赵计林[1]2003年在《问号赖型钩端螺旋体毒力新基因的筛选及其功能研究》文中提出钩端螺旋体是结构和遗传特征都较特殊的一类微生物，它所导致的钩端螺旋体病是在世界范围内流行的人兽共患自然免疫源性疾病，严重危害人类健康和农牧业生产。阐明钩端螺旋体的致病机制是控制本病的关键环节。由于结构和遗传特征的特殊性，大多数细菌学研究方法不适于钩体研究，与致病或毒力相关的基因研究报道很少，致使钩体致病的分子机制研究进展缓慢。 致病微生物与非致病微生物差异基因的研究对阐明致病微生物的致病机制具有重要的意义。本研究以抑制消减杂交技术(Substration Suppressive Hybridization，SSH)筛选得到致病钩体与非致病钩体的差异基因片段，采用盒式连接半巢式PCR技术扩增其相邻两侧未知序列，进行序列测定、生物信息学分析及功能鉴定，对赖型钩体的分子致病机制及疾病防治具有重要理论意义和应用价值。四川大学博士论文问号赖型钩端螺旋体毒力新基因的筛选及其功能研究 本研究根据SSH技术筛选的赖型钩体017株特异性存在基因片段 (GeneBank登录号AF325818)，设计引物进行盒式连接半巢式PCR扩增相邻两侧未知序列，PCR纯化产物T载体克隆，选取阳性克隆测序，进一步进行生物信息学分析，获得了强毒株赖型钩体017株外膜蛋白新基因OMPL17，将所得序列登录GenBank，登录号为AF534704。进而以OMPL17DNA序列为标记探针，与同株来源的弱毒力问号赖型钩端螺旋体56601株的基因组DNA进行DOT BLOT杂交。同时，以OMPL17及其侧翼DNA序列设计引物，分别以017株及56601株基因组DNA为模板进行PCR扩增。结果证明OMPL17基因为问号赖型钩端螺旋体56601株缺失，017株具有的差异新基因。这与应用BLASTZsequenees对oMpL17DNA及56601基因组DNA对L匕检索结果一致。同源性分析提示可能与钩体毒力有关。 为了研究钩体017株外膜蛋白新基因OMPL17的功能，采用自杀质粒PZNI以能在大肠杆菌JM 109中复制，而在钩体017株内不能复制，构建了插入失活型基因打靶载体(将氨节抗生素抗性基因插入到OMPL17的开放阅读框架内)，通过电穿孔方式将打靶载体转入钩体017株中，依靠同源重组原理将含有氨节抗性基因的突变靶基因置换掉017株染色体上靶基因OMPL17，实现对OMPL17基因的靶向灭活。OMPL17敲除后的突变株经豚鼠攻击实验，表明其毒力明显减弱。 为了给基因敲除后产生的突变株后续研究提供实验材料，同时为多个基因突变、精细突变(如点突变)提供技术思路，又利用自杀质粒PZML构建了非标记删除突变置换型打靶载体(采用反向PcR方法删四川大学博士论文问号赖型钩端螺旋体毒力新基因的筛选及其功能研究除OMPL17开放阅读框架部分序列)，碱变性处理后电穿孔转入钩体017株，产生减毒株，豚鼠攻击实验证实各项毒力指标与上述突变株相当，其毒力明显弱于野生017株。 为了证实差异新基因编码钩体外膜蛋白，应用表达载体PGEXI一人T构建原核重组表达质粒，对OMPL17进行原核表达后，制备兔抗血清。分别提取上述突变株及减毒株外膜蛋白，进行聚丙烯酞胺凝胶电泳及免疫印迹，结果显示突变株及减毒株在28KDa处缺失外膜蛋白条带。 本研究首次筛选出问号赖型钩端螺旋体强毒株017外膜蛋白差异新基因，并为证实其为毒力基因提供了重要证据，为拥有我国自主基因知识产权、独立开发我国特有的基因资源作出贡献，同时为阐明钩体致病的分子机制奠定基础。将基因打靶技术应用致病钩体基因功能研究上，为钩体的分子、免疫、遗传进化等提供了新的思路和技术手段。设计非标记删除突变基因打靶技术并应用于钩体毒力基因敲除上，为钩体新型疫苗的研制、新型药物的开发等后续研究提供了实验资料。同时为基因打靶技术的运用提供了新的思路和策略。
张会东[2]2006年在《赖型钩端螺旋体毒力相关基因ompl17的蛋白质功能学研究》文中提出钩端螺旋体病(简称钩体病)是由钩端螺旋体引起的一种人兽共患自然免疫源性疾病，它在世界范围内流行，并严重危害人类的健康和农牧业生产。钩端螺旋体(简称钩体)在结构和遗传特征上都比较特殊，因而大多数细菌学研究方法不适于钩体研究。随着中国南方中心对赖型钩体56601的测序完成，为钩体病的研究提供了新的契机，但是与钩体致病或毒力相关的因子研究报道还相对较少，致使钩体致病的分子机制研究进展缓慢。因此，阐明钩端螺旋体的致病机制是控制本病的关键环节。 本室曾以抑制消减杂交技术(Substration Suppressive Hybridization，SSH)筛选得到致病钩体与非致病钩体的差异基因片段，并采用盒式连接半巢式PCR技术扩增出ompl17基因，进行序列测定、生物信息学分析，同时采用基因打靶技术进行了功能的初步分析和探讨。本研究既往工作的基础上，对赖型钩体ompl17基因进行扩增表达，制备抗血清，分析该基因在赖型钩体体内外和不同温度下表达情况，同时对该蛋白进行表达纯化，采用构建血管内皮细胞基底膜进行血细胞的趋化分析，以及采用酵母双杂交技术钓取ompl17基因在体内相互作用的靶蛋白，为阐明钩体分子致病机制作出新的探索。
朱庆平[3]2005年在《赖型钩端螺旋体致病相关基因invA的克隆、表达及其功能研究》文中研究说明钩体为广泛流行的人兽共患病——钩体病的病原体。目前,对钩体的致病及免疫分子机理的认识不甚清楚。赖型钩体56601株及哥本哈根株基因组测序表明,约60%的钩体预测基因的功能未知。因此,钩体的重要致病及免疫相关基因功能急需加强研究。 invA基因存在于致病的赖型钩体56601株及哥本哈根株中,信息分析表明,该基因与巴尔通体内的与编码侵袭能力相关蛋白IalA的基因等具有很高的相似性;以PCR扩增试验也证实,invA基因存在于强毒赖型钩体017株中,但不存在于无毒钩体Patoc Ⅰ株中。提示invA基因很可能为致病相关基因,同时,也很可能是一个免疫侯选基因及用于钩体诊断的目的基因。 本研究选择赖型钩体017株中invA基因为目标,PCR扩增出含完整读码框的invA基因,与原核表达载体pET32a(+)连接构建重组表达载体pETINVA,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出分子量约为35kDa的InvA融
刘洪斌, 戴保民, 章涛, 李胜富, 方之茂[4]2000年在《问号赖型钩端螺旋体重组质粒pDL121及其表达产物的初步研究》文中研究指明目的 :探讨问号赖型钩端螺旋体重组质粒pDL12 1外源基因及其表达产物 2 3kDa蛋白的特点。方法 :用 6种内切酶对pDL12 1行酶谱分析 ,用Digoxin标记的pDL12 1外源基因片段作探针对不同种属的钩体进行杂交 ,用SDS -PAGE制备 2 3kDa蛋白 ,Westernblot鉴定其免疫原性。结果 :pDL12 1外源基因没有 6种内切酶的酶切位点 ,重组探针与致病性钩体 (serovarlaistrain 0 17,serovarhebdomadisstrain 5 6 6 10 ,serovarpomonastrain 5 6 6 0 8)有杂交信号 ,与非致病性钩体 (serovarpatocstrainPatocI,serovarillinistrain 30 5 5 )无杂交信号 ,亦不识别大肠杆菌。2 3kDa兔抗血清可识别pDL12 1体外表达的 2 3kDa蛋白带和赖型钩体 0 17株超声抗原成份 ;其抗体滴度为 1/12 80 0 ;用pDL12 1细菌裂解液主动免疫豚鼠 ,可使豚鼠抵抗强毒力株钩体攻击。结论 :pDL12 1外源基因可能是赖型钩体的一个新基因 ;该重组探针能鉴别致病性钩体和非致病性钩体 ;2 3kDa抗原有良好的免疫原性 ,可能是赖型钩体 0 17株的保护性抗原
于向华, 鲍朗, 谢勇恩, 张会东[5]2002年在《钩端螺旋体赖型017鞭毛钩相关蛋白K基因的克隆及序列分析》文中研究表明在以抑制消减杂交比较强毒株赖型钩端螺旋体017株和无毒株双曲钩体Patoc I株 的基因组差异时,获得了一系列仅存在于强毒株而无毒株缺如的差异片段.选取差异片段AF325810设计特异性引物,以赖型钩端螺旋体017株基因组DNA为模板,进行巢式PCR扩增,PCR纯化产物T载体克隆,选取阳性克隆测序,进一步进行生物信息学分析,以获得强毒株赖型钩端螺旋体017株特有的毒力相关基因,DOT BLOT显示其在钩端螺旋体各株间有不同分布PCR扩增得到了产物为2kb大小的DNA片段,序列分析结果显示得到了问号钩端螺旋体赖型017株的鞭毛钩相关蛋白K基因的上游序列,为进一步探索钩端螺旋体的致病机制奠定了基础.
参考文献：
[1]. 问号赖型钩端螺旋体毒力新基因的筛选及其功能研究[D]. 赵计林. 四川大学. 2003
[2]. 赖型钩端螺旋体毒力相关基因ompl17的蛋白质功能学研究[D]. 张会东. 四川大学. 2006
[3]. 赖型钩端螺旋体致病相关基因invA的克隆、表达及其功能研究[D]. 朱庆平. 四川大学. 2005
[4]. 问号赖型钩端螺旋体重组质粒pDL121及其表达产物的初步研究[J]. 刘洪斌, 戴保民, 章涛, 李胜富, 方之茂. 中国病理生理杂志. 2000
[5]. 钩端螺旋体赖型017鞭毛钩相关蛋白K基因的克隆及序列分析[J]. 于向华, 鲍朗, 谢勇恩, 张会东. 生命科学研究. 2002