凋亡细胞数、凋亡小体呈现先少再多后少的变化规律，坏死细胞数随再灌注时间延长而增加。缺血性损伤发生不可逆时，在损伤中心区有坏死细胞增多,凋亡细胞减少，这些特征可能与增龄导致的细胞衰老有关。脑脉通中、大剂量可明显改善脑缺血/再灌注所致的神经元损伤，表现为改善神经功能、减轻脑组织含水量、缩小梗塞面积、减轻神经细胞损伤，保护神经元。其可能机理是合成自身修复所需的内源性蛋白，从而有利于神经元的修复；或可保护神经胶质细胞及血管内皮细胞，上调星形胶质细胞的活化状态,而有利于神经元的修复。这些作用可能与其益气扶正，解毒降浊的作用有关。2 老龄大鼠脑缺血/再灌注后神经细胞凋亡基因表达的变化及脑脉通对其调节作用。在取得上述结果的基础上，进一步应用免疫组织化学法、免疫荧光法、分子生物学等实验方法，动态观察了不同时间点青年与老龄大鼠脑缺血/再灌注后神经细胞凋亡调控基因表达的异同及脑脉通对其影响。结果如下。<WP=3>2.1 老龄大鼠脑缺血/再灌注后细胞膜Fas、Fasl的表达及脑脉通的作用 脑缺血后Fas、Fasl均在缺血后注定死亡的细胞上表达，以半暗带区表达最强，缺血中心区及周边区亦可见弱表达； Fas、Fasl均随再灌注时间的延长而表达增强。老龄大鼠Fas、Fasl表达的增强时间均较青年大鼠早，其高表达持续时间较长。脑脉通解毒降浊，可以下调Fas、Fasl的表达，从而抑制细胞凋亡的发生，其效果等同于尼莫地平。2.2 老龄大鼠脑缺血/再灌注后细胞浆Bcl-2、Bax的表达及脑脉通的作用老年脑缺血后Bcl-2可见弱阳性表达，但其表达无时间规律性。青年大鼠脑缺血后Bcl-2均呈全脑性的增高,以缺血损伤侧为强，并随着缺血时间的延长先升后降，至再灌注72h时与假手术组比较无明显差异，其与缺血后细胞凋亡成负相关。青年或老龄大鼠脑缺血/再灌注后诱发Bax持续表达, 其表达与细胞凋亡成正相关。老龄大鼠Bax表达的增强时间及高峰时间均较青年大鼠早，其高表达持续时间较长。Bcl-2是抑制凋亡的基因，Bax是促进凋亡的基因，表达Bcl-2的细胞其形态多正常，表达Bax的细胞其形态多异常。老年脑缺血再灌注后Bcl-2的低表达或不表达及Bax的早表达和高表达可能与增龄导致的内源性保护能力降低有关，从而使老年脑缺血后神经元损伤较青年大鼠重。脑脉通益气扶正，解毒降浊可以上调Bcl-2的表达，抑制Bax基因表达，对缺血神经元有保护作用。其对缺血前期的保护效应等同于尼莫地平，晚期的保护效应优于尼莫地平。2.3 老龄大鼠脑缺血/再灌注后细胞核caspase-3活性变化及脑脉通的作用Caspase-3是缺血后神经细胞凋亡的关键蛋白酶，其活性变化与缺血后神经元凋亡密切相关。 caspase-3的激活位于Fas、Fasl的下游。老龄大鼠缺血/再灌注后 caspase的激活早于青年大鼠。本实验显示应用脑脉通可降低脑缺血/再灌注后脑组织caspase－3的活性，说明脑脉通可能通过作用于caspase－3前酶或调节其上游基因的表达，抑制其激活；或直接抑制caspas
谭涛[3]2012年在《补阳还五汤对脑梗死急性期患者血管新生相关因子及MCAO小鼠蛋白芯片表达的影响》文中研究表明[目的]：观察补阳还五汤对脑梗死急性期患者的临床疗效及血清VEGF、Ang-1含量变化及MCAO小鼠蛋白芯片表达的影响,进而从血管新生方面阐述补阳还五汤的作用机理。[方法]：临床资料将90例入选病例随机分成对照组、汤剂组和超微组各30例,对照组按西医常规治疗,汤剂组在对照组基础上加服补阳还五汤汤剂,超微组在对照组基础上加用超微补阳还五汤,与治疗前及治疗后1d、7d、14d检测血清VEGF和Ang-1含量的变化,并从神经功能缺损积分,中医临床症候积分的改善分析评价疗效。同时选用SPF级小鼠20只,线栓法造模后分为模型组和补阳还五汤组,每组10只,模型组给予生理盐水3ml。补阳还五汤汤剂组给予补阳还五汤传统汤剂灌胃,2组动物喂养21天后断头取脑,进行细胞因子芯片检测。[结果]：治疗后叁组神经功能缺损积分较治疗前均有改善(P<0.05),汤剂组、超微组改善更明显(P<0.05)；治疗后对照组显效率为31.03%,总有效率为79.31%,汤剂组显效率为56.67%,总有效率为90.00%,超微组显效率为65.52%,总有效率为93.10%,叁组疗效比较,汤剂组、超微组优于对照组,汤剂组、超微组之间无差异。两组中医证候均有好转(P<0.05)；中医证候疗效,对照组显效率为31.03%,总有效率为79.31%,汤剂组显效率为56.67%,总有效率为90.00%,超微组显效率为65.52%,总有效率为93.10%,叁组疗效比较,汤剂组、超微组优于对照组,汤剂组、超微组之间无差异。对照组患者血清VEGF、Ang-1含量有下降趋势,治疗7d、14d后较治疗前降低(P>0.05),汤剂组、超微组患者血清VEGF、Ang-1水平在7d、14d均有提高(P<0.05)。实验资料显示与对照组比较,补阳还五汤组有4个细胞因子蛋白表达稳定下调,1个细胞因子蛋白表达稳定上调。[结论]：补阳还五汤能够明显降低脑梗死急性期患者的神经功能缺损积分及中医证候积分,提高临床疗效,与汤剂无明显差异。超微补阳还五汤能够显着增加并维持血液VEGF、Ang-1水平,与汤剂无明显差别。促进血管新生可能是补阳还五汤治疗脑梗死急性期的作用机制之一,补阳还五汤对脑梗死急性期患者血管新生相关因子的影响可能与细胞因子蛋白表达下调有关。
卢金华[4]2009年在《依达拉奉对大鼠脑梗死尿激酶溶栓后脑保护机制的探讨》文中研究说明目的通过研究依达拉奉对大鼠脑梗死尿激酶溶栓后基底膜纤维连接蛋白(fibronectin,FN)的表达及细胞凋亡的影响,探讨依达拉奉对溶栓后脑保护的可能机制。方法自体血栓栓塞法制备SD大鼠大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,缺血2h给予尿激酶进行溶栓。动物随机分为假手术组(Sham组)、生理盐水对照组(NS组)、尿激酶(urokinase,UK)溶栓组(UK组)、尿激酶+依达拉奉(edaravone,ED)组(UK+ED组)。利用TTC染色观察脑梗死体积变化;HE染色观察脑组织形态学改变。比色法测定脑组织中伊文思蓝(Evan’s blue,EB)含量,反映血脑屏障通透性的变化。利用免疫荧光法测定FN表达;TUNEL法测定凋亡细胞,免疫组化法检测Caspase-3的表达。结果1.UK组缺血侧脑组织病理学损伤较NS组有所改善;UK+ED组较UK组脑缺血组织病理学损伤进一步减轻。2.手术后24h,假手术组未见脑梗死组织;UK与UK+ED组脑梗死体积均较NS组缩小(P均<0.01 );UK+ED组又比UK组的梗死体积小(P <0.01)。3. UK+ED组缺血侧脑组织EB含量较UK组显着降低(P<0.01)。4.免疫荧光结果显示,FN在缺血组的表达均减弱(P均<0.01),以UK组减弱最为明显,UK+ED组减弱最轻,各组间差异有显着性(P<0.05)。5.sham组几乎未见凋亡细胞。NS组见大量凋亡细胞及caspase-3阳性细胞,与其它组比较均有统计学意义;UK组凋亡细胞数较NS组少;UK+ED组缺血侧脑组织TUNEL凋亡细胞数及caspase-3阳性细胞数均较UK组显着降低(P <0.01)。且缺血神经元的caspase-3表达增加,活性增高与TUNEL阳性细胞表达一致。结论1.尿激酶溶栓可使脑梗死体积明显缩小,联合应用依达拉奉脑梗死体积进一步缩小。2.FN可能参与溶栓后的脑缺血再灌注损伤。3.依达拉奉可能通过抑制基底膜损伤,减轻BBB破坏;同时通过抑制细胞凋亡,缩小脑梗死体积,从而达到脑保护作用。
许贤平[5]2010年在《LMO4/pCREB/pStat3在局灶性脑缺血再灌注大鼠中的表达及依达拉奉的干预研究》文中认为背景及目的：脑卒中具有高发病率、高死亡率、高致残率的临床特点,缺血性卒中为其主要类型,严重危害着人类的健康。脑缺血神经元死亡的分子机制特别复杂,目前已发现叁条主要的细胞通路与其有关,分别为谷氨酸受体的过度激活、氧化应激及细胞凋亡。LIM蛋白是一类包含有2个或以上LIM结构域的蛋白,LMO4为最近发现的核转录协作因子,属于LIM蛋白家族的一员,通过对转录因子的激活或抑制来调控其他蛋白的功能,在基因表达、细胞分化和发育、细胞骨架的形成中发挥重要作用。pCREB、pStat3也属于核转录因子,部分研究表明二者对脑缺血神经元损伤有保护作用。在脑缺血的细胞模型中,LMO4通过调节IL-6/Stat3细胞信号通路促进体外缺氧神经细胞的存活,而pCREB又可作为上游成分调节LMO4的转录活性。本研究拟在脑缺血再灌注模型中观察LMO4、pCREB、pStat3在缺血半暗带的表达变化及定位,并探讨LMO4与后两者之间的关系及其对脑缺血细胞存活的作用,为缺血性卒中脑保护药物的开发提供新的分子靶点。方法：健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠84只,随机分为假手术组及缺血再灌注1h、3h、6h、12h、24h、48h组,每组12只,6只用于分子生物学检测,余6只用于组织学实验。线栓法制备局灶性大脑中动脉闭塞(MCAO)模型,缺血2小时后恢复再灌住,以Longa5级标准评分法评价神经功能缺损,分别在各再灌注时间点处死动物。常规HE染色观察组织病理学改变；尼氏染色观察神经元的存活；Map2抗体染色观察神经元树突；TUNEL法检测缺血脑组织的凋亡细胞；免疫荧光检测、LMO4、pCREB、pStat3的在缺血半暗带皮层细胞的表达数量及部位；免疫荧光双标观察LMO4与Map2、pCREB、pStat3、TUNEL阳性细胞之间以及pCREB.pStat3与NEUN的共表达情况。RT-PCR法测定假手术组及再灌后不同时间点LMO4mRNA在缺血半暗带的表达水平；western-blot法测定假手术组及再灌后不同时间点LMO4和pStat3、pCREB叁分子在缺血半暗带中的蛋白表达水平。结果：①模型成功率为76.60%,死亡率为13.83%,主要死亡原因为蛛网膜下腔出血、脑水肿；脑组织TTC染色显示成功模型大鼠出现皮层和纹状体梗死,而假手术组大鼠未见梗死。②模型组HE染色可见典型的坏死灶、神经元丢失和组织水肿,梗死区细胞总数目呈减少趋势,假手术组细胞形态正常；③模型组尼氏染色可见细胞肿胀,尼氏体消失,缺血半暗带皮层区存活神经元数目随再灌时间逐渐减少(P<0.05),48小时最低(P<0.01),假手术组神经元形态正常；④模型组树突长度变短,直径变小,缺血半暗带皮层区MAP2阳性细胞OD值随再灌时间逐渐减少,48小时最低(P<0.01),假手术组神经元树突形态正常；⑤TUNEL阳性细胞主要分布在梗死周围区,凋亡细胞数再灌后6小时开始增多(P<0.05),24小时达高峰,一直持续到48小时(P<0.01)；⑥与假手术组比较,缺血侧半暗带皮层组织LMO4mRNA水平再灌后3小时开始升高,24小时达高峰,48小时明显下降(P<0.05或P<0.01)；⑦与假手术组比较,缺血侧半暗带皮层组织LMO4蛋白水平再灌后3小时开始升高,24小时达高峰,48小时明显下降,pCREB、pStat3蛋白水平6小时开始升高,24小时达高峰,48小时逐渐下降(P<0.05或P<0.01)；⑧与假手术组比较,LMO4、pCREB、pStat3阳性细胞数再灌后6小时开始升高,24小时达高峰,48小时显着下降(P<0.05或P<0.01)；⑨免疫荧光双标显示LMO4和pCREB仅表达于神经元,pStat3在神经元和胶质细胞均可表达；LMO4主要表达于细胞核,少量位于细胞浆,pCREB和pStat3仅表达于细胞核；在缺血半暗带皮层区,LMO4与TUNEL阳性细胞呈分离表达,LMO4与pCREB完全共表达,而与pStat3部分共表达。结论：①脑缺血再灌后诱导LMO4、pCREB及pStat3表达升高,并呈动态变化趋势,可能为神经细胞对缺血再灌注损伤的一种内部适应性保护机制。②LMO4可能通过与pCREB之间的相互作用及调节pStat3性来促进缺血神经元的存活。背景及目的：依达拉奉是一种合成的新型自由基清除剂和抗氧化剂,可改善脑缺血后引起的神经功能缺损,并且对迟发性神经细胞死亡也有抑制作用。依达拉奉对脑缺血的保护作用较为明确,但其具体的分子机制尤其是抗凋亡的机制并不十分清楚。凋亡为一种基因调控的细胞程序性死亡,而LMO4作为核转录协助因子可调节基因的表达。LMO4基因敲除小鼠出现各种发育障碍,提示其对上皮细胞及神经细胞的抗凋亡作用。本研究拟进一步探讨依达拉奉对脑缺血的保护机制及初步探讨其对LMO4表达的影响。方法：健康成年雄性SD大鼠36只,随机分为假手术对照组(n=12)、脑缺血模型组(n=12)及依达拉奉治疗组(n=12)。以线栓阻断一侧大脑中动脉构建局灶性脑缺血模型,缺血2小时后恢复再灌住,再灌注24小时后处死动物,药物组在脑缺血再灌注后即刻腹腔注射依达拉奉3mg／kg,模型组注射等量的生理盐水。常规HE染色、尼氏染色观察病理学改变并评价神经元的存活;TUNEL法检测缺血侧脑组织的凋亡细胞；RT-PCR、western-blot、免疫荧光检测叁组缺血半暗带皮层LMO4蛋白和mRNA的表达水平,并进行组间比较。结果：①假手术组细胞形态基本正常,模型组和药物组均有细胞坏死,但后者程度减轻,形态正常的细胞数较前者增多(P<0.01)；尼氏染色示缺血半暗带皮层存活神经元数目药物组较模型组显着增多(P<0.05)：②假手术组几乎无TUNEL阳性细胞,模型组和药物组梗死周围皮层均可见TUNEL阳性细胞,但后者明显减少(P<0.01)；③假手术组有少量LMO4mRNA和蛋白的表达,模型组皮层半暗带区较多LMO4mRNA和蛋白的表达,与模型组比较,药物组表达水平显着提高(P<0.05或P<0.01)；④假手术组可见少量LMO4阳性细胞,模型组缺血半暗带皮层可见大量LMO4阳性细胞,与模型组比较,药物组LMO4阳性细胞数更多(P<0.01)。结论：依达拉奉促进LMO4的表达升高,可能是其脑保护作用机制之一。
王琨[6]2016年在《硒代胱氨酸及其衍生物的抗脑胶质瘤机理及神经保护机制研究》文中指出人脑胶质瘤来源于神经上皮组织,是颅内原发性肿瘤中最常见的类型,近年来呈患病率增高及患者年轻化的趋势。脑胶质瘤侵袭性强,常通过侵袭血管壁及胶质细胞间的连接来浸润、压迫和破坏脑组织。由于其与正常脑组织分界不清,手术难以彻底切除,术后极易复发。而其对放疗及化疗的敏感性均欠佳,故患者预后差,死亡率高。目前脑胶质瘤的治疗仍然是一个难题,对人类生命健康造成严重威胁,因此,寻找更好的抗胶质瘤药物具有十分重要的意义。糖尿病最易并发脑血管病变,持续的高血糖引发严重的神经毒性,使患者神经功能受损,预后不良。据统计,糖尿病合并脑缺血患者的病残率、复发率及死亡率均显着高于非糖尿病脑缺血患者,给社会和家庭带来沉重负担,已成为目前严重危害公民健康和生命的重大公共卫生问题。此外,即使无糖尿病,缺血性脑卒中后患者血糖水平也常常会升高,加重脑损伤。《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2014))指出：“约40%的患者存在卒中后高血糖,对预后不利。”因此,除了降血糖外,迫切需要有效措施抑制高血糖毒性,改善神经病损,促进神经功能恢复,进而提高临床治疗效果。脑卒中是人类灾难性疾病,具有高发病率、高死亡率和高致残率等特点,是世界范围内死亡和长期致残的叁大原因之一,同时也是世界上单病种导致成人后天功能障碍的首位原因。2008年第叁次全国死因调查表明,脑卒中已跃居为我国人口死亡原因的第一位；在各种原因所致死亡中,我国死于脑卒中的构成比是欧美发达国家的4-5倍。脑缺血再灌注损伤机制复杂,氧化还原平衡的破坏是其重要的病理特征。因此,探索高效的抗氧化神经保护剂对脑缺血再灌注损伤的改善及治疗具有重要的研究意义和临床价值。硒是人体必需的微量元素,对人体生命活动必不可少,可发挥抗氧化、抗肿瘤、提高免疫力、拮抗重金属等多种作用。已证实,硒对维持正常神经功能发挥有重要作用；而硒缺乏可影响神经认知功能及导致神经退行性变,如阿尔茨海默病、帕金森病。大量临床及动物研究证据显示,高剂量的硒能加剧氧化应激,通过诱导活性氧族物质(reactive oxygen species, ROS)的累积诱导氧化损伤,发挥促凋亡的功效；而低剂量的硒则具有拮抗氧化应激、抑制细胞凋亡的作用。故人们常常采用高剂量硒作为肿瘤化疗制剂,诱导肿瘤细胞周期阻滞,甚至凋亡,以达到抑癌、抗癌目的；而采用低剂量硒作为细胞保护剂,对抗机体内的氧化应激损伤。硒代胱氨酸(selenocystine, SeC)是自然可获取的小分子有机硒化合物,被称为人类第21个必需氨基酸,因其多重药理学功效得到广泛应用,尤其是其对氧化还原通路的调节引起众多研究者的高度关注。3,3’-二硒二丙酸(3,3'-diselenodipropionic acid, DSePA)是SeC的衍生物,性质稳定、安全性高,具有高效的抗氧化活性,广泛用于抗氧化研究,在体外和体内实验中对急性神经毒性和慢性神经退行性病变均表现出保护效果。据报道,硒缺乏可大大增加机体患癌风险,而补充硒可降低某些癌症的发病率。SeC具有广谱的抗肿瘤活性,可通过诱导凋亡在体内、外抑制多种人类肿瘤细胞生长,如肝癌、肺腺癌、乳腺癌及黑色素细胞瘤,具有潜在的临床应用价值。近几年研究还发现：硒化合物联合抗肿瘤药物一起使用,可增强抗肿瘤药物的敏感性,即硒化合物可作为肿瘤化疗的增敏剂。然而,SeC是否对脑胶质瘤细胞的生长具有抑制作用,其机制如何,目前尚未见有报道。大脑属于高耗氧器官,神经元对葡萄糖的高消耗必然伴随自由基的大量产生；而高血糖会破坏细胞内的抗氧化酶系,削弱其清除能力,使大量自由基无法被及时清除。持续高血糖可影响和破坏线粒体内膜,启动线粒体膜电位耗散,导致大量自由基外泄。过多自由基的沉积,会氧化质膜,破坏神经突触,扰乱神经元之间的连接,甚至导致神经元凋亡。实验证实,拮抗高血糖诱导的氧化应激损伤可明显减弱神经损伤／毒性,改善神经病变。然而,有机硒是否对高糖诱导的神经毒性有拮抗作用,其机制如何,目前尚未见有报道。急性缺血性脑卒中发作中,脑缺血再灌注损伤的病理机制复杂,氧化还原平衡的破坏是其重要的病理特征。氧化应激通过ROS超载导致脂质过氧化和DNA损伤,在缺血再灌注脑损伤中发挥关键作用。因此,探索高效的抗氧化神经保护剂对脑缺血再灌注损伤的改善及治疗具有重要的研究意义和临床价值。而硒对脑缺血再灌注的直接保护作用,尚未见有研究报道。故本课题开展了在神经系统疾病方面,SeC及其衍生物DSePA的作用研究,探讨有机硒对脑胶质瘤、高糖神经毒性、缺血性脑卒中的作用效果及机理。首先,本研究选取了人脑胶质瘤细胞系U251、U87为研究对象,研究SeC对U87和U251细胞周期的影响,同时从影响肿瘤信号转导通路的重要信号蛋白MAPKs和AKT入手,分析其可能的作用机制,为人脑胶质瘤的治疗提供实验依据。其次,本研究选取PC12细胞作为神经细胞模型,选用DSePA对高糖诱导的毒性损伤进行干预,探讨其对高糖神经毒性的拮抗作用。最后,本研究构建了短暂性局灶性脑缺血再灌注(transient focal cerebral ischemia/reperfusion injury, tFCI/R)损伤小鼠模型,以SeC进行干预,探讨其对缺血再灌注损伤的保护作用及机制。目的1.探究SeC对U251、U87两种人脑胶质瘤细胞系的生长抑制效果,并探讨其潜在的分子机制。2.探究DSePA在PC12细胞中对高糖诱导神经毒性的拮抗效果及机制。3.探究SeC对tFCI/R损伤小鼠的保护功效及机制。方法1.取对数生长期U251和U87细胞体外培养,待细胞贴壁后随机分为正常对照组、各剂量SeC用药组。分别以5、10、20μM的SeC处理24 h或48 h。使用相差显微镜观察各组细胞形态学变化；采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定细胞生存率,了解SeC对U251和U87细胞生长的抑制；应用流式细胞术分析SeC对U251和U87细胞周期分布的影响；TUNEL-DAPI法观察SeC对U251细胞DNA的损伤情况；采用DCFH-DA探针和超氧阴离子试剂盒检测ROS和超氧阴离子的产生；Western blotting检测SeC对U251中细胞周期调控相关蛋白Cyclin A,细胞凋亡相关蛋白p21、p53及细胞内相关信号通路的蛋白水平(MAPKs及AKT)的影响。同时,应用SeC联合多种通路蛋白抑制剂研究其对细胞周期分布的影响。2.取对数生长期PC12细胞体外培养,待细胞贴壁后随机分为正常对照组、DSePA用药组,100 mM葡萄糖处理48 h制作高糖损伤细胞模型,加入DSePA进行干预。采用流式细胞分析技术及TUNEL-DAPI共染色观察细胞凋亡情况;检测caspase-3/-8/-9活性,结合Western blotting结果确定凋亡路径；通过JC-1探针评价线粒体膜电位,Mito-tracter与DAPI共染色检测线粒体结构改变,MitoSOX染料检测超氧阴离子；采用DCFH-DA检测细胞内ROS水平,并加入ROS清除剂进一步证实氧化损伤的作用；使用Western blotting法检测相关蛋白表达。3.手术制作tFCI/R小鼠模型,通过多普勒血流监测和神经功能缺损评分筛选手术合格的小鼠,随机分至SeC治疗组(SeC)和溶媒对照组(Vehicle),同时设假手术对照组(Sham,小鼠经历手术全程而不进行大脑中动脉阻塞)。SeC组小鼠给予术后连续3日,每日1次腹腔注射SeC溶液(2 mg/30 g),Vehicle组和Sham组小鼠给予同样方式注射等量生理盐水。于术后24、48、72 h各进行一次神经功能缺损评分及神经行为学测试；手术3天后行TTC染色测脑梗死体积,干-湿重法测脑水肿程度变化,免疫荧光染色观察AQP4表达情况,TUNEL-DAPI染色观察神经元凋亡情况,Western blotting检测活性caspase-3和活性caspase-9表达。结果1.MTT结果显示,SeC时间/剂量依赖性地抑制了U251和U87细胞的生长,镜下观察可见细胞变圆,突触减少,细胞数目明显减少,与正常细胞相比,差异具有统计学意义(P<0.05)；流式细胞术结果表明SeC处理诱导了明显的U251和U87细胞S期细胞周期阻滞,这与cyclin A蛋白表达下调相一致；TUNEL-DAPI分析和ROS检测结果显示,SeC处理导致了ROS升高诱导的U251细胞DNA损伤；Western blotting结果表明,SeC处理显着上调了DNA损伤标志物p21和p53的表达,并引起pJNK、p38、pERK的表达上调和pAKT的表达下降。2. DSePA的预处理可有效减弱高糖对PC12细胞的毒性作用。流式细胞技术检测到,DSePA预处理可显着抑制高糖诱导的PC12细胞凋亡,表现为sub-G1峰的降低；荧光染色技术结果表明,DSePA预处理可有效抑制高糖诱导的染色质的断裂和核浓缩。caspases活性检测显示DSePA抑制了高糖诱导的caspases活性,Western blotting术从蛋白水平检测发现,高糖诱导的PARP切割和caspase-3/-7/-9激活被DSePA预处理显着抑制；线粒体膜电位及结构检测证实,DSePA阻断了高糖诱导的线粒体损伤。DSePA抑制了PC12细胞中高糖诱导的超氧阴离子产生和ROS累积。3. tFCI/R术后24、48、72 h神经功能缺损评分与神经行为学测试表明,随时间延长,所有小鼠神经功能损伤及感觉运动功能障碍均得到一定程度的改善,而SeC治疗组改善显着,与Vehicle组相比有统计学差异；SeC治疗组在手术3天后脑梗死体积和水肿程度上较Vehicle组均有明显降低,AQP4的表达比Vehicle组显着降低,表明SeC明显缓解了脑组织的梗死和水肿；TUNEL-DAPI染色、Western blotting结果表明,SeC处理显着下调了caspase-3和PARP的裂解,从而抑制了神经元凋亡。结论1.SeC剂量/时间依赖地抑制人脑胶质瘤细胞的增殖,其分子机制为通过调节MAPKs和AKT信号通路诱导人脑胶质瘤细胞S期阻滞。2.DSePA可通过抑制氧化应激诱发的细胞凋亡,拮抗高糖神经毒性,有望成为拮抗高糖诱导神经系统疾病的高效策略。3.腹腔注射SeC对小鼠脑缺血再灌注损伤确有保护功效,主要是通过抑制水肿,抵抗氧化作用诱导的神经元凋亡。
赵建华[7]2007年在《热休克蛋白-70在脑缺血预处理诱导脑缺血耐受中的作用及其机制的实验研究》文中研究说明第一部分大鼠局灶脑缺血预处理诱导脑缺血耐受和HSP70的表达目的研究局部脑缺血预处理(ischemic preconditioning[PC])、HSP70的表达和对随后发生的局灶脑缺血的保护作用。方法应用改进的Longa’s法,建立大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)的局部脑缺血预处理诱导脑缺血耐受(ischemic tolerance[IT])模型。MCAO20min作为PC,分别在再灌注12h、1d、3d、5d、7d、14d后造成永久性MCAO(PMCAO)并与未行PC的假手术组对照。检测以下指标: TTC染色测量梗死体积;神经功能缺失评分;HE染色观察组织结构变化;同时应用原位杂交、免疫组织化学染色和RT-PCR、Western blotting观察PC后HSP70表达的变化。每小组动物5只。结果PC组1d、3d、5d、7d与未行PC组比较,PMCAO后24h脑梗死体积明显减小(P<0.01),神经功能缺损明显减轻(P<0.05);PC后不同时间点与假手术组比较缺血区HSP70mRNA(12h、1d、3d、5d)(P<0.01)和蛋白(1d、3d、5d、7d)的表达明显增加(P<0.05)。结论PC可以充分诱导其后1~7d的脑缺血耐受,同时PC诱导HSP70表达,可能与缺血耐受的产生有关。第二部分HSP70在脑缺血预处理诱导脑缺血耐受中的作用和对细胞凋亡的影响目的探讨HSP70蛋白合成在脑缺血预处理(PC)诱导脑缺血耐受(IT)中的作用和对细胞凋亡的影响。方法应用改进的Longa’s法建立大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)的局部脑缺血预处理诱导脑缺血耐受(IT)模型。MCAO20min作为PC, PC后24h给予永久性MCAO(PMCAO),并与未进行PC假手术组比较。免疫印记(Western blotting)法测量PC24h后HSP70的变化,TUNEL法、流式细胞仪(flow cytometry,FCM)检测大鼠前脑皮质细胞的凋亡;同时观察在PC前或PC后PMCAO前给予蛋白合成抑制剂放线菌酮对PC后24h HSP70、PMCAO后24h脑梗死体积、神经功能评分和细胞凋亡的影响。每组动物5只。结果PC组PMCAO后24h脑梗死体积明显减小(P<0.01),神经功能评分降低(P<0.05)、细胞凋亡数和凋亡率降低(P<0.05);PC前给予放线菌酮消除了以上影响,但在PC后较长时间而在PMCAO之前给予则没有以上影响;HSP70在PC后1d明显表达,而在PC前30min给予放线菌酮抑制了HSP70的表达(P<0.05)。结论HSP70的合成在PC诱导脑缺血耐受中发挥重要作用,可能是通过抑制神经细胞凋亡实现的。第叁部分HSP70在缺血预处理诱导脑缺血耐受中抑制细胞凋亡的机制目的探讨HSP70在缺血预处理诱导脑缺血耐受中抑制细胞凋亡的机制。方法应用改进的Longa’s法建立大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)局部脑缺血预处理诱导脑缺血耐受(IT)模型。MCAO20min作为PC, PC后24h给予永久性MCAO(PMCAO),并与未进行PC假手术组比较。免疫组织化学和免疫印记(Western blotting)法测量PMCAO24h后c-fos、bcl-2和caspase-3的变化,同时观察在PC前给予蛋白合成抑制剂放线菌酮对c-fos、bcl-2和caspase-3的影响。结果PC-PMCAO组PMCAO后24h c-fos、bcl-2表达增加,caspase-3表达减少,与假手术(SS-PMCAO)组比较均有显着行差异(P<0.05)。PC前给予放线菌酮消除了以上影响。结论HSP70在PC诱导脑缺血耐受中抗神经细胞凋亡的作用可能是通过促进再缺血后c-fos bcl-2的表达、抑制caspase-3的表达实现的。第四部分氧-糖剥夺预处理和HSP70表达在诱导体外培养神经细胞缺血耐受中的作用目的研究氧-糖剥夺预处理和HSP70表达在诱导体外培养神经细胞缺血耐受中的作用方法原代培养的大鼠皮层神经细胞进行非致死性氧-糖剥夺(Oxygen-glucose deprivation[OGD])20min作为预处理(ischemic preconditioning[PC]),分别在PC后12h、24h、48h、72h进行第二次致死性OGD50min,建立体外缺血耐受模型。致死行OGD后24h测定乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase[LDH])检测神经元损伤的程度、台盼兰染色检测神细胞死亡率;RT-PCR、免疫组织化学、Western blotting测定PC后HSP70的表达;同时测定在PC前30min或PC后较长时间而在致死性OGD前应用放线菌酮对神经细胞损伤和在PC前30min应用放线菌酮对HSP70蛋白的影响。结果与致死性OGD组比较PC-OGD组OGD后24h、48h LDH水平明显减低(P<0.05)、神经细胞死亡数减少(P<0.05),同时PC后12h、24h、48h HSP70mRNA的表达增加(P<0.05),24h、48h HSP70蛋白的表达增加(P<0.01),而PC后12h、72h组则无变化。在PC前应用放线菌酮消除了PC-OGD组OGD后24h上述指标的变化,而在PC后较长时间应用放线菌酮对此则无影响。同时PC前应用放线菌酮抑制了HSP70蛋白的表达(P<0.05)。结论20min OGD预处理成功的诱导了体外皮层神经细胞的缺血耐受,这种作用可能与HSP70的高表达有关。第五部分氧-糖剥夺预处理对体外培养大鼠神经细胞凋亡的保护作用及机制目的探讨氧-糖剥夺预处理对体外培养神经细胞凋亡的保护作用及机制方法原代培养的大鼠皮层神经细胞进行非致死行的氧-糖剥夺(Oxygen-glucose deprivation[OGD])20min作为预处理(ischemic preconditioning[PC]),在PC后24h进行第二次OGD50min,建立体外缺血耐受模型。流式细胞仪、TUNEL法,吖啶橙荧光染色测定致死行OGD后24h细胞凋亡率和凋亡细胞数。免疫组织化学和免疫印迹测定致死行OGD后24h bcl-2、caspase-3的表达。结果与对照组相比PC-OGD组致死性OGD后24h神经细胞凋亡百分率和凋亡阳性细胞均减少(P<0.05),同时发现其致死性OGD24h后bcl-2表达增加(P<0.05)而caspase -3表达减少(P<0.05)。结论PC对体外培养大鼠神经细胞凋亡有保护作用,这种作用可能是通过促进随后发生的致死性OGD后bcl-2表达、抑制caspase -3表达实现的。
魏爱宣[8]2010年在《慢性脑缺血致认知功能障碍大鼠HIF-1α及其靶基因表达与西洛他唑保护作用》文中指出慢性脑缺血致认知功能障碍是严重影响生活质量的疾病,随着人口老龄化,其发病率呈逐年上升趋势。迄今为止,其发病机制不完全清楚,尚无特效药物和治疗手段,因此,慢性脑缺血致认知功能障碍发病机制及其防治是神经科学研究的重点。本研究从HIF-1α及其靶基因HO-1、TH表达在慢性脑缺血致认知功能障碍中的作用及西洛他唑对其保护作用及机制进行了研究。研究首先用双侧颈总动脉永久性结扎法制备大鼠慢性脑缺血模型,利用Morris水迷宫、HE染色方法检测其行为学、组织学变化,对模型进行评价;采用免疫组化、RT-PCR和Western-blot方法检测大鼠慢性脑缺血不同时间点额叶皮层、海马HIF-1α及其靶基因HO-1、TH的表达水平变化;利用流式细胞学技术检测细胞凋亡变化,RT-PCR技术检测细胞周期调控因子CyclinD1表达,同时对慢性缺血大鼠给予西洛他唑进行干预治疗,观察上述指标变化。探讨HIF-1α及其靶基因表达在慢性脑缺血致认知功能障碍中的作用,并从细胞凋亡、细胞周期调控、HIF-1α及其靶基因HO-1、TH的表达方面探讨西洛他唑对其的保护作用机制。结果显示,慢性脑缺血大鼠学习记忆能力下降,HIF-1α及其靶基因HO-1、TH表达水平升高,HIF-1α、HO-1蛋白表达分别与大鼠学习记忆能力呈正相关;额叶皮层、海马神经细胞出现凋亡,细胞周期调控因子CyclinD1表达升高,西洛他唑干预后,大鼠学习记忆能力明显改善,HIF-1α与HO-1、TH、CyclinD1表达水平均有不同程度降低,额叶皮层、海马神经细胞凋亡细胞百分数下降。本研究表明,HIF-1α及其靶基因HO-1可能作为保护因素参与慢性脑缺血后认知功能障碍的发生发展过程;靶基因TH可能作为损害因素参与慢性脑缺血后认知功能障碍的发生发展过程。西洛他唑可能通过下调HIF-1α及其靶基因的表达、抑制细胞凋亡及细胞调控因子CyclinD1的表达发挥神经保护作用。提示HIF-1α可能成为防治慢性脑缺血致认知功能障碍新的治疗靶点,西洛他唑有望成为防治慢性脑缺血致认知功能障碍新的治疗药物,并为其临床应用提供了基础实验证据。
马宁[9]2018年在《局部动脉泵入尤瑞克林对永久性大脑中动脉闭塞大鼠神经功能的保护作用及机制研究》文中认为研究目的本研究利用永久性大脑中动脉闭塞大鼠模型(pMCAO),探讨不同时间窗内泵入不同剂量尤瑞克林(Urinary Kallindinogenase,HUK)对pMCAO模型大鼠的神经保护作用及其作用机制。研究方法(1)SD大鼠120只随机分为假手术组、pMCAO组、NaCl组(pMCAO+生理盐水注射组)和HUK组。根据不同剂量和时间窗,HUK组又分为9组:低剂量0.5 h组(建模后0.5 h泵入7.8125×10~(-4) PNAU/Kg HUK)、低剂量1.5 h组(建模后1.5 h泵入7.8125×10~(-4) PNAU/Kg HUK)、低剂量3 h组(建模后3 h泵入7.8125×10~(-4)PNAU/Kg HUK),中剂量0.5 h组(建模后0.5 h泵入15.625×10~(-4) PNAU/Kg HUK)、中剂量1.5 h组(建模后1.5 h泵入15.625×10~(-4) PNAU/Kg HUK)、中剂量3 h组(建模后3 h泵入15.625×10~(-4) PNAU/Kg HUK),高剂量0.5 h组(建模后0.5 h泵入31.25×10~(-4) PNAU/Kg HUK)、高剂量1.5 h组(建模后1.5 h泵入31.25×10~(-4) PNAU/Kg HUK)、高剂量3 h组(建模后3 h泵入31.25×10~(-4) PNAU/Kg HUK)。在大鼠大脑中动脉闭塞24 h后,通过测定神经功能缺损评分、脑梗死面积大小、ELISA检测脑脊液中缓激肽和血管内皮生长因子的含量,探讨尤瑞克林对大脑中动脉闭塞大鼠的神经保护作用。(2)利用pMCAO模型动脉泵入最佳剂量HUK作为治疗组,动脉泵入生理盐水作为阴性对照组,侧脑室给药PI3K抑制剂LY294002溶液观察阻断PI3K通路后HUK的治疗效果。给药后7天,通过比较不同组别大鼠的神经功能缺损评分、海马区病理变化、脑梗死面积、脑损伤标志物的表达、炎症相关因子和细胞凋亡及相关蛋白的表达,探讨动脉泵入HUK对大脑中动脉闭塞大鼠的神经保护作用;通过比较不同实验组的大鼠脑组织PI3K、AKT和FoxO1磷酸化及非磷酸化蛋白的表达,研究PI3K/AKT/FoxO1信号通路通过动脉泵入HUK对大鼠的神经功能保护作用及其机制。研究结果1.神经功能缺损评分结果显示,除假手术组外,HUK中剂量0.5 h组评分最低(1.21±0.04),与pMCAO组(4.60±0.07)相比差异显着(P<0.05)。HUK低剂量0.5 h组和HUK高剂量0.5 h组虽在各自的剂量组别中效果较好(分别为3.11±0.05和1.59±0.11),与HUK中剂量0.5 h组相比差异显着(P<0.05)。2.梗死体积计算结果显示,各剂量组中均在pMCAO后0.5 h泵入HUK疗效最好,其中HUK中剂量0.5 h组的梗死体积占对侧总体积的百分比为6.05±0.68%,治疗效果在HUK治疗各组中最为显着,与pMCAO组(38.69±4.06%)相比差异显着(P<0.05)。HUK低剂量0.5 h组和HUK高剂量0.5 h组的梗死体积占对侧总体积的百分比分别为26.29±1.89%和17.79±1.50%,与HUK中剂量0.5 h组相比差异显着(P<0.05)。3.ELISA检测脑脊液中BK和VEGF含量的趋势与前两项实验结果一致,均是HUK中剂量0.5 h组最接近假手术组,BK和VEGF含量分别为61.05±2.40 pg/ml和98.79±5.79 pg/ml,与pMCAO组的BK和VEGF含量(102.6±3.99 pg/ml和215.64±9.71 pg/ml)相比明显降低(P<0.05)。在其他不同剂量和时间点的各组中,HUK中剂量1.5 h组和HUK高剂量0.5 h组的效果优于其他各组,两者BK含量分别是70.50±2.46 pg/ml和80.15±1.78 pg/ml,VEGF含量分别为106.73±3.82 pg/ml和111.89±9.77 pg/ml。4.与假手术组相比,pMCAO组大鼠神经功能缺损评分明显升高(P<0.05);海马区神经元损伤明显,锥体细胞排列不规则,出现细胞肿胀,细胞膜结构弥漫,神经元变性/坏死;脑梗死体积增加(P<0.05);S100β和NSE标志物表达增高(P<0.05);促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α表达显著升高,抑炎因子IL-10表达明显降低(P<0.05);海马区细胞凋亡数量增加,差异有统计学意义;促凋亡因子Bax和Caspase3表达显着增高,抑凋亡因子Bcl-2表达明显降低(P<0.05)。5.与pMCAO组相比,动脉泵入HUK可以显着降低大鼠神经功能缺损评分(P<0.05),有效改善海马区神经元损伤,减少神经元变性/坏死;显着降低大鼠的脑梗死体积(P<0.05);显着降低S100β和NSE蛋白的表达(P<0.05);显着降低促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达,提高抑炎因子IL-10的表达(P<0.05);显着降低大鼠海马区细胞凋亡的数量,降低促凋亡因子Bax和Caspase3的表达,提高抑凋亡因子Bcl-2的表达(P<0.05)。6.与pMCAO+HUK组相比,PI3K抑制剂组减弱了HUK对大鼠的大脑神经功能保护作用,降低了HUK对PI3K、AKT和FoxO1的磷酸化水平,表明动脉泵入HUK对pMCAO大鼠神经功能的保护作用可能通过PI3K/AKT/FoxO1信号通路得以实现。研究结论1.在不同时间窗内,局部动脉泵入不同剂量的HUK对pMCAO大鼠具有显着的神经保护作用。2.在pMCAO后0.5 h,局部动脉泵入HUK中剂量(15.625×10~(-4) PNAU/Kg)对pMCAO大鼠的神经保护作用最为显着。3.局部动脉泵入HUK对pMCAO大鼠的脑神经具有保护作用,可能与缓激肽系统相关。4.动脉泵入中剂量HUK可以改善pMCAO大鼠的神经功能缺损评分,减少脑梗死体积,抑制炎性因子表达和神经细胞凋亡,表明HUK对pMCAO大鼠的神经功能损伤具有保护作用。5.PI3K抑制剂可以逆转HUK改善pMCAO大鼠的神经功能缺损评分,脑梗死体积缩小,抑制炎性因子的表达和神经细胞凋亡的降低,表明PI3K抑制剂可以降低HUK对pMCAO大鼠的神经保护作用。6.动脉泵入HUK对pMCAO大鼠的神经保护作用机制,可能与调控PI3K/Akt/FoxO1信号传导途径相关。
赵艳霞[10]2002年在《光化学法MCAO鼠溶栓及脑保护治疗的实验研究》文中认为脑血管病(cerebrovascular diseases，CVD)因其高发病率、高致残率及高死亡率而严重危害人类健康，其中缺血性脑血管病(ischemic cerebrovascular diseases，ICVD)占有很高比例。一般认为，脑缺血后及再灌注后的损伤机制涉及兴奋性氨基酸(excitatory amino acid，EAA)毒性、钙超载、炎症反应、自由基损伤、细胞凋亡等病理生理过程，因此，对缺血性卒中的治疗应包括以下两方面，一是恢复缺血区血流，二是阻断由缺血引起的损伤级联反应。溶栓是再通血管的根本方法，尿激酶(urokinase，UK)是目前国内常用的溶栓药物，但并发脑出血的危险性及梗死后6h甚至3h的治疗时间窗限制了临床的溶栓治疗。镁作为钙的生理性拮抗剂及NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸)受体的非竞争性拮抗剂，可减少病理性Ca~(++)内流，减轻EAA的神经毒性，对局灶性脑缺血有显着的神经保护作用。紫外线照射液体输注(ultraviolet liquid irradiation,ULI)又称光量子液疗，可增强组织型纤溶酶原激活物(tPA)活性，降低血一浆纤维蛋白原含量，并能增强自由基清除酶活力，调节自由基平衡。溶栓联合镁剂或光量子液疗治疗脑缺血能否增强溶栓效果，扩大溶栓治疗的时间窗，尚未见文献报道。本实验用光化学法建立大鼠大脑中动脉梗塞（middle cerebral atery occlusion，MCAO）模型，观察UK静脉溶栓及联合镁剂或光量子液疗对大鼠的神经功能、梗死灶体积、脑组织病理、NO、ET等指标的影响，探讨溶栓联合神经保护措施治疗脑缺血的优越性及可能机制，为临床应用提供理论依据。材料与方洁 健康WStaf大鼠96只，体重220～2509，随机分为5组：A组“只）为假手术组；B组门 只）为手术对照组（盐水对照组入C组＊4只）为UK溶栓组；D组＊4只）为UK溶栓十镁治疗组：E组Q4只）为＊K溶栓＋光量子液疗组：B、C、D、E组又各分为 MCAO术后 Zh、6h及 10 h干预组（B组内每时间点6只，其余组每时间点8只人用光化学法制作大鼠MCAO模型，待清醒后观察体征。C组分别于Zh、6h及10h 3个时间点经股静脉给予 UK6万 U／Kg体重，D组在 3个时间点经股静脉输入 UK 6万 U／Kg后，立即经腹腔给子 2％的硫酸镁 500mg／Kg，E组在 3个时间点经股静脉给予经量子化的 UK 6万 U／Kg，B组分别于术后 Zh、6h、10h经股静脉给予等量生理盐水，A组暴露左侧大脑中动脉后仅行氦氖激光照射，不注射光敏素。MCAO后 24 h参考Bederson的 5级分级法进行神经功能评分后，采血测定NO、ET含量，之后断头取脑，做厚 1～Zmm的切片，用 2％红四氮哩＊，3，5－tripheflyl 2 堑世左岂驷辽主亟垃幽钨切赳墟痤一一尤世判乞以边h瓢髓及脑保护渲疗的实验妞盥 tertrazolium chloride，TTC）对脑片染色，观察梗死灶的部位和 范围。另取Wistar大鼠26只，同上分组，术后24h过量麻醉 后断头取脑，取距额极 5～7mm处的脑组织做厚 5 11m切片， 苏木素．伊红（H．E）染色，光镜下观察脑组织病理。 结果 1．大鼠造模后出现手术对侧（右侧）肢体瘫痪，以前肢为 重，部分出现爬行时向右转圈现象。各盐水对照组大鼠的运动 功能在术后24h无改善，Zh单纯溶栓组及联合治疗组（D、E） 的神经功能改善明显，功能评分明显低于盐水对照组，P＜0刀5 或 P t 0刀 1，差异有显着性；术后 6h及 10h单纯溶栓组的功能 评分与盐水对照组相比，差异无显着性仔＞0刀5）。 2．TTC染色显示梗死灶位于左侧大脑中动脉供血的额、 顶叶及基底节区。盐水对照组B组的梗死灶最大，术后Zh及 6h单纯溶栓可显着缩小梗死体积，与手术对照组相比差异有显 着性，Prto刀1；10h单纯溶栓组梗死体积与B相比Pteo刀5， 差异无显着性。D、E组的梗死体积显着缩小，与同时间点B 相比P＜0．of，差异有显着统计学意义，与C组的相应时间点 比较，P＜0．of或P＜0．05，差异有显着性。 3．缺血后旧组）及溶栓后K组）血中 NO水平较假手 术组显着升高，P＜0．of，差异有显着性。B与C同时间点相比 差异无显着性0＞0刀5）。联合治疗组NO水平较同时间点的 B组或C组明显降低，Prto．of或P＜0刀5。 4．缺血后旧组）及溶栓后瞩组）血中ET水平较假手 术组显着升高o＜0刀1），B与 C同时间点相比差异无显着性 3glti．uhonlerchnu1FAgi－WevwwR：E．－amixxx－－－rr－－－＿＿－－hach－re＊rrndjeilt1Eit6j：1－－－－－－rrunun－－ra－－－iliareffolerffoariler－ 0＞0．05）。联合治疗组ET水平较同时间点的B组或C组明显降低，Pwto刀1或Pwto 刀5。 5．假手术组镜下无缺血改变，盐水
参考文献：
[1]. 联合应用神经保护剂对大鼠局灶性脑缺血后梗死体积和神经元凋亡及caspase-3蛋白表达的影响[D]. 李志梅. 河北医科大学. 2003
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[3]. 补阳还五汤对脑梗死急性期患者血管新生相关因子及MCAO小鼠蛋白芯片表达的影响[D]. 谭涛. 湖南中医药大学. 2012
[4]. 依达拉奉对大鼠脑梗死尿激酶溶栓后脑保护机制的探讨[D]. 卢金华. 福建医科大学. 2009
[5]. LMO4/pCREB/pStat3在局灶性脑缺血再灌注大鼠中的表达及依达拉奉的干预研究[D]. 许贤平. 中南大学. 2010
[6]. 硒代胱氨酸及其衍生物的抗脑胶质瘤机理及神经保护机制研究[D]. 王琨. 山东大学. 2016
[7]. 热休克蛋白-70在脑缺血预处理诱导脑缺血耐受中的作用及其机制的实验研究[D]. 赵建华. 华中科技大学. 2007
[8]. 慢性脑缺血致认知功能障碍大鼠HIF-1α及其靶基因表达与西洛他唑保护作用[D]. 魏爱宣. 吉林大学. 2010
[9]. 局部动脉泵入尤瑞克林对永久性大脑中动脉闭塞大鼠神经功能的保护作用及机制研究[D]. 马宁. 中国人民解放军空军军医大学. 2018
[10]. 光化学法MCAO鼠溶栓及脑保护治疗的实验研究[D]. 赵艳霞. 郑州大学. 2002
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