利用CRISPR/Cas9系统构建MDV meq基因缺失株及其检测方法的建立

论文摘要

鸡马立克氏病（Marek’s disease,MD）是一种由鸡马立克氏病病毒（Marek’s disease virus,MDV）引起的、鸡的淋巴组织增生性传染病,该病给养禽业造成巨大的经济损失。MD疫苗的使用很好地控制了该病,但其病原MDV呈现持续进化的趋势,给该病的防控带来困难。基因缺失疫苗由于删除了致病基因、同时最大程度保留了免疫原性,是最有发展前景的MD疫苗,这种疫苗具有良好的安全性和更高的免疫效力。由于MD疫苗不能建立免疫屏障,不能阻止野毒感染,为MDV的检测和监控带来困难。对MDV流行毒株的流行病学、病原学研究和新疫苗的开发是控制该病的主要措施。发展更好的病毒基因编辑技术和检测、监测方法是非常有必要的。本实验室分离的一株MDV野毒株BS/15株,基因分析表明其具有中国流行毒株的特有突变,同时其在体内复制能力强,具有更强的溶细胞感染能力和表现“晚毒力”特征。以其为亲本病毒构建基因缺失疫苗,具有成为高效MD疫苗的潜力。本研究利用CRISPR/Cas9技术,以BS/15株为研究模型,对其基因组中的主要致瘤基因meq基因进行了缺失。试验中,依据中国MDV分离株BS/15株的meq基因序列,设计了8条靶向meq基因的小向导RNA（sgRNA）,分别克隆到pX330质粒中,构建了表达靶向meq基因sgRNA的质粒pMeq-sgRNA。通过pMeq-sgRNA转染、测序分析方法初步评价sgRNA切割效果,选择了两条适合的sgRNA。在鸡胚成纤维细胞（CEF）上同时转染上述筛选的2个pMeq-sgRNA质粒,接种MDV分离株BS/15株,通过PCR检测筛选meq基因缺失克隆株,成功克隆到一株meq基因缺失毒株rBS△Meq株。序列分析证明获得的MDV重组毒株已按预期的切割位置缺失掉meq基因序列。体外实验证明缺失毒株与亲本毒株在CEF上具有相似的复制能力。本研究提供了一种简单、快捷的编辑MDV基因的方法,为MDV功能基因、分子进化和新型基因工程疫苗的研究提供了技术支持。为了有效检测和监测MDV基因修饰株和MDV分离株,本研究基于meq基因缺失株rBS△Meq株和另一株rMS△Meq株建立了能分别定量区分MDV分离株与meq基因缺失株的荧光定量PCR方法,体外实验证实这些荧光定量PCR方法能分别准确定量meq基因缺失株和MDV分离株,检测灵敏度高、特异性好、稳定性高。这对于MD的诊断、疫苗的免疫监控等具有重要意义。综上,本研究建立了一种利用CRISPR/Cas9系统编辑MDV分离毒株的方法,并利用该方法构建了一株MDV meq基因缺失毒rBS△Meq株,为新型基因缺失疫苗的研制和基因功能、分子进化研究提供了技术支持。同时,建立了区分MDV分离株和MDV meq基因缺失株的q-PCR方法,对研究MDV的感染进程、疫苗的免疫监控和MD的发生诊断有重要意义和应用价值。

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摘要

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英文缩略表

第一章引言

1.1 鸡马立克氏病（MD）

1.2 鸡马立克氏病病毒（MDV）及其基因组结构

1.3 MDV的主要功能基因

1.4 MDV的毒力演化

1.5 MDV的分子变异

1.6 MDV功能基因研究

1.7 本研究的目的意义

第二章利用CRISPR/Cas9系统构建MDV meq基因缺失株的研究

2.1 材料

2.1.1 病毒和SPF鸡胚

2.1.2 主要试剂

2.1.3 实验仪器

2.2 方法

2.2.1 sgRNA的设计

2.2.2 pX330质粒酶切和胶回收

2.2.3 pMeq-sgRNA质粒构建

2.2.4 PCR检测引物设计及分布

2.2.5 pMeq-sgRNA初步筛选

2.2.6 pMD-18T-GFP质粒构建

2.2.7 pCAGGS-GFP质粒构建

2.2.8 MDV△Meq重组毒拯救及体外生物学特性分析

2.2.9 MDV荧光重组毒拯救

2.3 结果

2.3.1 pX330质粒酶切结果

2.3.2 pMeq-sgRNA初步筛选

2.3.3 pMD-18T-GFP质粒构建结果

2.3.4 pCAGGS-GFP质粒构建结果

2.3.5 MDV△Meq重组毒拯救结果

2.3.6 MDV荧光重组毒拯救结果

2.4 讨论

第三章区分中国MDV野毒株与meq基因缺失株方法的建立

3.1 材料

3.1.1 病毒、SPF鸡胚和SPF鸡

3.1.2 主要试剂

3.1.3 实验仪器

3.2 方法

3.2.1 区分中国MDV野毒株与rBS△Meq株荧光定量PCR方法建立

3.2.2 区分中国MDV野毒株与rMS△Meq株荧光定量PCR方法建立

3.3 结果

3.3.1 区分中国MDV野毒株与rBS△Meq株荧光定量PCR方法建立

3.3.2 区分中国MDV野毒株与rMS△Meq株荧光定量PCR方法建立

3.4 讨论

第四章全文结论

参考文献

致谢

项目资助

作者简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张峰

导师: 刘长军

关键词: 鸡马立克氏病病毒,基因,基因编辑,荧光定量

来源: 中国农业科学院

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国农业科学院

基金: 黑龙江省自然科学基金(C2018068),国家自然科学基金(31670155),国家重点研发计划(2016YFE0203200,2017YFD0500704,2017YFD0500101,2017YFD0500704)

分类号: S858.31;Q78

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