论文摘要
为研究苏云金芽孢杆菌（Bt）的Cry1Ia蛋白分泌信号肽（Iasp）,将其分别融合到eGFP和mCherry的N-端,形成IeGFP和ImCherry两种融合荧光蛋白。对两种融合蛋白的原核表达进行检测,研究Iasp对两种荧光蛋白表达的影响。前期,实验室已研究融合蛋白IeGFP在革兰氏阳性菌Bt细胞中的表达,结果表明Iasp能够显著增强eGFP在Bt细胞中的荧光强度。但是,IeGFP融合荧光蛋白在革兰氏阴性菌,比如大肠杆菌中是否也有相同或类似的表达效果尚不清楚,因此,本文将表达IeGFP的质粒pAcIeGFP和表达eGFP的质粒pAceGFP分别转化大肠杆菌TG1细胞,获得TAcIeGFP和TAceGFP菌株,并进行研究。将TAcIeGFP和TAceGFP菌株分别培养,期间进行细胞颜色观察和荧光信号强度监测。试验结果表明,TAcIeGFP（表达IeGFP）的细胞颜色比TAceGFP细胞（表达eGFP）更显著。在5个监测时间点（4、8、10、12和24 h）中,TAcIeGFP细胞的荧光信号均高于TAceGFP。尤其是在培养10 h之后,两者荧光信号强度始终保持2倍以上的差异。Western blot分析的结果与监测荧光信号强度趋势相符合。为研究Iasp对eGFP蛋白本身的影响,将IeGFP与eGFP蛋白分别进行纯化、定量。测定等量IeGFP和eGFP的荧光信号差异,并分析两种蛋白的pH稳定性。试验结果表明,IeGFP蛋白的荧光强度显著高于等摩尔的eGFP。在不同pH条件下,IeGFP的荧光信号变化与eGFP蛋白一致。为了进一步验证Iasp对其它荧光蛋白信号的影响,将其融合到mCherry的N-端,获得ImCherry。将ImCherry蛋白分别在大肠杆菌和苏云金芽孢杆菌中表达,结果表明ImCherry的表现均优于mCherry,细胞颜色更易观察,荧光信号强度更高,与IeGFP的表现一致。综上所述,IeGFP和ImCherry两种荧光蛋白可以代替各自的亲本蛋白,eGFP和mCherry,作为一种新型荧光指示分子在原核细胞中使用。本研究还说明Cry1Ia信号肽Iasp对荧光蛋白功能性表达具有促进作用,可将其用于对其它荧光蛋白的改良。
论文目录
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 郭小琴
导师: 王兴春,高建华
关键词: 信号肽,荧光蛋白,融合蛋白,大肠杆菌,苏云金芽孢杆菌
来源: 山西农业大学
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学
单位: 山西农业大学
基金: 国家自然科学基金项目(31601690)
分类号: Q78
DOI: 10.27285/d.cnki.gsxnu.2019.000623
总页数: 55
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