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PL3基因编辑水稻编辑位点检测方法的研究

2020-12-02阅读(967)

PL3基因编辑水稻编辑位点检测方法的研究

论文摘要

随着基因编辑技术日渐成熟,基因编辑作物不断涌现。本研究对PL3基因编辑水稻编辑位点进行检测研究,以期为基因编辑作物定量检测方法提供技术支持,满足基因编辑作物产品产业化定量标识的需求。以PL3基因编辑水稻为研究对象,以焦磷酸测序、HRM(高分辨率溶解曲线)、双重微滴数字PCR为分析工具,对PL3基因编辑水稻编辑位点进行精准定量检测。(1)通过对PL3基因编辑型水稻编辑位点焦磷酸测序引物设计、引物有效性检测、基因分型定型检测、基因分型定量检测、盲样检测等试验,建立了PL3基因编辑水稻编辑位点焦磷酸测序检测方法。(2)通过PL3基因编辑型水稻编辑位点HRM引物设计、引物有效性分析,反应体系、反应条件优化及分型定量等试验,确定了HRM反应引物浓度和退火温度的最佳组合为0.4μmol/L和58°C,检出限不低于10%,建立了PL3基因编辑水稻编辑位点HRM检测方法。(3)通过PL3基因编辑型水稻编辑位点双重数字PCR引物和探针设计、反应体系的建立、定量范围检测、LOQ验证等试验,确定了数字PCR反应引物浓度和探针浓度分别为0.4μmol/L和0.15μmol/L,最佳退火温度为62.4℃,最低检出限为0.05%。建立了PL3基因编辑水稻编辑位点双重微滴数字PCR检测方法。因此本研究建立的3种检测方法灵敏度高、准确性强,可以用于PL3基因编辑型水稻编辑位点定性检测和精准的定量分析。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 引言
  •   1.1 基因编辑技术
  •     1.1.1 基因编辑技术的原理与分类
  •     1.1.2 CRISPR/Cas9技术在植物育种中的应用
  •     1.1.3 CRISPR/Cas9技术在水稻中的应用
  •     1.1.4 国际基因组编辑植物安全评价及监管现状
  •     1.1.5 我国基因组编辑作物安全管理
  •   1.2 基因编辑作物检测方法
  •     1.2.1 焦磷酸测序技术
  •     1.2.2 高分辨率溶解曲线技术
  •     1.2.3 数字PCR技术
  •   1.3 研究目的与内容
  •     1.3.1 研究目的
  •     1.3.2 研究内容
  •     1.3.3 技术路线图
  • 第二章 试验材料与DNA分子鉴定
  •   2.1 试验材料
  •   2.2 试验仪器
  •   2.3 试验试剂
  •   2.4 DNA分子鉴定
  •     2.4.1 基因组DNA提取
  •     2.4.2 引物设计
  •     2.4.3 DNA分子验证
  •   2.5 结果与分析
  •     2.5.1 基因型PCR结果分析
  •     2.5.2 测序结果分析
  • 第三章 PL3基因编辑水稻焦磷酸测序检测技术研究
  •   3.1 试验仪器和试剂
  •     3.1.1 试验仪器
  •     3.1.2 试验试剂
  •   3.2 试验方法
  •     3.2.1 引物设计
  •     3.2.2 PL3基因编辑水稻焦磷酸测序引物有效性检测
  •     3.2.3 PL3基因编辑水稻焦磷酸测序基因分型定性检测
  •     3.2.4 PL3基因编辑水稻焦磷酸测序基因分型定量检测
  •   3.3 结果与分析
  •     3.3.1 PL3基因编辑水稻焦磷酸测序引物有效性检测
  •     3.3.2 PL3基因编辑水稻焦磷酸测序基因分型定性检测
  •     3.3.3 PL3基因编辑水稻焦磷酸测序基因分型定量检测
  •   3.4 小结
  • 第四章 PL3基因编辑水稻高分辨率溶解曲线检测技术研究
  •   4.1 试验仪器和试剂
  •     4.1.1 试验仪器
  •     4.1.2 试验试剂
  •   4.2 试验方法
  •     4.2.1 引物设计
  •     4.2.2 引物有效性检测
  •     4.2.3 基因分型定性检测
  •     4.2.4 退火温度和引物浓度优化
  •     4.2.5 基因分型定量检测
  •   4.3 试验结果与分析
  •     4.3.1 PL3基因编辑水稻高分辨率溶解曲线检测引物有效性
  •     4.3.2 PL3基因编辑水稻高分辨率溶解曲线检测基因分型定性检测
  •     4.3.3 PL3基因编辑水稻高分辨率溶解曲线检测体系优化
  •     4.3.4 PL3基因编辑水稻高分辨率溶解曲线检测基因分型定量检测
  •   4.4 小结
  • 第五章 PL3基因编辑水稻双重数字PCR检测技术研究
  •   5.1 试验仪器和试剂
  •     5.1.1 试验仪器
  •     5.1.2 试验试剂
  •   5.2 试验方法
  •     5.2.1 引物和探针设计
  •     5.2.2 反应体系的建立及稳定性试验
  •     5.2.3 方法特异性试验
  •     5.2.4 引物、探针及退火温度的优化
  •     5.2.5 定量范围检测
  •     5.2.6 最低检出限LOQ验证
  •   5.3 结果与分析
  •     5.3.1 PL3基因编辑水稻双重数字PCR检测的稳定性和特异性
  •     5.3.2 PL3基因编辑水稻双重数字PCR检测的条件优化
  •     5.3.3 PL3基因编辑水稻双重数字PCR检测的定量范围
  •   5.4 小结
  • 第六章 讨论与结论
  •   6.1 讨论
  •   6.2 结论
  • 参考文献
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 王燕

    导师: 刘惠芬,王永

    关键词: 基因编辑水稻,检测方法,焦磷酸测序,数字

    来源: 天津农学院

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,生物学,农作物

    单位: 天津农学院

    分类号: S511;Q943.2

    总页数: 53

    文件大小: 3692K

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