导读:本文包含了胎儿成纤维细胞论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:胎儿,细胞,纤维,干细胞,载体,转染,细胞核。
胎儿成纤维细胞论文文献综述
李娜娜[1]（2019）在《过表达Sox2对牛胎儿成纤维细胞重编程作用的研究》一文中研究指出Sox2是SOX基因(SRY-related high mobility group box,SOX)家族的一个成员,也是体细胞重编程为多能干细胞的重要转录因子之一。Sox2除了能够维持胚胎干细胞的自发复制、增殖和多能性外,同时也参与神经祖细胞和内胚层等多种细胞的增殖和分化。为了探索Sox2在牛胎儿成纤维细胞重编程过程中的作用,本论文通过在牛胎儿成纤维细胞中过表达Sox2基因,研究其对牛胎儿成纤维细胞重编程过程早期阶段的影响。首先培养原代牛胎儿成纤维细胞,之后通过细胞活力测定、以及成纤维细胞生长曲线和核型分析等方法,确认牛胎儿成纤维细胞可以用于本研究。然后通过PCR分别克隆了牛Sox2基因和Puro基因,将其连接到pGEFP-N2基础载体上,构建得到两种表达载体:pEGFP-N2-Puro、pEGFP-N2-Sox2-T2A-Puro-T2A,这两个表达载体可同时表达GFP和Puro或者Sox2、Puro和GFP,分别用于对照组和实验组。在此基础上,通过电转染的方式将两种载体分别导入牛胎儿成纤维细胞,然后通过嘌呤霉素(Puromycin)药物筛选得到两种稳定转染的细胞。将转入pEGFP-N2-Puro载体的细胞简称为GFP细胞,pEGFP-N2-Sox2-T2A-Puro-T2A载体转入的细胞简称为N2SP细胞。最后分别用诱导培养液对上述牛胎儿成纤维细胞进行重编程诱导,收集诱导不同天数后的细胞(0、3、5、7d),进行以下鉴定:生长曲线、细胞周期检测、核型分析。收集诱导不同天数后的细胞(0、3、5、7d和牛iPS样细胞),进行以下鉴定与碱性磷酸酶染色、RT-PCR检测、qRT-PCR检测、免疫荧光染色、蛋白免疫印迹检测,研究过表达Sox2基因对牛胎儿成纤维细胞重编程过程的影响。实验结果表明,在牛胎儿成纤维细胞重编程过程的早期阶段,过表达Sox2基因可以使细胞周期减慢,G0/G1期的细胞占比递增,S期的细胞占比递减;并在重编程过程中没有发现染色体丢失的现象(2N=60);而且过表达Sox2可以显着性增加碱性磷酸酶阳性细胞的比例;在RNA水平和蛋白水平的检测结果一致表明:在过表达Sox2诱导后的细胞中干细胞相关基因(Oct4、Sox2和Rex1)、上皮细胞相关基因(Ocln和Cdh1)的表达水平上升,Nanog不表达。而间质细胞相关基因(Cdh2、Zeb1、Zeb2、Snail和Slug)的表达水平下调。上述结果表明,过表达Sox2在一定程度上能够促进牛胎儿成纤维细胞的间质-上皮转化(Mesenchymal-epithelial transition,MET),促进了重编程过程。本论文为后续研究大家畜的重编程机制以及获得稳定的多能性干细胞奠定了基础。(本文来源于《内蒙古大学》期刊2019-06-03）
周正伟[2]（2019）在《建立Td-tomato标记KRT18基因的牛胎儿成纤维细胞系及用于iPS诱导的初步研究》一文中研究指出上皮间质转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)是上皮样细胞向间充质样细胞转变的过程,是一个中间态的变化,现已被证明在癌症发生、组织愈合以及iPS诱导过程中起着十分重要的作用。在iPS诱导过程中,主要发生的是EMT的逆过程,即成纤维样细胞-上皮样细胞的转化(MET),在这一过程中,会逐渐失去成纤维的细胞形态,转变为连接更为紧密的上皮细胞形态,且能表达简单上皮细胞的特异性标志物KRT18、KRT8、KRT19等。KRT18作为中间丝蛋白中的简单上皮蛋白,在癌症和早期胚胎发育与着床以及iPS诱导过程MET发生中起着标志性的作用,因此研究这一基因在胚胎发育与iPS诱导中的作用,对其在基础功能上的研究具有重要意义。本研究以实验室前期构建的pKlrkt打靶载体为基础载体,分别用PCR的方法从胎牛成纤维细胞基因组中获得包含有该基因启动区的5`同源臂和3`同源臂,以酶切连接的方法将两个同源臂连在基础载体的MluI和NheI两个位点,再对td-Tomato质粒进行BamHI和NotI双酶切,回收片段与连接好两个同源臂的pKlrkta载体进行连接,获得内含td-Tomato序列且无启动子的pTKlrkt打靶载体,通过电转染的方式将pTKlrkt打靶载体与实验室前期构建完成的CRISPR/Cas9表达质粒,以200V、5 ms、电击2次的条件共转染到胎牛成纤维细胞中,先经G418筛选后,分别以流式细胞分选和口吸管挑取的方式分选单克隆细胞,最终获得122株单克隆细胞,经跨臂PCR验证后,确定3株细胞具有正确整合,命名为BFF-KRT18-Tomato,打靶效率为2.46%,3株打靶细胞系均保持原始成纤维细胞的生长速率,能在体外正常传代5代以上。为研究iPS诱导过程中KRT18在不同转染体系和培养条件所表现出的特征,我们以获得的BFF-KRT18-Tomato打靶细胞系为初始诱导细胞,用慢病毒转染的方法分别将人源Oct4、Klf4、Sox2、C-Myc(h-OKSM)、人源Oct4、Klf4、Sox2、C-Myc、Nanog(h-OKSMN)和人源Oct4、Klf4、Sox2、C-Myc、Nanog、Lin28A(h-OKSMNL)导入打靶细胞系中,同时在CTFR培养体系(MTeSR E6、Low fatty acid BSA、rhFGF-2和IWR-1)和LCDM培养体系(DMEM/F12、Neurobasal、N-2、B27、L-Glutamine、NEAA、KSR、β-巯基乙醇、bLIF、CHIR-99021、DiM和MiN)进行培养,收集D18的细胞样品进行RT-PCR以及在荧光显微镜下观察显示,h-OKSMNL转染体系下更能促进成纤维向上皮样细胞的转变,而且两种培养体系都无法形成细胞克隆,表明均不适于biPS的诱导,但CTFR培养体系能更好的维持细胞的生长状态,同时经历向iPS诱导过程的中间上皮样形态,从而激发红色荧光蛋白的表达。综上所述,利用CRISPR/Cas9的方法可以将td-Tomato定点整合在牛胎儿成纤维细胞的KRT18的基因位点,建立的细胞系能够在MET研究中更好的起到标记作用,对研究KRT18基因的功能和iPS诱导过程提供了一个有力的工具。(本文来源于《内蒙古大学》期刊2019-06-02）
欧浩,李国玲,王豪强,黄广燕,蔡更元[3]（2019）在《MEK抑制剂PD0325901显着提高猪胎儿成纤维细胞ssODN介导的HDR效率》一文中研究指出基因组DNA发生双链断裂(double strand break, DSB)后主要通过同源定向修复(homologous-directed repair, HDR)和非同源末端连接(nonhomologous end joining, NHEJ)两种途径进行修复,其中单链寡聚核苷酸(single-stranded oligodeoxyribonucleotide, ssODN)介导的同源定向修复是动物基因组常用的基因组定点修饰技术,具有较大的科研和应用价值。为提高猪基因组ssODN介导HDR效率,本研究以猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts, PFFs)为研究对象,利用丝裂原活化的细胞外信号调节激酶(mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase, MEK)抑制剂PD0325901培养细胞,研究其对HDR效率的影响及作用分子机理。结果显示,PD0325901能显着提高PFFs的G_2期和S期细胞群百分比,减少G_1期细胞群比率,促进HDR修复因子的表达。在最适浓度250 nmol/L时,PD0325901使ssODN介导的GFP报告载体的修复效率提高了58.8%;同时使PFFs基因组位点DMD和ROSA26定点修饰效率分别提高了48.16%和17.64%。本研究表明,MEK抑制剂PD0325901能显着提高猪基因组ssODN介导的同源定向修复效率,为高效制备定点基因修饰动物模型提供了新思路。(本文来源于《遗传》期刊2019年04期）
钟翠丽,李国玲,王豪强,莫健新,全绒[4]（2019）在《大载体转染猪胎儿成纤维细胞的电转条件优化》一文中研究指出【背景】随着生物技术发展,研究的生理机制和生物功能日益复杂,提高大载体的转染效率对多基因共表达系统、基因编辑技术、转基因育种等具有重要的意义。在转基因育种中,使用的转基因载体相对较大,而且转基因动物的制备效率也与供体细胞猪胎儿成纤维(porcine Fetal Fibroblasts,PFFs)细胞的转染效率有关。【目的】研究主要从转染参数、质粒用量和拓扑结构叁方面,比较3种电转仪ECM~?830/NEPA21/Nucleofector~(TM)2b的大载体转染效率,以探索大载体转染PFFs的最佳条件。【方法】使用3种不同电转仪将长达26 kb的携带增强型绿荧光蛋白基因的pPXAT-EGFP质粒转染1×10~6个PFFs,48 h后使用流式细胞仪测定荧光细胞比例,从电转参数、质粒用量和拓扑结构叁方面分别比较瞬时转染效率。【结果】首先比较电转仪不同参数的转染效率,结果显示当电转参数为脉冲电压300 V,脉冲长度1 ms,脉冲间隔50 ms,脉冲次数3次,NEPA 21转染PFFs的效率最高,为13.24%±1.63%,而Nucleofector~(TM) 2b的最佳电转参数为U-023,其转染效率高达46.36%±3.95%。然后在最佳电转参数下分别比较6、8、10和12μg的26 kb超螺旋质粒的转染效率,ECM~?830和Nucleofector~(TM) 2b转染PFFs的最佳质粒用量为12μg,其转染效率分别为8.44%±0.90%(电转参数:脉冲电压300 V,脉冲长度1 ms,脉冲次数3次)和14.63%±3.21%(电转参数:U-023),而NEPA 21使用10μg质粒转染PFFs时效率达到最高(6.09%±0.72%)。最后比较不同质粒拓扑结构的转染效率,结果显示线性化质粒的转染效率较低,仅为超螺旋质粒转染效率的34.96%—48.39%。【结论】因此Nucleofector~(TM) 2b转染PFFs的最佳条件为:U-023程序、12μg超螺旋质粒;NEPA 21为:脉冲电压200 V,脉冲长度3 ms,脉冲间隔50 ms,脉冲次数3次、10μg超螺旋质粒;ECM~?830则在脉冲电压300 V,脉冲长度1 ms,脉冲次数3次条件下转染12μg超螺旋质粒可获得最佳转染效率。综合比较上述3种电转仪,26 kb大载体转染PFFs的最佳电转仪是Nucleofector~(TM) 2b。(本文来源于《中国农业科学》期刊2019年03期）
游小燕,何琦琳,刘雪芹,葛良鹏[5]（2019）在《一种无血清冻存液在猪胎儿成纤维细胞上的应用研究》一文中研究指出在猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts, PFF)冻存过程中,血清品质常常制约着细胞的冻存效果。为了解决这个问题,本研究旨在开发一种无血清冻存液应用于猪胎儿成纤维细胞冻存。用3种不同冻存液冻存猪胎儿成纤维细胞,每种冻存10管。冻存30 d后复苏细胞,测定冻存细胞存活率,细胞增殖活力以及电转后细胞活性。结果显示:自制无血清细胞冻存液,冻存猪胎儿成纤维细胞后存活率达95.33%;细胞增殖活力以及电转后细胞活性均显着高于标准胎牛血清冻存液(p<0.05),与特级胎牛血清冻存液效果相当(p>0.05)。因此,自制冻存液冻存猪胎儿成纤维细胞效果稳定,能够替代含血清冻存液,有良好的推广应用前景。(本文来源于《基因组学与应用生物学》期刊2019年01期）
李国玲,王豪强,阮晓芳,莫健新,全绒[6]（2018）在《叁种小分子化合物对猪胎儿成纤维细胞DNA精确修复效率的影响》一文中研究指出旨在研究3种小分子化合物(RS-1、Chir99021和PD173074)对猪胎儿成纤维细胞DNA精确修复效率的影响。本研究以猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs)为试验对象,利用HDR通路关键因子Rad51激活剂RS-1、Wnt信号通路关键因子糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase 3,GSK-3)抑制剂Chir99021和成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor,FGFR1)抑制剂PD173074培养细胞,通过流式细胞术检测绿色荧光细胞数百分比来验证3种小分子化合物对DNA精确修复效率的影响。结果显示:1)经不同剂量的Chir99021和PD173074处理后,PFFs DNA损伤修复因子LIG4、NHEJ1、XRCC5、XRCC6和Rad51表达水平都显着下调(P <0. 05),而经不同浓度PD173074(0. 1～0. 5μmol·L~(-1))处理后,PNKP因子表达上调(P <0. 05)。2) Chir99021低剂量时可显着提高同源重组修复(homologous recombination,HR)介导的同源重组效率,Chir99021高剂量时可显着提高单链退火修复(single strand annealing,SSA)介导的同源重组效率; RS-1和PD173074低剂量时可显着提高HR效率(P <0. 05),但RS-1在高浓度时显着下调SSA修复效率(P <0. 05),而PD173074对SSA效率无显着影响(P>0. 05);此外单链寡核苷酸介导的DNA修复(single-stranded oligonucleotide,ss ODN)效率并不受小分子化合物处理的影响(P>0. 05)。本研究结果表明,适当浓度小分子化合物的应用有利于不同策略的基因敲入细胞系的产生,为获得精确的遗传修饰的动物模型打基础。(本文来源于《畜牧兽医学报》期刊2018年12期）
林德凤,董妍,石凤垚,曹伟,苗懋东[7]（2018）在《Plk1在猪胎儿成纤维细胞有丝分裂进程中的亚细胞定位和功能研究》一文中研究指出本研究旨在探究Plk1在猪胎儿成纤维细胞中的亚细胞定位及其作用。通过间接免疫荧光技术检测了Plk1在猪胎儿成纤维细胞有丝分裂进程中的亚细胞定位,并通过Plk1特异性抑制剂GSK461364处理进一步分析Plk1在细胞有丝分裂进程中的潜在作用。结果显示:Plk1在猪胎儿成纤维细胞有丝分裂各个时期都有分布,且在细胞核周围有相对较高水平的Plk1表达;经GSK461364处理后,细胞活力显着降低,细胞周期进程阻滞在G2/M期,出现细胞核碎裂,并伴随着α-微管蛋白结构紊乱。研究表明:Plk1参与了调控猪胎儿成纤维细胞有丝分裂的进程,并与G2/M期的细胞核分裂和微管组装密切相关。(本文来源于《畜牧与兽医》期刊2018年07期）
魏军昌,陈创夫,乔军,侯晓旭,马齐蔓[8]（2018）在《表达靶向牛病毒性腹泻病毒shRNA的绵羊胎儿成纤维细胞的制备和鉴定》一文中研究指出为了获得具有抗牛病毒性腹泻病毒(BVDV)能力的绵羊胎儿成纤维细胞,采用组织块和酶消化法分离培养绵羊胎儿成纤维细胞,利用脂质体转染法将shRNA转基因表达载体转染绵羊胎儿成纤维细胞,经抗性筛选获得抗性细胞克隆,利用PCR方法对获得的细胞克隆进行鉴定,用BVDV侵染转基因细胞,利用real-time PCR和病毒滴定测定法分析不同细胞克隆抑制BVDV复制的能力。结果显示:试验成功构建了靶向BVDV表达shRNA的转基因表达载体pNeo-2loxp-u6-sh BVDV,经抗性筛选共获得22个抗性细胞克隆;22个细胞克隆中12个细胞克隆含有目的基因,为转基因细胞,其中5个转基因细胞克隆具有明显的抗BVDV复制的能力,最高抗病毒效率达到90.7%。结论:在细胞水平能有效抑制BVDV病毒增殖的转基因绵羊胚胎成纤维细胞的获得,为进一步利用体细胞核移植技术制备转基因绵羊提供了合适的供体细胞。(本文来源于《畜牧与兽医》期刊2018年06期）
要乐[9]（2018）在《绒山羊胎儿成纤维细胞ERK功能抑制的转录组分析及其在脂合成中的作用》一文中研究指出内蒙古白绒山羊是经过长期自然选择形成的优质绒肉兼用型地方品种,除产出世界上最好的绒毛纤维外,还具有产肉性能好,肉质细嫩的特点,其肌内脂肪含量是影响肉品质的关键因素,但合成及沉积机制尚不清楚。细胞外信号调节激酶1/2(ERK 1/2)属于丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)超家族,ERK 1/2是Ras/Raf/MEK/ERK通路的重要组成,可介导多种胞外刺激信号,参与调节细胞生长及代谢过程。ERK的功能在人及多种模式动物细胞中的作用已被深刻认识,但在绒山羊细胞中的功能,尤其是脂肪形成中的作用,我们还认识不多。绒山羊胎儿纤维细胞(GFb)是研究内蒙古白绒山羊细胞生长、代谢最为常用的细胞模型,我们在本研究中用ERK 1/2的特异性抑制剂SCH772984处理GFb细胞进行比较转录组学分析,探讨ERK在GFb细胞中的功能,并研究其在细胞脂合成中的调控作用与机制。结果显示,绒山羊胎儿成纤维细胞对SCH772984敏感,SCH772984浓度超过0.5μM处理细胞24 h,显着抑制其增殖(p<0.05);0.1μM SCH772984处理细胞24 h,显着抑制甘油叁酯、软脂酸和二十二碳六烯酸合成(p<0.05),抑制ERK/mTORC1信号通路活性,抑制脂合成相关转录因子PPARγ、SREBP1和甘油叁酯合成关键酶Lipin1、DGAT1以及脂肪酸合成关键酶FAS、ACC的表达。ERK 1/2调控脂合成可能的机制是通过mTOR通路调控脂合成相关转录因子和关键酶表达,进而调控脂合成。转录组分析表明,用0.1μM SCH772984处理细胞24 h使ERK 1/2活性抑制,GFb细胞内发现66个新基因(转录本);76个差异表达基因,其中上调47个,下调29个;可以在各类数据库中得到注释的差异表达基因69个,其中GO 53个,COG 19个,KEGG 40个,Swiss-Prot 62个,TrEMBL 65个,nr 65个,nt 69个。差异表达基因主要集中在生物学过程中,符合ERK功能的一般特征。本研究在转录组水平上对内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞内ERK的功能进行了初步分析,并探讨了ERK在细胞内脂肪合成中的作用与机制,将对进一步研究绒山羊细胞生长和代谢,尤其是肌内脂肪的形成与沉积机制提供基础数据,对提高绒山羊肉质具有重要意义。(本文来源于《内蒙古大学》期刊2018-06-01）
王志敏[10]（2018）在《阿尔巴斯绒山羊胎儿成纤维细胞和成体干细胞的体外生长特性及表观遗传修饰模式的比较》一文中研究指出体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)技术是转基因新品种培育的主要技术手段,其优点是不仅可以培育家畜优良品种、有效保护濒危动物,还为细胞分化以及基因调控机制的研究提供了重要的技术手段。目前,胎儿成纤维细胞是SCNT中使用最多的核供体细胞。尽管它具有良好的增殖能力,能够用于细胞水平的基因修饰,并且利用它作为核供体细胞最终会产生成活的转基因后代。但是,它作为核供体细胞,还具有基因转染效率低、体外培养传代次数有限等缺点,这会阻碍转基因新品种的培育。存在于成体组织中的干细胞与胎儿成纤维细胞相比,具有取材方便、易培养,增殖能力强、分化程度低等优点,被广泛应用在转基因新品种的培育以及再生医学等多个领域。本研究以阿尔巴斯绒山羊胎儿成纤维细胞(Fetal fibroblast cells,FFCs)、脂肪间充质干细胞(Adipose-derived stem cells,ADSCs)、骨髓间充质干细胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs)和肌肉卫星细胞(Muscle-derived satellite cells,MDSCs)作为研究对象,比较其多能性、增殖、凋亡相关基因的表达情况,并通过全基因组甲基化、组蛋白H3乙酰化水平及其它乙酰化位点检测,以及相关表观遗传修饰酶类的表达情况检测,系统了解胎儿成纤维细胞和成体干细胞的体外生长特性及表观遗传修饰模式的差异,为深入探究成体干细胞和成纤维细胞的生长机制及表观遗传修饰差异提供新的实验依据。同时,也为成体干细胞的应用提供新的理论基础。一、阿尔巴斯绒山羊胎儿成纤维细胞和成体干细胞的体外生长特性的比较本研究通过免疫细胞荧光、实时定量PCR及western blot比较了阿尔巴斯绒山羊ADSCs、BMSCs和MDSCs叁种成体干细胞与FFCs中多能性(NANOG、OCT4、SOX2)、增殖(TERT、PCNA)、凋亡(P53、BAX)基因的表达。结果显示,NANOG、OCT4和SOX2在gADSCs、gBMSCs和gMDSCs中低表达,且与gFFCs没有明显差异;在gBMSCs和gMDSCs中TERT的表达量高于gFFCs中的表达量,而在gADSCs中的表达量则低于gFFCs;PCNA和BAX在gFFCs和gMDSCs中高表达,在gADSCs和gBMSCs中低表达;P53在gBMSCs中的相对表达量较高,而在gFFCs、gADSCs和gMDSCs中的相对表达量均较低。二、阿尔巴斯绒山羊胎儿成纤维细胞和成体干细胞表观遗传修饰模式的比较为了深入探究表观遗传机制对成体干细胞的调节作用,本研究以阿尔巴斯绒山羊FFCs为对照,分析ADSCs、BMSCs和MDSCs的表观遗传修饰模式。结果显示,gBMSCs基因组中5mC的含量低于gFFCs,而gADSCs和gMDSCs基因组中5mC的含量高于gFFCs;H3K9乙酰化水平与gFFCs没有明显差异;gFFCs、gADSCs和gMDSCs可以检测到乙酰化H3K9、H3K14、H3K18、H4K5和H4K12,但是gBMSCs几乎检测不到乙酰化H4K5和H4K12;DNMT1、DNMT3A和DNMT3B在gBMSCs和gMDSCs中的表达量较高;TET1和TET2在gFFCs、gADSCs、gBMSCs和gMDSCs中的表达量较低,而TET3表达较高且无明显差异。HDAC1、HDAC6、SIRT1、Tip60、PCAF在gADSCs、gBMSCs和gMDSCs中的表达量均高于gFFCs,但是检测不到P300表达。综上所述,由于细胞来源的组织不同,取材的个体年龄也有差异,导致叁种成体干细胞与胎儿成纤维细胞在不同层面上表现出各自优势。但是,从整体水平来看,成体干细胞的胚胎干细胞特性及增殖能力明显优于胎儿成纤维细胞;从表观遗传学角度来看,成体干细胞中表观遗传修饰表达活跃,明显优于胎儿成纤维细胞。表观遗传修饰在成体干细胞中活跃表达,表明其在成体干细胞中发挥重要的调控作用。本研究结果为成体干细胞在人类医学和畜牧业等领域的应用提供了新的思考。(本文来源于《内蒙古大学》期刊2018-05-28）
胎儿成纤维细胞论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
上皮间质转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)是上皮样细胞向间充质样细胞转变的过程,是一个中间态的变化,现已被证明在癌症发生、组织愈合以及iPS诱导过程中起着十分重要的作用。在iPS诱导过程中,主要发生的是EMT的逆过程,即成纤维样细胞-上皮样细胞的转化(MET),在这一过程中,会逐渐失去成纤维的细胞形态,转变为连接更为紧密的上皮细胞形态,且能表达简单上皮细胞的特异性标志物KRT18、KRT8、KRT19等。KRT18作为中间丝蛋白中的简单上皮蛋白,在癌症和早期胚胎发育与着床以及iPS诱导过程MET发生中起着标志性的作用,因此研究这一基因在胚胎发育与iPS诱导中的作用,对其在基础功能上的研究具有重要意义。本研究以实验室前期构建的pKlrkt打靶载体为基础载体,分别用PCR的方法从胎牛成纤维细胞基因组中获得包含有该基因启动区的5`同源臂和3`同源臂,以酶切连接的方法将两个同源臂连在基础载体的MluI和NheI两个位点,再对td-Tomato质粒进行BamHI和NotI双酶切,回收片段与连接好两个同源臂的pKlrkta载体进行连接,获得内含td-Tomato序列且无启动子的pTKlrkt打靶载体,通过电转染的方式将pTKlrkt打靶载体与实验室前期构建完成的CRISPR/Cas9表达质粒,以200V、5 ms、电击2次的条件共转染到胎牛成纤维细胞中,先经G418筛选后,分别以流式细胞分选和口吸管挑取的方式分选单克隆细胞,最终获得122株单克隆细胞,经跨臂PCR验证后,确定3株细胞具有正确整合,命名为BFF-KRT18-Tomato,打靶效率为2.46%,3株打靶细胞系均保持原始成纤维细胞的生长速率,能在体外正常传代5代以上。为研究iPS诱导过程中KRT18在不同转染体系和培养条件所表现出的特征,我们以获得的BFF-KRT18-Tomato打靶细胞系为初始诱导细胞,用慢病毒转染的方法分别将人源Oct4、Klf4、Sox2、C-Myc(h-OKSM)、人源Oct4、Klf4、Sox2、C-Myc、Nanog(h-OKSMN)和人源Oct4、Klf4、Sox2、C-Myc、Nanog、Lin28A(h-OKSMNL)导入打靶细胞系中,同时在CTFR培养体系(MTeSR E6、Low fatty acid BSA、rhFGF-2和IWR-1)和LCDM培养体系(DMEM/F12、Neurobasal、N-2、B27、L-Glutamine、NEAA、KSR、β-巯基乙醇、bLIF、CHIR-99021、DiM和MiN)进行培养,收集D18的细胞样品进行RT-PCR以及在荧光显微镜下观察显示,h-OKSMNL转染体系下更能促进成纤维向上皮样细胞的转变,而且两种培养体系都无法形成细胞克隆,表明均不适于biPS的诱导,但CTFR培养体系能更好的维持细胞的生长状态,同时经历向iPS诱导过程的中间上皮样形态,从而激发红色荧光蛋白的表达。综上所述,利用CRISPR/Cas9的方法可以将td-Tomato定点整合在牛胎儿成纤维细胞的KRT18的基因位点,建立的细胞系能够在MET研究中更好的起到标记作用,对研究KRT18基因的功能和iPS诱导过程提供了一个有力的工具。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
胎儿成纤维细胞论文参考文献
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[2].周正伟.建立Td-tomato标记KRT18基因的牛胎儿成纤维细胞系及用于iPS诱导的初步研究[D].内蒙古大学.2019
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