拟南芥中两个钙相关蛋白激酶调控ABA信号转导的机制研究

论文摘要

在植物生长发育的过程中,各类非生物胁迫以及生物胁迫,例如高盐、干旱、极端温度以及病原菌会对产量以及质量造成严重的影响。在长期抵御外部胁迫的过程中,植物体内进化出了多种复杂而有效的信号网络,以减少受到的损害并适应环境变化,其中,以钙离子(Ca2+)以及植物激素脱落酸（abscisic acid,ABA）为核心的信号通路在植株的生长发育以及胁迫响应方面发挥着重要的作用。研究发现,Ca2+与ABA参与植物多种非生物与生物胁迫响应以及生长发育过程。然而,由于涉及到的各类蛋白众多,包括激酶、转录因子在内的许多成员参与调控上述通路的分子机制仍不清楚,为分子育种等农业技术应用带来障碍。本研究以拟南芥（Arabidopsis thaliana）为材料,分别对CPK（CALCIUM-DEPENDENT PROTEIN KINASE）与CIPK（CALCINEURIN B-LIKE PROTEIN-INTERACTING PROTEIN KINASE）家族的各一个成员利用实时荧光定量RT-PCR（real-time quantitative PCR,qRT-PCR）检测了二者在多种逆境与激素处理下的时空表达谱,通过酵母双杂交、双分子荧光互补（biomolecular fluoresecent complementation,BiFC）以及免疫共沉淀（coimmunoprecipitation,Co-IP）等手段鉴定了底物转录因子蛋白,利用体外磷酸化试验确定了两个激酶对转录因子的磷酸化作用以及磷酸化位点,并使用双荧光素酶报告系统（dual luciferase reporter system,Dual-LUC）在烟草（Nicotiana benthamiana）中检测了磷酸化作用对转录活性的影响,之后使用qRT-PCR在拟南芥突变体与转基因过表达植株中进行了验证,同时也对相关突变体与过表达植株在胁迫处理下的表型进行了比较分析。通过一系列的试验,结果表明,CPK6的表达受ABA与脱水诱导。CPK6的T-DNA插入突变体在种子萌发与幼苗根伸长期间对ABA不敏感,相反,CPK6的过表达转基因株系则显示出敏感性。此外,过表达CPK6的转基因株系显示出耐旱性。对CPK6的互作蛋白研究发现,CPK6与ABA信号转导核心转录因子ABF3（ABA-RESPONSIVE ELEMENT-BINDING FACTOR 3）、ABI5（ABA INSENSITIVE5）以及AREB3（ABA-RESPONSIVE ELEMENT BINDING PROTEIN 3）有较强的互作,与ABF2/4的互作则较弱,并通过体内以及体外试验进行了验证。之后的体外磷酸化试验以及磷酸化质谱分析显示,CPK6能够磷酸化ABF3与ABI5,并通过定点突变转录因子蛋白的测试验证了磷酸化发生的位点。在烟草中进行的Dual-LUC以及在拟南芥相关株系中进行的qRT-PCR中对ABF3/ABI5靶基因的表达水平分析都显示CPK6的磷酸化能够增强其转录活性。后续对cpk6 abf3或cpk6 abi5双突变体在种子萌发与萌发后幼苗生长期间的表型分析显示CPK6与ABF3/ABI5在ABA信号通路中具有上下游的遗传关系。另外,本研究发现,CIPK26的功能缺失突变体在种子休眠早期对ABA敏感。进一步的研究显示CIPK26的表达受到多种胁迫的快速诱导。进一步的测试发现,cipk26-1突变体植株显示出耐旱性。通过CIPK26与ABF/AREB转录因子的互作分析发现,CIPK26能够与包括AREB3在内的多个ABF/AREB转录因子互作。对AREB3转录因子实施定点突变,并进行体外磷酸化分析,结果显示,CIPK26对AREB3的21位的Ser残基进行磷酸化。此外,AREB3中Ser21的磷酸化对于ABA诱导的转录激活是必需的。对cipk26与areb3突变体种子的萌发测试发现,AREB3可以促进种子的休眠,而CIPK26作用则相反。蛋白稳定性试验表明,ABA可以促进CIPK26与AREB3的泛素途径降解,同时,AREB3的Ser21位点的磷酸化与否对其稳定性有显著影响。后续的蛋白互作分析发现,AREB3与这两个E3泛素连接酶SKP1B与HOS1互作,可能由这两个E3泛素连接酶介导被降解。综上,本研究得出的试验证据表明,CPK6通过磷酸化ABF/AREB转录因子正调控ABA信号转导与植株的耐旱性,揭示了ABA信号转导中钙依赖性Ser/Thr蛋白激酶的进行磷酸化调控的分子机制。另外,对于CIPK26的研究显示,CIPK26的磷酸化激活了ABA诱导的AREB3的转录活性,而这一磷酸化修饰又促进了AREB3的降解,从而对种子休眠早期的ABA信号通路进行精细调控。

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ABSTRACT

第一章文献综述

1.1 植物细胞内钙离子稳态与信号发生

1.2 植物中的CPK家族

1.2.1 CPK的结构与进化分析

1.2.2 CPK参与植物响应非生物逆境与ABA应答

1.3 植物中的CIPK家族

1.3.1 CIPK的结构特点

1.3.2 CIPK调控ABA相关的胁迫应答与离子转运

1.4 泛素系统调控蛋白降解

1.5 植物激素调控种子的休眠与萌发

1.6 研究目的与研究意义

第二章材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 植物材料与生长条件

2.1.2 试验用菌株

2.1.3 试剂与抗体

2.2 试验方法

2.2.1 基因的克隆

2.2.2 胁迫处理以及实时荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）

2.2.3 拟南芥转化与表型分析

2.2.4 启动子-β-葡糖醛酸糖苷酶（gusA/GUS）融合与组织化学染色

2.2.5 双分子荧光互补（BiFC）检测

2.2.6 双荧光素酶报告基因测定

2.2.7 气孔开度测试

2.2.8 耐旱性与失水率检测

2.2.9 Co-IP检测

2.2.10 蛋白的原核诱导与纯化

2.2.11 Pull-down检测

2.2.12 体外磷酸化检测

2.2.13 体外蛋白降解测试

2.2.14 体内蛋白稳定性检测

2.2.15 酵母双杂交

2.2.16 体内蛋白累积试验

2.2.17 基因的定点突变

2.2.18 磷酸化质谱分析

第三章拟南芥CPK6 通过磷酸化ABA响应元件结合因子调控ABA信号转导与干旱耐受性

3.1 引言

3.2 结果与分析

3.2.1 CPK6 的表达模式与启动子活性

3.2.2 CPK6 在种子萌发与萌发后生长期间正调控ABA敏感性

3.2.3 CPK6 的过表达增强了植株的耐旱性

3.2.4 鉴定CPK6 的互作蛋白

3.2.5 CPK6 磷酸化 ABF3 与 ABI5

3.2.6 CPK6 的磷酸化可以增强ABF3与ABI5 的转录活性

3.2.7 CPK6 的缺失或过表达影响部分LEA类基因的表达

3.2.8 CPK6 与互作蛋白ABI5/ABF3 共同调控拟南芥响应ABA

3.3 小结

3.3.1 CPK6 调控植株的气孔运动以及干旱胁迫

3.3.2 CPK6 通过磷酸化ABF3与ABI5 参与调控ABA信号通路

第四章拟南芥CIPK26 调控种子休眠与萌发的机制探究

4.1 引言

4.2 结果与分析

4.2.1 CIPK26 的表达被ABA以及非生物胁迫诱导

4.2.2 CIPK26与CIPK3 负调控干旱响应

4.2.3 CIPK26 与多个ABF/AREB转录因子互作

4.2.4 CIPK26 在体外磷酸化 AREB3

4.2.5 CIPK26与AREB3 参与调控ABA诱导的气孔关闭

4.2.6 CIPK26对AREB3 的磷酸化降低其转录活性

4.2.7 CIPK26 的缺失或过表达调控一些胁迫响应基因的表达

4.2.8 CIPK26与AREB3在ABA信号转导中发挥相反的作用

4.2.9 CIPK26与AREB3 调控种子的初级休眠

4.2.10 CIPK26与AREB3 的降解受到泛素-蛋白酶体通路调控

4.2.11 E3 连接酶SKP1B及 HOS1与AREB3 互作

4.3 小结

4.3.1 CIPK26与AREB3 参与调控种子休眠早期的ABA信号转导

4.3.2 CIPK26 通过磷酸化负调控 AREB3 的蛋白水平从而对 ABA 信号通路进行精细调控

第五章讨论与结论

5.1 拟南芥CPK6 通过磷酸化ABF3 以及ABI5 正调控ABA信号转导

5.2 拟南芥CIPK26 通过磷酸化AREB3 促进其泛素化降解对种子休眠早期ABA信号进行精细调控

5.3 后续研究计划

5.3.1 进一步对AtCPK6 的互作蛋白以及同源蛋白进行研究

5.3.2 对泛素化调控AREB3 这一生理过程在遗传学上的意义进行研究

附录

缩略词

参考文献

致谢

个人简历

文章来源

类型: 博士论文

作者: 张翰风

导师: 江元清

关键词: 拟南芥,磷酸化

来源: 西北农林科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 西北农林科技大学

基金: 国家自然科学基金(面上项目)(编号:31471153)

分类号: Q943.2

DOI: 10.27409/d.cnki.gxbnu.2019.000052

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