导读:本文包含了马法兰论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:法兰,多发性骨髓瘤,骨髓瘤,造血干细胞,细胞,冬凌草,斑蝥。
马法兰论文文献综述
王欣,刘泽林,卢博[1]（2019）在《二甲双胍联合马法兰抑制多发性骨髓瘤细胞增殖作用的实验性研究》一文中研究指出目的探讨二甲双胍联合马法兰抑制多发性骨髓瘤细胞增殖作用的效果。方法选择骨髓瘤细胞株RPMI8226和U266作为研究细胞株,将不同浓度的二甲双胍与马法兰联合作用于细胞株24、48、72 h,采用CCK-8法检测二甲双胍与马法兰对骨髓瘤细胞株增殖的影响,采用流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果当二甲双胍和马法兰浓度为80 mmol/L时,培养24、48、72 h的RPMI8226细胞株凋亡率均显着高于浓度为20mmol/L和5 mmol/L(P<0.05);当二甲双胍和马法兰浓度为80 mmol/L时,培养24、48、72 h的U266细胞株凋亡率均显着高于浓度为20 mmol/L和5 mmol/L(P<0.05);观察组C骨髓瘤细胞RPMI8226、U266凋亡率均显着高于观察组A、观察组B,且当二甲双胍和马法兰浓度为80 mmol/L时,培养24、48、72 h的U266细胞株凋亡率均显着高于浓度为20 mmol/L和5 mmol/L。结论二甲双胍与马法兰联合使用抑制多发性骨髓瘤细胞增殖作用的效果明显,可有效促使细胞凋亡,可在临床上广泛推荐应用。(本文来源于《中国药物与临床》期刊2019年06期）
安泽峰[2]（2018）在《CPT联合马法兰对人多发性骨髓瘤细胞RPMI8226增殖的影响及机制的探讨》一文中研究指出目的:本研究以多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226为研究对象,从两个方面观察CPT和马法兰(Melphalan,Mel)单药及联合用药后对细胞增殖的影响:第一,分析CPT和Mel单药及联合用药对RPMI8226细胞的细胞毒性作用;第二,对两药联合作用于RPMI8226细胞后凋亡通路上的相关基因进行检测。通过该研究期望为CPT在多发性骨髓瘤患者(multiple myeloma,MM)临床治疗上扩展新的治疗方案,以提高MM患者的预后。方法:1.人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226的培养和传代人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226培养与含体积分数为10%的灭活胎牛血清(FBS)、100U/ml的青霉素和100μg/ml硫酸链霉素的的RPMI8226培养液中,置于37℃、体积分数为5%的二氧化碳培养箱中培养,每2-3天传代一次,待细胞处于对数生长期时进行后续实验。2.CCK-8法检测CPT和Mel单药对RPMI8226细胞抑制率的影响取对数生长期的RPMI8226细胞,调整细胞密度为1.5×10~4/ml,接种于96孔培养板中,分别加入7种不同终浓度的CPT(500ng/ml、125ng/ml、31.25 ng/ml、7.8125ng/ml、1.9531ng/ml、0.4883ng/ml、0.1221ng/ml),7种不同终浓度Mel(37.5μg/ml、28.125μg/ml、21.0938μg/ml、15.8203μg/ml、11.8652μg/ml、8.8989μg/ml、6.6742μg/ml),培养不同时间24h和48h,培养结束前4h加入10μl CCK-8试剂,置于37℃、体积分数为5%的二氧化碳培养箱中培养4h,培养结束后上酶标仪测OD值,绘制细胞生长曲线,计算细胞抑制率。每组实验重复3次,取均数和标准差进行统计分析。3.CCK-8法检测CPT+Mel对RPMI8226细胞抑制率的影响取对数生长期的RPMI8226细胞,调整细胞密度为1.5×10~4/ml,接种于96孔培养板中。取抑制率为1/2 IC50和IC50的CPT终浓度分别与Mel7个浓度梯度联合培养24h和48h,计算细胞抑制率。取抑制率为1/2 IC50和IC50的Mel终浓度分别与CPT 7个浓度梯度联合培养24h和48h,计算细胞抑制率。培养结束前4h加入10μl CCK-8试剂,置于37℃、体积分数为5%的二氧化碳培养箱中培养4h,培养结束后上酶标仪测OD值,绘制细胞生长曲线,计算细胞存活率。每组实验重复3次,取均数和标准差进行统计分析。4.选择最佳联合用药方案选择抑制率为1/2 IC50和IC50的CPT浓度与Mel的7个浓度梯度联合作用于RPMI8226细胞24h和48h,计算联合用药后的细胞抑制率。选择抑制率为1/2 IC50和IC50的Mel浓度与CPT的7个浓度梯度联合作用于RPMI8226细胞24h和48h,计算联合用药后的细胞抑制率。计算结果用Compusyn软件评价联合用药对RPMI8226细胞的抑制率与联合用药指数(combination index,CI)的关系,判断药物间的相互作用:CI<1,判定为2药具有协同作用;CI=1,判定为2药具有迭加作用;CI>1,则2药具有拮抗作用。5.流式细胞术检测CPT+Mel对RPMI8226细胞凋亡率的影响根据Compusyn软件计算结果取CI最小时的CPT浓度和Mel浓度进行细胞凋亡率和坏死率的检测。取对数生长期RPMI8226细胞,调整细胞密度为1×10~6/ml,接种于24孔培养板中,设置空白对照组、CPT单药组、Mel单药组、CPT+Mel组,放置在37℃,5%CO_2的培养箱内培养0、2、4、6h。培养完成后,收集各组细胞,并使用PBS离心洗涤后弃掉上清,并加入10μl Annexin V-FITC结合液和10μl PI染色液并混匀。室温下避光放置15 min,上流式细胞仪检测。每组实验重复3次,取均数和标准差进行统计分析。6.实时荧光定量PCR(Realtime quantitative-PCR,RQ-PCR)方法检测CPT和Mel单药及联合用药对RPMI8226细胞凋亡通路相关基因表达的影响取CI最小时的CPT浓度和Mel浓度对细胞凋亡通路上的相关基因进行检测。取对数生长期RPMI8226细胞,调整细胞密度为1×10~6/ml,接种于24孔培养板中,设置空白对照组、CPT单药组、Mel单药组、CPT+Mel组,放置在37℃,5%CO_2的培养箱内培养2、4、6h。培养完成后应用TRIzol法提取总RNA,采用M-Mu Lv(TaKaRa)逆转录酶获得cDNA。逆转录反应条件:95℃预变性2min,94℃变性30S,58℃退火30S,72℃延伸30S,循环35次,72℃再延伸10min。实时荧光定量PCR的反应体系:cDNA(10×稀释)2μl,上游引物(20μmol/L)0.8μl,下游引物(20μmol/L)0.8μl,SYBR Premix Ex Taq ~(TM)Ⅱ10μl,ddH_2O 6μl,ROXⅡ0.4μl。反应条件:95℃预变性10min,95℃变性15S,60℃退火60S,循环35次,72℃再延伸10min。绘制溶解曲线,最终数据以2~(-ΔΔCT)进行分析。每组实验重复3次,取均数和标准差进行统计分析。结果:1.细胞增殖实验结果显示,CPT以时间-剂量依赖方式抑制RPMI8226细胞的增殖,CPT单药作用时7个浓度间抑制率的比较差异有统计学意义(P<0.001)、相同浓度间24h和48h抑制率的比较差异有统计学意义(P<0.001)。CPT单药处理R PMI8226细胞24h和48h的半数抑制浓度(IC50)分别为4.839 ng/ml和2.606 ng/ml,24h时1/2 IC50为2.42 ng/ml。Mel以时间-剂量依赖方式抑制RPMI8226细胞的增殖,Mel单药作用时7个浓度间抑制率的比较差异有统计学意义(P<0.001)、相同浓度间24h和48h抑制率的比较差异有统计学意义(P<0.001)。Mel单药处理RPMI8226细胞24h和48h的IC50分别为12.877μg/ml和10.026μg/ml,24h时1/2IC50为6.4385μg/ml。2.细胞增殖实验结果显示,当CPT以1/2 IC50和IC50(2.42 ng/ml、4.839 n g/ml)分别与Mel的7个浓度联合处理RPMI8226细胞,联合用药组抑制率比Mel单药组抑制率明显增高,差异有统计学意义(P<0.001)。Mel以1/2 IC50和IC50(6.4385μg/ml、12.877μg/ml)分别与CPT的不同浓度梯度联合处理RPMI8226细胞,联合用药组与CPT单药组比较抑制率明显增高,差异有统计学意义(P<0.001)。3.经CompuSyn软件分析联合用药指数,结果表明,6.4385μg/ml和12.877μg/ml的Mel同31.25 ng/ml以下的各浓度CPT联合作用时,CI值均小于1,且联合用药组凋亡率较单药组相比抑制率更高,差异有统计学意义(P<0.05)。当2.42ng/ml和4.839ng/ml的CPT同21.09μg/ml以下的各浓度Mel联合作用时,CI值均小于1,且联合用药组凋亡率较单药组相比抑制率更高,差异有统计学意义(P<0.05)。4.839 ng/ml的CPT联合6.4385μg/ml的Mel时CI值最小(CI=0.472),抑制率分别由单药处理时的50%和20%提高至65.95%。总地来说,两药在较低浓度联合使用时,协同效应更强,即使在低浓度下联合使用,其抑制率也均较单药处理组高。4.选择CI最低的两药浓度(CPT 4.839 ng/ml和Mel 6.6742μg/ml),进行细胞凋亡率和坏死率检测。结果显示;同单一用药组相比,联合用药组Annexin-v~+/PI~-和Annexin-v~+/PI~+的阳性率随着药物作用时间的延长均逐渐上升,且均高于单药处理组,Annexin-v~-/PI~+的阳性率基本不变。对照组、Mel单药组、CPT单药组、CPT+Mel组0h凋亡率分别为(2.0±1.45)%、(6.7±2.13)%、(22.2±2.04)%、(19.4±1.23)%,坏死率分别为(1.8±1.69)%、(1.7±2.08)%、(2.3±1.35)%、(2.3±2.47)%。对照组、Mel单药组、CPT单药组、CPT+Mel组2 h凋亡率分别为(4.2±2.32)%、(20.1±1.31)%、(23.4±1.68)%、(21.6±2.34)%,坏死率分别为(4.0±1.49)%、(2.2±2.39)%、(3.4±1.93)%、(2.3±1.93)%。对照组、CPT单药组、Mel单药组、CPT+Mel组4 h凋亡率分别为(6.7±1.23)%、(22.5±2.41)%、(28.2±3.31)%、(32.5±3.17)%,坏死率分别为(1.7±0.97)%、(2.0±2.15)%、(2.8±1.37)%、(4.0±1.15)%。对照组、CPT单药组、Mel单药组、CPT+Mel组6 h凋亡率分别为(20.1±1.72)%、(28.2±2.05)%、(37.4±1.35)%、(48.6±1.55)%,坏死率分别为(2.2±1.97)%、(1.6±1.89)%、(5.4±1.14)%、(6.6±1.02)%。联合用药组凋亡率分别与单药组相比,6h凋亡率差异有统计学意义(P<0.001)。联合用药组坏死率分别与单药组相比,6h坏死率差异无统计学意义(P>0.05)。5.选择CI最低时的两药浓度(CPT 4.839 ng/ml和Mel 6.6742μg/ml),利用RQ-PCR法检测单药处理后及两药联合后凋亡通路上相关基因的表达。结果表明,CPT可使细胞内DR4、DR5、Bax基因的表达增强,同时下调Mcl-1基因的表达;Mel可使细胞内P53、DR5和Bim基因的表达增强,同时抑制Bcl-2和Mcl-1基因的表达。两药联合作用6h后P53、DR4、DR5、Bim和Bax基因的相对表达量较单药组相比显着增高,同时Bcl-2和Mcl-1基因的相对表达较单药组相比显着降低。结论:1.CPT+Mel作用于RPMI8226细胞,低浓度下为协同效应。2.CPT+Mel抑制RPMI8226细胞增殖的主要方式为促进细胞凋亡。3.CPT+Mel抑制RPMI8226细胞增殖的作用机制是协同下调Mcl-1、Bcl-2等抗凋亡基因的表达,上调DR4、DR5、Bim、Bax等促凋亡基因和P53基因的表达。(本文来源于《山西医科大学》期刊2018-05-01）
裴梦婉,靳鸣,陈小琼,肖晖[3]（2016）在《FANCF基因沉默增强多药耐药多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226/R对马法兰的敏感性》一文中研究指出目的:使用小片段干扰RNA(siRNA)沉默FANCF基因表达,观察其对FA/BRCA途径的影响及对多药耐药多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226/R对交联剂马法兰的敏感性变化。方法:FANCF siRNA瞬时转染多药耐药细胞株RPMI8226/R,采用CCK-8法检测转染前后细胞对马法兰的敏感性变化,RT-PCR,westernblot法检测FA/BRCA途径中FANCF、FANCD2、BRCA2基因表达量的改变,彗星实验检测DNA损伤,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:FANCF siRNA转染耐药骨髓瘤细胞后,对马法兰的IC50值由17.29μmol/L降至4.88μmol/L;western-blot检测出瞬时转染FANCF siRNA后FA/BRCA途径中FANCF、FANCD2、BRCA2蛋白表达量明显较转染前减低;彗星实验检测出转染后耐药细胞的DNA损伤增多;转染后马法兰诱导细胞凋亡率由(77.67±0.62)%升高至(88.37±0.25)%,提示FANCF基因沉默可使耐药RPMI8226/R细胞对化疗药物马法兰重新恢复敏感性。结论:FANCF基因沉默可抑制FA/BRCA途径中FANCD2及下游BRCA2基因表达,从而阻断FA/BRCA途径介导的DNA修复,增强马法兰对多药耐药骨髓瘤细胞株RPMI8226/R的细胞毒性,增加细胞凋亡率,为解决临床耐药问题提供一个新的思路。(本文来源于《现代肿瘤医学》期刊2016年18期）
贲海祥[4]（2015）在《沙利度胺联合马法兰、泼尼松治疗难治性复发性骨髓瘤43例》一文中研究指出目的:探析沙利度胺治疗难治性复发性骨髓瘤的效果和安全性。方法:难治性复发性骨髓瘤患者86例分为两组各43例,对照组采用MP方案(马法兰+泼尼松)治疗,观察组在对照组基础上采用沙利度胺治疗,观察并对比两组疗效和不良反应。结果:观察组治疗有效36例(83.7%)显着高于对照组25例(58.1%),两组比较差异有统计学意义(P<0.05);不良反应发生观察组20例(46.5%),对照组19例(44.2%),差异无统计学意义(P>0.05)。结论:沙利度胺治疗难治性复发性骨髓瘤效果确切,有效率高,且未增加不良反应,安全性好。(本文来源于《交通医学》期刊2015年03期）
徐亚琦,张诚,张曦[5]（2015）在《马法兰用于多发性骨髓瘤造血干细胞移植预处理的研究进展》一文中研究指出目的:跟踪马法兰用于多发性骨髓瘤(MM)造血干细胞移植(HSCT)预处理的研究进展。方法:查阅近年来国内外相关文献,将马法兰200、140 mg/m2作为HSCT预处理方案并比较两种方案治疗MM的疗效,以及马法兰其他治疗方案的研究进展进行综述。结果与结论:马法兰200 mg/m2联合自体造血干细胞移植(ASCT)疗效好、并发症少,临床上可作为初诊年龄小于65岁MM患者的标准一线治疗方案;马法兰140 mg/m2在ASCT中作为预处理方案治疗MM的作用是肯定的,但在HSCT中的临床作用尚需进一步论证。马法兰200 mg/m2与140 mg/m2作为预处理方案在HSCT中均有不可替代的作用,但两者之间的优劣性尚无明确一致的临床证据。(本文来源于《中国药房》期刊2015年14期）
熊婷,陈小琼,魏恒,肖晖[6]（2014）在《PJ34对多发性骨髓瘤RPMI8226细胞体外生长及其对马法兰敏感性的影响》一文中研究指出目的:观察PJ34对多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226体外生长的影响以及与小剂量马法兰的协同作用,初步探讨其作用机制。方法:采用MTT法检测细胞增殖抑制率,Western blot方法检测FA/BRCA途径中的相关蛋白表达、流式细胞仪测定细胞周期及凋亡率。结果:PJ34能使细胞发生G2/M期阻滞、协同马法兰诱导细胞凋亡作用。PJ34与马法兰联用与单用马法兰相比,细胞凋亡率由(31.08±0.47)%增至(45.38±4.53)%。PJ34介导的FA/BRCA途径相关因子受抑制及γH2AX表达增强,从而抑制DNA的损伤修复。结论:PJ34对多发性骨髓瘤RPMI8226细胞有显着的抑制作用,并可增加RPMI8226细胞对烷化剂类化疗药物马法兰的敏感性,其作用机制可能是通过抑制FA/BRCA途径对DNA损伤的修复。PJ34与小剂量烷化剂化疗药物合用,是一种安全有效的逆转耐药的治疗方案。(本文来源于《现代肿瘤医学》期刊2014年03期）
郝亚宁,罗媛媛,张梅,李莎莎[7]（2013）在《冬凌草甲素协同马法兰对人骨髓瘤RPMI-8226细胞增殖和凋亡的影响》一文中研究指出目的:观察冬凌草甲素(oridonin)和马法兰(melphalan)单药及联合用药对人骨髓瘤RPMI-8226细胞生长、凋亡和细胞周期的影响及二者的协同作用,阐明药物联合应用对骨髓瘤细胞的毒性增强作用。方法:本实验共设4个RPMI-8226细胞处理组,即空白对照组(未加任何药物)、冬凌草甲素(10μmol.L-1)组、马法兰(30μmol.L-1)组和联合(冬凌草甲素10μmol.L-1+马法兰30μmol.L-1)组。MTT法检测各用药组作用不同时间后RPMI-8226细胞的增殖抑制率,采用两药相互作用指数(CDI)评价联合用药性质;Annexin-Ⅴ/PI双染检测细胞凋亡率;流式细胞术检测药物作用前后细胞周期分布。结果:与空白对照组比较,冬凌草甲素组、马法兰组和联合组RPMI-8226细胞增殖抑制率明显增加(P<0.01),均具有时间-效应依赖性,联合组各时间点细胞增殖抑制率明显高于单药组(P<0.01)。各时间点CDI值均小于1,即冬凌草甲素可协同提高马法兰的细胞毒作用。冬凌草甲素和马法兰单独处理RPMI-8226细胞36h,细胞凋亡率分别为15.01%±0.47%和20.03%±1.30%,而联合组细胞凋亡率为43.06%±1.96%,与单药组比较显着升高(P<0.01)。流式细胞术DNA含量分析,各药物组RPMI-8226细胞主要阻滞于G0/G1期,S期细胞比例明显减少,除冬凌草甲素组S期细胞比例外,其余药物组各期细胞比例与空白对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01),联合组与单药组比较差异亦有统计学意义(P<0.01)。结论:冬凌草甲素联合马法兰通过阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡而抑制骨髓瘤细胞的增殖,其作用具有协同性。(本文来源于《吉林大学学报(医学版)》期刊2013年04期）
吕鸿雁,郝京生,胡晓东,孟建波,杜恒飞[8]（2013）在《去甲斑蝥素增强马法兰抗骨髓瘤作用机制研究》一文中研究指出目的研究去甲斑蝥素联合马法兰对多发性骨髓瘤细胞增殖与凋亡的影响及其作用机制。方法去甲斑蝥素单独或联合马法兰给药后,MTT法观察对人多发性骨髓瘤细胞U266株生长的抑制作用,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blotting检测核因子-κB P65(NF-κB P65)、NF-κB抑制因子IκBα、磷酸化IκBα(p-IκBα)、survivin、Bcl-2和Bax蛋白表达的影响。制备多发性骨髓瘤小鼠模型,观察去甲斑蝥素及其与马法兰联合给药对肿瘤生长的抑制作用。结果去甲斑蝥素能增强马法兰的细胞毒和诱导细胞凋亡作用。与马法兰单独给药组比较,联合给药组使U266细胞核NF-κB P65和胞浆p-IκBα的表达量分别由1.13±0.08、0.83±0.08降至0.26±0.02、0.090±0.002;马法兰对IκBα的表达无影响,但去甲斑蝥素能促进IκBα的表达,二者合用能显着促进胞浆IκBα的表达;与马法兰单独给药组比较,联合给药组survivin和Bcl-2的表达量分别由1.03±0.10、0.72±0.05降至0.52±0.04、0.06±0.01,而Bax由0.29±0.03升至0.75±0.06。体内实验也证实去甲斑蝥素能增强马法兰的抗肿瘤作用。结论去甲斑蝥素通过抑制NF-κB/p-IκBα途径,调节下游信号分子survivin、Bcl-2和Bax的表达,增强马法兰的抗骨髓瘤作用。(本文来源于《中草药》期刊2013年02期）
韦惠琴,钟卫一[9]（2012）在《以口服马法兰为主的预处理外周血干细胞移植治疗恶性血液病的临床观察》一文中研究指出目的观察以口服马法兰为主的预处理方案外周血干细胞移植治疗恶性血液病的疗效及毒副反应。方法对笔者所在医院收治的10例以口服马法兰为主的预处理外周血干细胞移植治疗的恶性血液病患者的临床资料进行分析,临床观察药物的毒副反应并评估造血重建速度及患者预后。结果所有患者中,5例出现胃肠道不适,心前区不适及口腔炎等毒副反应,经对症治疗好转。口服马法兰无明显的毒副作用,预处理总有效率为70%,不同剂量对疗效无差别。结论口服马法兰为主的预处理方案用于外周血干细胞移植治疗恶性血液病是安全有效的;黏膜炎及胃肠道反应是静脉马法兰应用后最常见的副反应。(本文来源于《中国医药科学》期刊2012年20期）
顾晓朦[10]（2012）在《以硼替佐米+马法兰预处理的自体造血干细胞移植治疗多发性骨髓瘤19例》一文中研究指出目的：探讨以硼替佐米+大剂量马法兰为预处理方案行自体造血干细胞移植(autologous stem cell transplantation,, ASCT)治疗多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)的安全性和临床疗效。方法：自2007年12月至2011年10月,本中心对19例接受ASCT的MM患者,采用大剂量CTX联合G-CSF动员外周造血干细胞,应用硼替佐米+大剂量马法兰(万珂1mg/m2-6、-3、+1、+4d;马法兰140mg/m2-2d)进行预处理,随访分析移植后反应率及长期生存情况。结果：(1)19例患者中,1例患者中性粒细胞在移植后19天植入,血小板植入原发失败,移植后7月再次予自体造血干细胞回输后恢复造血,余18例患者顺利获得了造血重建。中性粒细胞植入(≥0.5×109/L)的中位时间为14(12-19)天,血小板植入(≥20×109/L)的中位时间为14(9-∞)天。移植相关不良反应为感染性发热共9例,其中肺部感染2例,腹泻1例,牙龈炎1例,造血重建和对症治疗后均完全恢复。移植相关死亡率为0。(2)19例患者均于移植后1月进行全面评估,13例获得CR(68.42%),6例获得VGPR(31.58%),总有效率100%。中位随访22(4-51)个月,移植后复发8例(42.11%),其中4例进展,1例因疾病进展死亡。1年和3年OS率分别为94%和94%,1年和3年PFS率分别为89%和82%,移植相关死亡率为0。中位总生存(OS)期和无进展生存(PFS)期均尚未获得。(3)移植前获得CR组和VGPR+PR组间2年OS率和PFS率无统计学差异,初始治疗方案是否包含硼替佐米对OS率和PFS率无显着影响。结论：以硼替佐米+马法兰预处理方案行自体造血干细胞移植是治疗多发性骨髓瘤安全有效的方法,是否改善患者的长期生存尚需进一步观察研究。(本文来源于《浙江大学》期刊2012-05-01）
马法兰论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的:本研究以多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226为研究对象,从两个方面观察CPT和马法兰(Melphalan,Mel)单药及联合用药后对细胞增殖的影响:第一,分析CPT和Mel单药及联合用药对RPMI8226细胞的细胞毒性作用;第二,对两药联合作用于RPMI8226细胞后凋亡通路上的相关基因进行检测。通过该研究期望为CPT在多发性骨髓瘤患者(multiple myeloma,MM)临床治疗上扩展新的治疗方案,以提高MM患者的预后。方法:1.人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226的培养和传代人多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226培养与含体积分数为10%的灭活胎牛血清(FBS)、100U/ml的青霉素和100μg/ml硫酸链霉素的的RPMI8226培养液中,置于37℃、体积分数为5%的二氧化碳培养箱中培养,每2-3天传代一次,待细胞处于对数生长期时进行后续实验。2.CCK-8法检测CPT和Mel单药对RPMI8226细胞抑制率的影响取对数生长期的RPMI8226细胞,调整细胞密度为1.5×10~4/ml,接种于96孔培养板中,分别加入7种不同终浓度的CPT(500ng/ml、125ng/ml、31.25 ng/ml、7.8125ng/ml、1.9531ng/ml、0.4883ng/ml、0.1221ng/ml),7种不同终浓度Mel(37.5μg/ml、28.125μg/ml、21.0938μg/ml、15.8203μg/ml、11.8652μg/ml、8.8989μg/ml、6.6742μg/ml),培养不同时间24h和48h,培养结束前4h加入10μl CCK-8试剂,置于37℃、体积分数为5%的二氧化碳培养箱中培养4h,培养结束后上酶标仪测OD值,绘制细胞生长曲线,计算细胞抑制率。每组实验重复3次,取均数和标准差进行统计分析。3.CCK-8法检测CPT+Mel对RPMI8226细胞抑制率的影响取对数生长期的RPMI8226细胞,调整细胞密度为1.5×10~4/ml,接种于96孔培养板中。取抑制率为1/2 IC50和IC50的CPT终浓度分别与Mel7个浓度梯度联合培养24h和48h,计算细胞抑制率。取抑制率为1/2 IC50和IC50的Mel终浓度分别与CPT 7个浓度梯度联合培养24h和48h,计算细胞抑制率。培养结束前4h加入10μl CCK-8试剂,置于37℃、体积分数为5%的二氧化碳培养箱中培养4h,培养结束后上酶标仪测OD值,绘制细胞生长曲线,计算细胞存活率。每组实验重复3次,取均数和标准差进行统计分析。4.选择最佳联合用药方案选择抑制率为1/2 IC50和IC50的CPT浓度与Mel的7个浓度梯度联合作用于RPMI8226细胞24h和48h,计算联合用药后的细胞抑制率。选择抑制率为1/2 IC50和IC50的Mel浓度与CPT的7个浓度梯度联合作用于RPMI8226细胞24h和48h,计算联合用药后的细胞抑制率。计算结果用Compusyn软件评价联合用药对RPMI8226细胞的抑制率与联合用药指数(combination index,CI)的关系,判断药物间的相互作用:CI<1,判定为2药具有协同作用;CI=1,判定为2药具有迭加作用;CI>1,则2药具有拮抗作用。5.流式细胞术检测CPT+Mel对RPMI8226细胞凋亡率的影响根据Compusyn软件计算结果取CI最小时的CPT浓度和Mel浓度进行细胞凋亡率和坏死率的检测。取对数生长期RPMI8226细胞,调整细胞密度为1×10~6/ml,接种于24孔培养板中,设置空白对照组、CPT单药组、Mel单药组、CPT+Mel组,放置在37℃,5%CO_2的培养箱内培养0、2、4、6h。培养完成后,收集各组细胞,并使用PBS离心洗涤后弃掉上清,并加入10μl Annexin V-FITC结合液和10μl PI染色液并混匀。室温下避光放置15 min,上流式细胞仪检测。每组实验重复3次,取均数和标准差进行统计分析。6.实时荧光定量PCR(Realtime quantitative-PCR,RQ-PCR)方法检测CPT和Mel单药及联合用药对RPMI8226细胞凋亡通路相关基因表达的影响取CI最小时的CPT浓度和Mel浓度对细胞凋亡通路上的相关基因进行检测。取对数生长期RPMI8226细胞,调整细胞密度为1×10~6/ml,接种于24孔培养板中,设置空白对照组、CPT单药组、Mel单药组、CPT+Mel组,放置在37℃,5%CO_2的培养箱内培养2、4、6h。培养完成后应用TRIzol法提取总RNA,采用M-Mu Lv(TaKaRa)逆转录酶获得cDNA。逆转录反应条件:95℃预变性2min,94℃变性30S,58℃退火30S,72℃延伸30S,循环35次,72℃再延伸10min。实时荧光定量PCR的反应体系:cDNA(10×稀释)2μl,上游引物(20μmol/L)0.8μl,下游引物(20μmol/L)0.8μl,SYBR Premix Ex Taq ~(TM)Ⅱ10μl,ddH_2O 6μl,ROXⅡ0.4μl。反应条件:95℃预变性10min,95℃变性15S,60℃退火60S,循环35次,72℃再延伸10min。绘制溶解曲线,最终数据以2~(-ΔΔCT)进行分析。每组实验重复3次,取均数和标准差进行统计分析。结果:1.细胞增殖实验结果显示,CPT以时间-剂量依赖方式抑制RPMI8226细胞的增殖,CPT单药作用时7个浓度间抑制率的比较差异有统计学意义(P<0.001)、相同浓度间24h和48h抑制率的比较差异有统计学意义(P<0.001)。CPT单药处理R PMI8226细胞24h和48h的半数抑制浓度(IC50)分别为4.839 ng/ml和2.606 ng/ml,24h时1/2 IC50为2.42 ng/ml。Mel以时间-剂量依赖方式抑制RPMI8226细胞的增殖,Mel单药作用时7个浓度间抑制率的比较差异有统计学意义(P<0.001)、相同浓度间24h和48h抑制率的比较差异有统计学意义(P<0.001)。Mel单药处理RPMI8226细胞24h和48h的IC50分别为12.877μg/ml和10.026μg/ml,24h时1/2IC50为6.4385μg/ml。2.细胞增殖实验结果显示,当CPT以1/2 IC50和IC50(2.42 ng/ml、4.839 n g/ml)分别与Mel的7个浓度联合处理RPMI8226细胞,联合用药组抑制率比Mel单药组抑制率明显增高,差异有统计学意义(P<0.001)。Mel以1/2 IC50和IC50(6.4385μg/ml、12.877μg/ml)分别与CPT的不同浓度梯度联合处理RPMI8226细胞,联合用药组与CPT单药组比较抑制率明显增高,差异有统计学意义(P<0.001)。3.经CompuSyn软件分析联合用药指数,结果表明,6.4385μg/ml和12.877μg/ml的Mel同31.25 ng/ml以下的各浓度CPT联合作用时,CI值均小于1,且联合用药组凋亡率较单药组相比抑制率更高,差异有统计学意义(P<0.05)。当2.42ng/ml和4.839ng/ml的CPT同21.09μg/ml以下的各浓度Mel联合作用时,CI值均小于1,且联合用药组凋亡率较单药组相比抑制率更高,差异有统计学意义(P<0.05)。4.839 ng/ml的CPT联合6.4385μg/ml的Mel时CI值最小(CI=0.472),抑制率分别由单药处理时的50%和20%提高至65.95%。总地来说,两药在较低浓度联合使用时,协同效应更强,即使在低浓度下联合使用,其抑制率也均较单药处理组高。4.选择CI最低的两药浓度(CPT 4.839 ng/ml和Mel 6.6742μg/ml),进行细胞凋亡率和坏死率检测。结果显示;同单一用药组相比,联合用药组Annexin-v~+/PI~-和Annexin-v~+/PI~+的阳性率随着药物作用时间的延长均逐渐上升,且均高于单药处理组,Annexin-v~-/PI~+的阳性率基本不变。对照组、Mel单药组、CPT单药组、CPT+Mel组0h凋亡率分别为(2.0±1.45)%、(6.7±2.13)%、(22.2±2.04)%、(19.4±1.23)%,坏死率分别为(1.8±1.69)%、(1.7±2.08)%、(2.3±1.35)%、(2.3±2.47)%。对照组、Mel单药组、CPT单药组、CPT+Mel组2 h凋亡率分别为(4.2±2.32)%、(20.1±1.31)%、(23.4±1.68)%、(21.6±2.34)%,坏死率分别为(4.0±1.49)%、(2.2±2.39)%、(3.4±1.93)%、(2.3±1.93)%。对照组、CPT单药组、Mel单药组、CPT+Mel组4 h凋亡率分别为(6.7±1.23)%、(22.5±2.41)%、(28.2±3.31)%、(32.5±3.17)%,坏死率分别为(1.7±0.97)%、(2.0±2.15)%、(2.8±1.37)%、(4.0±1.15)%。对照组、CPT单药组、Mel单药组、CPT+Mel组6 h凋亡率分别为(20.1±1.72)%、(28.2±2.05)%、(37.4±1.35)%、(48.6±1.55)%,坏死率分别为(2.2±1.97)%、(1.6±1.89)%、(5.4±1.14)%、(6.6±1.02)%。联合用药组凋亡率分别与单药组相比,6h凋亡率差异有统计学意义(P<0.001)。联合用药组坏死率分别与单药组相比,6h坏死率差异无统计学意义(P>0.05)。5.选择CI最低时的两药浓度(CPT 4.839 ng/ml和Mel 6.6742μg/ml),利用RQ-PCR法检测单药处理后及两药联合后凋亡通路上相关基因的表达。结果表明,CPT可使细胞内DR4、DR5、Bax基因的表达增强,同时下调Mcl-1基因的表达;Mel可使细胞内P53、DR5和Bim基因的表达增强,同时抑制Bcl-2和Mcl-1基因的表达。两药联合作用6h后P53、DR4、DR5、Bim和Bax基因的相对表达量较单药组相比显着增高,同时Bcl-2和Mcl-1基因的相对表达较单药组相比显着降低。结论:1.CPT+Mel作用于RPMI8226细胞,低浓度下为协同效应。2.CPT+Mel抑制RPMI8226细胞增殖的主要方式为促进细胞凋亡。3.CPT+Mel抑制RPMI8226细胞增殖的作用机制是协同下调Mcl-1、Bcl-2等抗凋亡基因的表达,上调DR4、DR5、Bim、Bax等促凋亡基因和P53基因的表达。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
马法兰论文参考文献
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