猪场黏菌素耐药基因的流行及传播机制研究

论文摘要

近年来,因抗生素的广泛及不合理使用,细菌的耐药性越来越严重,黏菌素成为人类及动物防御多重耐药革兰阴性菌感染的最后一道防线。自2016年中国首次报道质粒介导的黏菌素耐药基因mcr-1之后,该基因在世界各地不同来源不同种属的细菌中陆续被检测到。随后质粒介导的其他粘菌素抗性基因,也在人源和动物源细菌中被检测出来。质粒介导的黏菌素耐药基因的出现和传播给人类健康和公共安全带来严重威胁。本研究旨在了解河南部分地区猪场大肠杆菌的耐药情况并对质粒介导的耐药基因的传播机制进行研究,为猪场合理用药提供科学依据。2017年10月从河南省三个猪场采集了 309份猪粪便拭子样品,通过分离鉴定得到大肠杆菌菌株302株,采用琼脂稀释法检测分离菌株对氨苄西林、头孢噻肟、庆大霉素、卡那霉素、阿米卡星、多西环素、氟苯尼考、多粘菌素、磷霉素、环丙沙星、乙酰甲喹共11种抗菌药的敏感性。结果显示,猪源大肠杆菌对11种药物表现出不同程度的耐药,耐药率在4.30%～87.75%之间,其中对氨苄西林的耐药率最高,为87.75%,其次是氟苯尼考,耐药率为80.79%,对黏菌素的耐药率最低,为4.30%,对阿米卡星和磷霉素的耐药率较低,均在7%左右。多重耐药现象严重,耐三种及以上药物的菌株占80.10%（n=242）。三个猪场对1 1种抗菌药物的耐药趋势相似,其中,对氨苄西林的耐药率较高,在82%～91%之间。偃师猪场和西平猪场对环丙沙星和头孢噻肟的耐药率差异显著,偃师猪场对这两种药的耐药率是西平猪场对这两种药的耐药率（17.9%）的2倍,偃师猪场的耐药情况最严重。采用PCR和测序方法对13株具有黏菌素耐药表型的大肠杆菌进行黏菌素耐药基因及其他耐药基因fosA3、blaCTX-M、blaNDM的检测,结果显示,13株黏菌素耐药菌都携带mcr-1基因,没有检测到mcr的其他突变体;有1株同时携带blaNDM-1,4株携带fosA3,7株携带blaCTX-M,包括 blaCTX-M-55（n=4）、blaCTX-M-27（n=1）和blaCTX-M-14（n=2）。其中有两株菌同时携带mcr-1、fosA3和blaCTX-M。对mcr-1的基因环境进行测序分析共发现了 4种基因环境,其中有1株在mcr-1的上下游均检测到插入序列ISApl1,并能形成环形中间体ISApl1-mcr-1-pap2,7株在mcr-1的上下游均未测到ISApl1,4株仅在mcr-1基因的上游检测到ISApl1,1株在mcr-1的上游检测到ISApl1下游为截短的ISApl1,即ISApl1-mcr-1-Apap2-△ISApl1。通过接合实验研究13株mcr-1阳性大肠杆菌中mcr-1的可转移性,结果有5株接合成功,另外8株菌经过多次接合均不成功。对5株接合子携带的质粒进行复制子分型,结果显示有三种质粒类型,包括IncF-IncN、IncI2、IncHI2。对携带IncF-IncN质粒供体菌株D72进行全基因组测序分析,序列分析显示,菌株D72的染色体携带大环内酯类抗性基因mdf（A）和编码谷氨酸脱羧酶的毒力基因gad,其质粒上携带粘菌素抗性基因mcr-1,β-内酰胺抗性基因blaTEM-238和bfaCTX-M-55,氨基糖苷类抗性基因aph（3’）-Ia,喹诺酮类抗性基因qnrS2,氟苯尼考抗性基因floR。其中blaTEM-238是TEM酶的一个新亚型。结合Sl-PFGE实验结果,D72携带四条大小不同的质粒,其中mcr-1位于96,320bp的质粒pD72-mcrl上,该质粒是一种类噬菌体质粒,另外三个质粒的复制子型分别是IncN-F33:A-:B-、IncXI、IncP。D72C接合子携带的质粒是原菌中两个质粒的融合。综上所述,河南部分地区猪场的猪源大肠杆菌耐药性较严重,不同场的用药习惯不同可能会导致不同的耐药谱型;被检测猪场仍以mcr-1流行为主,没有检测到其他粘菌素耐药基因亚型;mcr-1不仅能够通过转座元件ISApl1和可接合性质粒进行传播,还可以通过质粒融合的方式进行传播,这必将加快该基因的传播,给畜牧业及人类健康构成威胁。

论文目录

致谢

摘要

文献综述

1.1 大肠杆菌病原学及形态特征

1.2 大肠杆菌耐药现状

1.3 乳菌素相关介绍

1.3.1 黏菌素及抗菌机理

1.3.2 细菌对黏菌素的耐药情况

1.4 mcr-1基因与其他mcr-like基因的流行情况

1.4.1 mcr-1在细菌间的传播

1.4.2 mcr-1国际流行趋势

1.4.3 mcr-like基因的流行情况

1.5 mcr-1的传播

1.7 研究目的与意义

试验一猪源大肠杆菌的分离鉴定及其耐药性分析

1 引言

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌株来源

2.1.2 试验药品

2.1.3 培养基

2.1.4 试验仪器

2.2 方法

2.2.1 样品采集

2.2.2 大肠杆菌的分离纯化与鉴定

2.2.3 菌株的保存

2.2.4 药敏试验

3 结果与讨论

3.1 结果

3.1.1 大肠杆菌分离鉴定结果

3.1.2 大肠杆菌的药敏试验结果

3.2、讨论

4、结论

试验二黏菌素耐药基因的检测及其基因环境的分析

1、引言

2、试验材料与方法

2.1 材料

2.1.1 实验菌株

2.1.2 试验试剂

2.1.3 仪器

2.2 方法

2.2.1 mcr-like耐药基因及其他耐药基因的PCR检测

3、结果与讨论

3.1 结果

3.1.1 耐药基因检测

3.1.2 mcr-1基因环境分析

3.2 讨论

4、结论

试验三、mcr-1传播机制的研究

1、引言

2、材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 受试菌株

2.1.2 培养基

2.2.3 试验试剂

2.2.4 主要仪器

2.2 方法

2.2.1 接合试验

2.2.2 复制子分型

2.2.3 S1-PFGE

2.2.4 全基因组测序和分析

3、结果与讨论

3.1 结果

3.1.1 接合试验结果

3.1.2 复制子分型结果

3.1.3 S1-PFGE结果分析

3.1.4 全基因组序列测序结果

3.1.5 质粒序列分析

3.1.6 序列注释及提交

3.2 讨论

4 结论

全文总结

参考文献

英文摘要

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 朱莹莹

导师: 胡功政,贺丹丹

关键词: 大肠杆菌,粘菌素,质粒

来源: 河南农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 河南农业大学

基金: 国家自然科学基金项目(No.31702295)

分类号: S852.61

DOI: 10.27117/d.cnki.ghenu.2019.000379

总页数: 62

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