导读:本文包含了抑制结构域论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:蛋白,结构,磷酸酶,抑制,酪氨酸,小环,病毒。
抑制结构域论文文献综述
刘继东,杨燕,刘莹[1]（2019）在《慢病毒靶向溴样结构域蛋白4通过抑制SHH通路对非小细胞肺癌细胞A549能量代谢水平的影响》一文中研究指出目的:探究溴样结构域蛋白4(BRD4)siRNA通过SHH通路对非小细胞肺癌细胞A549能量水平的影响。方法:RT-qPCR分析非小细胞肺癌细胞A549、HLF-1细胞内BRD4表达水平;将BRD4 siRNA转入A549细胞内,细胞计数试剂盒-8(CCK-8)和细胞克隆形成实验检测BRD4 siRNA对A549生长增殖的影响;2-[N-(7-硝基苯并-2-氧-1,3-二唑-4-基)氨基]-2-脱氧葡萄糖法(2-NBDG)法和乳酸检测试剂盒检测BRD4 siRNA对A549细胞葡萄糖摄取率和乳酸生成量的影响;RT-qPCR和Western blot检测BRD4 siRNA对基因SHH、胶质瘤相关癌基因同源物1(GLI1)的mRNA和蛋白表达水平的影响。结果:BRD4基因在A549细胞中上调表达(P<0.05);BRD4 siRNA对A549细胞的增殖、克隆形成、葡萄糖摄入和乳酸生成具有抑制作用(P<0.05),且能够促进SHH和GLI1基因的mRNA和蛋白表达显着下调(均P<0.05)。结论:慢病毒靶向BRD4基因能够通过抑制SHH通路降低非小细胞肺癌细胞A549的能量代谢水平。(本文来源于《内科急危重症杂志》期刊2019年05期）
潘冠和,杨笑涵,廖雁玲,杨昭群,刘耀洪[2]（2019）在《重组登革病毒包膜蛋白第Ⅲ结构域抑制登革病毒感染的研究》一文中研究指出目的通过原核基因工程技术获得登革2型病毒(DENV2)包膜蛋白第Ⅲ结构域(EDⅢ)重组蛋白,检测其抑制登革病毒感染细胞的效率。方法利用聚合酶链反应技术扩增DENV2编码EDⅢ重组蛋白的基因片段,构建pET28b(+)-EDⅢ原核表达载体并在大肠埃希菌中诱导EDⅢ重组蛋白表达,进行质谱鉴定。将登革病毒感染VeroE6细胞(经EDⅢ重组蛋白孵育),根据空斑减少数量计算EDⅢ重组蛋白对登革病毒感染的抑制率。结果成功表达并纯化EDⅢ重组蛋白。EDⅢ重组蛋白可以抑制登革病毒感染的VeroE6细胞,且抑制率与蛋白水平呈正相关,当蛋白水平为100μg/mL时,病毒抑制率为90.5%。结论 DENV2EDⅢ重组蛋白能够抑制DENV2吸附和感染细胞,为以EDⅢ重组蛋白为靶标研制药物和疫苗提供重要的实验基础。(本文来源于《检验医学与临床》期刊2019年16期）
牛国娟[3]（2019）在《两种含Ig结构域蛋白以及STAT激活抑制蛋白在日本囊对虾先天免疫中的功能研究》一文中研究指出日本囊对虾Marsupenaeus japonicus作为重要的对虾养殖品种之一,每年可为水产业带来巨额的经济利润。但对虾的养殖过程中容易遭受一些病原微生物的侵害,包括白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)、黄头病毒、传染性肌肉坏死病毒、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、副溶血弧菌(V.parahemolyticus)等。不同于脊椎动物可以经由先天性免疫和适应性免疫协同抵御病原微生物,而无脊椎动物只能通过先天性免疫抵御病原入侵。本文研究了白斑综合征病毒和鳗弧菌感染对虾时的细胞和分子机制,为当前的对虾生产中的病害防治提供了新思路和新方法。1.多聚免疫球蛋白受体样分子是白斑综合征病毒侵染对虾的一种新受体多聚免疫球蛋白受体(The polymeric immunoglobulin receptor,pIgR)是多聚免疫球蛋白(Polxymeric immunoglobulin,pIg)的特异性受体,是免疫球蛋白超家族(Immunoglobulin superfamily,IgSF)的一员。pIgR是I型跨膜糖蛋白,在上皮细胞的基底膜表面表达,可与多聚免疫球蛋白IgA或IgM结合,在上皮细胞中发挥转运功能。研究还发现pIgR可被病原微生物挟持进行自身的转运,从而感染宿主。在本研究中,我们首次在日本囊对虾M japonicus中克隆得到一种多聚免疫球蛋白受体样分子(Polymeric iimiunoglobulin receptor-like protein)的cDNA,命名为AMjpIgR。MjpIgR在血细胞和其他多种组织中均有分布,并在WSSV入侵时,其mRNA水平和蛋白质水平发生明显上调表达。敲低MjpIgR基因的表达和抗体封闭能显着抑制病毒对宿主的入侵,对虾的成活率也显着提高;同时,过表达MjpIgR能促进了病毒的感染。为了确定MjpIgR是否是真正的WSSV的受体,我们首先进行了体外结合实验,发现MjpIgR胞外域可以与病毒的结构蛋白VP24相互作用:又进行了非纳受细胞感染实验,结果发现转染MjpIgR表达质粒并成功表达的MjpIgR的非纳受细胞HEK293T可以感染WSSV病毒。上述这些结果表明MjpIgR被WSSV利用,是该病毒感染对虾的一种新的受体。随着病毒入侵时间的延长,MjpIgR可以发生寡聚化,并随着WSSV的入侵逐步内化。荧光免疫细胞化学实验显示血细胞中的MjpIgR与WSSV病毒粒子可以共定位。流式细胞实验也显示,MjpIgR敲低后发生WSSV内吞的细胞数目显着下降。有报道称钙调蛋白(CaM)可以与网格蛋白相互作用,进一步结合实验发现MjpIgR的胞内域可以与钙调蛋白相互作用。氯丙嗪(CPZ)是一种网格蛋白(Clathrin)依赖的内吞的抑制剂,我们的研究发现这种抑制剂可以使AMjpIgR促进病毒内吞的过程受到明显抑制,因此MjpIgR导致的病毒内吞是网格蛋白依赖的内吞。进一步敲低网格蛋白及其适配蛋白AP-2基因表达的实验都证明可以抑制WSSV的内吞。这些实验说明MjpIgR与CaM结合导致的WSSV的内吞是网格蛋白依赖的。因此,我们的研究表明MjpIgR是WSSV入侵宿主的一种新的受体,WSSV侵染对虾细胞是通过pIgR-CaM-Clathrin途径进行的。这是首次在无脊椎动物中发现多聚免疫球蛋白受体样分子可以作为WSSV入侵对虾的膜蛋白受体。另外根据敲降MjpIgR表达后的对虾成活率实验结果,我们认为MpIgR并不是WSSV入侵宿主的唯一受体。因此WSSV可以利用多种受体侵染宿主细胞。这与病毒可以侵染多种宿主和多种组织的特性是一致的。2.MjKIAA0319L蛋白抑制病毒的复制阅读障碍症相关蛋白KIAA0319是目前被发现的可能引起阅读障碍症的候选蛋白分子。该蛋白是一种含有PKD结构域(也称为Ig结构域)的粘附分子。KIAA0319是一种跨膜蛋白,它含有信号肽、半胱氨酸结合区、PKD结构域和跨膜区。研究发现KIAA0319可以与适配蛋白AP-2结合,介导网格蛋白依赖的内吞途径。在本研究中,我们在对虾体内鉴定到了一种KIAA0319L蛋白(The dyslexia-associated protein KIAA03 19L,MjKIAA0319L),发现它可以响应WSSV的刺激,为了进一步研究MjKIAA0319L蛋白在对虾中的功能,我们进行了 RNA干扰实验,发现RNA干扰后,病毒的复制量上升并切对虾存活率降低,冈此MjKIAA0319L蛋白在对虾中可以抑制WSSV病毒的复制。jKIAA0319L存在WSSV入侵时发生内吞,并且胞内域可以与适配蛋白AP2μ相互作用。但MjKIAA03 19L抑制病毒复制的机制仍需要后续的研究。3.STAT激活抑制蛋白(PIAS)负调控对虾JAK/STAT信号通路的机理研究STAT激活抑制蛋白(Protein Inhibitor of Activated STAT,PIAS)是一类信号转导因子和转录激活激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)的抑制蛋白,参与遗传因子转录调控。PIAS蛋白在酪氨酸激酶(Janus Kinase,JAK)/STAT信号通路中的抑制机制在哺乳类动物和果蝇中有广泛的研究,但是其在甲壳类动物中的调控机制并不清楚。我们在日本囊对虾中鉴定到一种PIAS蛋白,并且发现PIAS蛋白可以被弧菌诱导表达。为了进一步探究我们发现的这种PIAS蛋白在弧菌感染日本囊对虾时发挥的功能,我们做了 RNA干扰实验。当PIAS在对虾中的表达被敲低后再感染鳗弧菌,此时对虾的弧菌清除能力增强并且存活率上升。同时,抗菌肽(ALF-C1,ALF-C2,ALF-Al和Crul-1)的表达水平上升。进一步的研究发现,PIAS敲低后,增强了 STAT的磷酸化和核易位。相互作用实验表明,PIAS蛋白和激活的STAT蛋白相互作用。我们的研究发现PIAS通过抑制STAT的磷酸化和入核负调控JAK/STAT信号通路,从而导致对虾中抗菌肽的表达下降。我们的结果揭示了 PIAS在JAK/STAT信号转导中的一种新的基因调控机制。(本文来源于《山东大学》期刊2019-05-28）
李涛,陈岺曦,孙梁博,闫小晶,连继勤[4]（2019）在《叁结构域蛋白21通过下调自噬相关蛋白4B抑制肝细胞癌细胞增殖的实验研究》一文中研究指出目的探讨叁结构域蛋白21(tripartite motif 21,TRIM21)抑制肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞增殖的可能机制。方法采用TCGA数据库的样本数据分析TRIM21在HCC组织中的表达水平;Western blot检测HCC细胞系中TRIM21表达情况,在HepG2细胞中过表达TRIM21,并在SMMC7721细胞中敲低TRIM21;CCK-8和细胞克隆形成实验分别检测过表达和敲低TRIM21对HepG2和SMMC7721细胞增殖的影响;流式细胞术检测细胞凋亡的情况;Western blot检测TRIM21对自噬相关蛋白4B(autophagy related 4B,ATG4B)水平的影响;分别在HepG2细胞中下调ATG4B表达和在SMMC7721细胞中过表达ATG4B,CCK-8检测细胞增殖变化,流式细胞术检测细胞周期变化。结果 TRIM21在HCC组织中的表达水平较正常肝组织显着下调(n=49,P<0.05);在HepG2细胞中过表达TRIM21能显着降低细胞存活率(P<0.01)、抑制细胞增殖(P<0.01),在SMMC7721细胞中下调TRIM21的表达能显着增加细胞存活率(P<0.05)、促进细胞增殖(P<0.05)。过表达或敲低TRIM21对HCC细胞凋亡影响不明显;TRIM21在HCC细胞中可以抑制ATG4B的表达;而在HCC细胞中过表达或下调ATG4B也可以发挥促进或抑制细胞增殖的效果(P<0.05),ATG4B影响HCC细胞增殖的机制主要是改变细胞周期进程。结论 TRIM21在HCC中可通过下调ATG4B而抑制细胞增殖。(本文来源于《第叁军医大学学报》期刊2019年09期）
杨笃晓[5]（2018）在《Slingshot N端结构域自抑制机制及其被F-actin激活机制的研究》一文中研究指出丝切蛋白磷酸酶Slingshot属于I型酪氨酸磷酸酶家族(Protein Tyrosine Phophotase,PTP)中的双特异性磷酸酶(Dual-specificity phosphatase,DUSP)家族,双特异性磷酸酶家族不同与经典型的蛋白酪氨酸磷酸酶家族,它们既能够去磷酸化酪氨酸(pY),又能够去磷酸化丝/苏氨酸(pS/T)。目前被报道已知的Slingshot特异性底物是磷酸化的丝切蛋白(p-Cofilin);Slingshot可以通过调节底物Cofilin的去磷酸化来影响肌动蛋白(F-actin)的聚合与解离,从而参与细胞骨架动力学;另一方面,F-actin会与Slingshot磷酸酶上的某些特定氨基酸或是结构域相结合,从而极大提高Slingshot磷酸酶的活力。最近的研究发现,在一些癌症,阿尔兹海默病及某些血管性疾病中都检测到了 Slingshot磷酸酶的活性异常升高;尽管Slingshot2(SSH2)催化结构域晶体结构在2006时年就被解析出,但目前关于SSH2磷酸酶更为全面深入的底物催化机制及如何被F-actin激活的相关机制并没有详细的说明。一、研究目的:1.Slingshot磷酸酶动力学催化机制研究;2.Slingshot底物选择性机制的研究;3.F-actin激活Slingshot机制研究;4.如何通过我们自己建立的方法高效筛选Slingshot的小分子抑制剂或激动剂;二、研究方法:主要研究方法简述如下:1.通过PCR方法构建一系列Slingshot截短质粒,利用大肠杆菌BL21感受态细胞体外表达Slingshot截短蛋白,用于后期酶活检测;2.选用结构不同的小分子底物及生理底物或是磷酸化短肽检测Slingshot对底物的选择性机制;3.绘制pH依赖性曲线,检测Slingshot磷酸酶的酸碱催化机制;4.绘制底物解离基团依赖性曲线,检测Slingshot对产物小分子解离基团的依赖性大小;5.利用肌肉丙酮粉制备F-actin,以pNPP和p-Cofilin作为底物检测F-actin激活Slingshot机制;6.绘制底物解离基团依赖性曲线,进一步明确F-actin激活Slingshot机制;7.体外Trypsin酶切实验验证F-actin激活Slingshot属于变构激活调节;8.在Slingshot蛋白N端特定位点引入半胱氨酸突变和小分子荧光底物mBBr标记方法,通过连续荧光光谱扫描检测F-actin激活Slingshot分子机制;9.FlAsH-BRET实验用来检测验MCF-7细胞给予NRG刺激时,细胞内Slingshot激活机制;10.利用FlAsH-BRET方法,拓展Slingshot酶活检测探针,可以用来检测不同生理条件下的Slingshot酶活或是筛选小分子抑制剂、激动剂;叁、结果:1.SSH2 N端结构域具有自抑制作用通过对已构建好的一些列SSH2不同长度截短蛋白的表达纯化,最后酶活检测发现随着SSH2 N端(1-305)的不断截短,SSH2酶活逐渐增强,相反,N端结构域的存在会抑制SSH2酶活,对生理底物p-Cofilin蛋白的活性检测,同样发现SSH2 N端对生理底物有抑制作用,细胞内检测SSH2全长蛋白和截去N端1-227的截短蛋白酶活相比,同样发现SSH2的N端对酶活有自抑制的作用。对pNPP(单环),DiFMUP(双环),OMFP(多环)小分子底物酶活检测发现,SSH2对于多环底物相对于单环底物选择性较好;SSH2 N端233-305结构域对于生理底物的识别起着关键作用,没有233-305区域,SSH2不能识别Cofilin无法去磷酸底物。2.SSH2 N端结构域自抑制属于非竞争抑制方式将SSH2 N端1-227结构域在体外表达纯化,与SSH2 233-490和SSH2305-490两个磷酸酶共孵育,检测加入1-227后的233-490和305-490对小分子底物pNPP酶活,发现随着1-227蛋白的浓度不断增加,233-490和305-490对pNPP的亲和力Km值并无变化,而Vmax降低,属于非竞争抑制方式;由于233-305对于生理底物cofilin的识别是必须的,所以检测1-227对SSH2 233-490的Ki抑制常数,同样发现SSH2 N端的抑制是非竞争的方式,即SSH2 N端并不与底物竞争性的结合SSH2活性中心,应该是作用于活性中心外的某些关键氨基酸或是结构域。3.SSH2磷酸酶催化机制属于酸碱催化,并且N端结构域限制了通用酸对产物小分子解离基团的稳定性绘制pH依赖性曲线检测到SSH2 1-490,233-490,305-490的基本催化机理同大部分经典磷酸酶催化机理相似,都属于酸碱催化,通过通用酸和通用碱的作用调节催化;此外,pH profile中,当pH>6之后,1-490的pH曲线要明显比233-490和305-490 pH曲线浅,说明通用酸在1-490催化过程中的作用明显弱于在233-490和305-490中的作用,可能是N端结构域的存在限制了通用酸对小分子解离基团的稳定性作用。绘制Leaving group dependence曲线,发现SSH2 1-490的β1绝对值明显大于其它233-490和305-490两个蛋白,也就是说1-490在N端存在的情况下,通用酸对产物解离基团的稳定性弱于其它两个蛋白。4.F-actin通过解除N端自抑制激活SSH2酶活,增加产物解离基团稳定性将F-actin分别与 SSH2 1-490,SSH2 233-490,SSH2 305-490共孵育,检测SSH2不同截短对生理底物的酶活;结果发现加入F-actin后1-490酶活显着提高,而233-490和305-490酶活基本无变化,说明F-actin可以解除SSH2 N端1-233对酶活的抑制作用;换用pNPP小分子底物检测,同样发现加入F-actin后,1-490和1-455的酶活显着升高,而其它截短蛋白活性并无明显变化。为了验证F-actin的激活机制,我们检测加入F-actin后,SSH2对不同pKa值的小分子底物的解离基团依赖性,结果表明加入F-actin后,1-490的直线斜率变小,接近233-490的β1值,说明F-actin加入之后,通用酸开始发挥作用,底物解离基团稳定性增加,N端对通用酸的限制作用被解除,SSH2酶活升高。5.F-actin激活SSH2属于别构激活体外Trypsin酶切实验证实,加入F-actin后,SSH2 1-490酶切的蛋白片段大小与不加F-actin时蛋白酶切片段大小不同;1-490单独酶切时,酶切后片段大小在40kDa和28kDa,加入F-actin之后,酶切后片段变为44kDa。通过Adman N端降解测序法和SSH2 1-490 一级结构氨基酸序列分析,1-490单独存在时,酶切位点在R66,K291和K450;加入F-actin后,原本暴露在结构表面的K291被F-actin保护起来,免于Trypsin的酶切;而位于第2个a螺旋和第3个β折叠之间loop上的R332在没有F-actin时掩藏在里面,加入F-actin后暴露在结构表面,被Trypine识别并酶切。6.F-actin激活SSH2的分子机制在SSH2 N端特定位点(19,63,78,98,146,161)引入半胱氨酸突变,用小分子荧光底物mBBr标记上述突变的半胱氨酸,同时在此基础上将VYD-loop中的Tyr突变成Trp,通过荧光光谱连续扫面检测N端哪些氨基酸参与了SSH2的构象变化,及N端的哪个位置氨基酸与VYD-loop发生了相互作用。荧光淬灭实验证实了,当SSH2处于静息状态时,C19和C146距离VYD loop较远,而C63,C78,C98,C161 距离VYD-loop较近,当 F-actin激活 SSH2后,C63开始远离VYD-loop,C19则开始靠近VYD-loop。7.细胞内SSH2被F-actin激活的分子机制利用FlAsH-BRET实验验证我们在体外提出的F-actin激活SSH2的机制同样适用于生理条件下的激活机制,将真核表达载体SSH2全长质粒N端23位,63位插入rLuc(海肾荧光素酶),VYD-loop中插入6个氨基酸的特定位点序列CCPGCC,根据NRG刺激前后,BRET信号强度变化判断出L63在细胞刺激后远离VYD-loop,而23位氨基酸在细胞刺激后BRET信号强度增加,说明23位氨基酸在细胞受刺激后向VYD-loop靠近。8.将SSH2-63-FlAsH拓展成可以检测SSH2酶活的分子探针FlAsH-BRET实验中,通过计算我们发现△BRET值的大小与p-Cofilin去磷酸化程度之间成正相关性,即当△BRET值增大时,SSH2磷酸酶活力增加。根据之前的文献报道,当SSH2 N端21,25,32,36位的丝氨酸被GSK激酶磷酸化之后,SSH2的磷酸酶活力降低;我们在SSH2-63-FlAsH质粒的基础之上,将N端21,25,32,36分别突变成酸性氨基酸Asp和Glu,来模仿磷酸化状态,构建成了新的SSH2-DDEE-63-FlAsH质粒。将上述质粒在细胞中过表达之后,检测ABRET信号,发现ABRET信号强度减弱,突变后SSH2的磷酸酶活力降低,可能与N端氨基酸突变之后,无法使N端结构域从VYD loop解离有关。四、结论:1.SSH2 N端结构域具有酶活自抑制作用,这种抑制方式表现为非竞争抑制。2.SSH2催化机理属于酸碱催化,N端结构域作用于VYD-loop中的通用酸D361,限制其活性,降低通用酸对产物解离基团的稳定性。3.F-actin可以激活SSH2酶活,其激活机制是解除了N端结构域对通用酸D361的限制作用,提高产物解离基团的稳定性。4.F-actin激活SSH2的同时,SSH2构型发生变化,属于变构激活机制。5.荧光淬灭实验,连续荧光光谱检测发现了SSH2 N端参与酶活调节机制中的关键氨基酸分子,63C在SSH2静息时靠近VYD-loop,激活时远离VYD-loop;19C在SSH2静息状态时,远离VYD-loop,激活状态时靠近VYD-loop。6.体外证实的F-actin激活SSH2分子机制同时适用于生理状态下SSH2激活机制。7.拓展了新的FlAsH-BRET探针,用于筛选检测SSH2不同状况下的磷酸酶活力大小,及筛选SSH2小分子抑制剂/激动剂。五、意义:我们的研究发现了SSH2 N端结构域的自抑制作用并阐明了自抑制机制及F-actin激活SSH2的变构调节机制,对于理解Slingshot功能异常导致的各种临床疾病提供理论基础,对于今后相关疾病的预防治疗有重要意义。我们的研究结果不仅揭示了人类Slingshot磷酸酶的自抑制机制和变构激活机制,为将来研究Slingshot信号通路及生理过程提供重要理论基础,有重要意义外,还拓展了新的FlAsH-BRET探针,有助于检测不同生理病理状况下的Slingshot磷酸酶活力大小。(本文来源于《山东大学》期刊2018-11-11）
何欣[6]（2018）在《CD82胞外小环结构域氨基酸序列模拟多肽抑制肿瘤细胞体外迁移及体内转移作用及作用机理的研究》一文中研究指出肿瘤转移抑制因子(Metastasis suppressor)是由转移抑制基因(Metastasis suppresor gene,Msgs)编码的一类在肿瘤转移过程中发挥负调作用的蛋白质。其作用特点是抑制肿瘤细胞在体内的扩散转移,但不影响原发瘤的形成及生长。为区别与抑癌基因,故定义为肿瘤转移抑制基因。自从1988第一个肿瘤移抑制基因,NM 23基因被发现以来,已经发现了30多个肿瘤转移抑制基因。不同的转移抑制因子可在转移过程的不同环节阻断转移过程。一些转移抑制因子可促进细胞间的同源粘附,以阻断瘤细胞从原发瘤的脱落;一些转移抑制因子可抑制细胞外基质分子的降解及肿瘤细胞的迁移和侵袭。一些转移抑制因子调控肿瘤细胞在血液或继发部位的存活和生长,抑制转移瘤的形成。不同转移抑制因子之间的功能常互相交叉。一种转移抑制因子可在多个不同环节阻断肿瘤转移。转移抑制基因在转移的瘤细胞中常常表达下调或不表达。恢复其表达或功能可抑制肿瘤细胞在体外迁移运动和在体内的转移。因此,肿瘤转移抑制因子的相关研究是目前肿瘤转移领域的前沿课题,其研究热点正由对生物学功能及作用机制的研究,转向靶向转移抑制因子治疗策略的设计以及靶向或模拟转移抑制因子的抗转移新药的开发。恢复肿瘤转移抑制因子的功能,抑制肿瘤的侵袭和转移,将为临床控制肿瘤转移开辟一条新途径。过去的多年中,已有多种策略被用来恢复转移抑制基因的功能。这些策略可分为叁类:诱导内源性不表达基因重新表达、通过脂质体或病毒介导的基因治疗技术转染外源基因,直接应用肿瘤转移抑制基因编码的重组蛋白产物,以及靶向转移抑制基因的下游通路。然而,到目前为止,因各种原因,如技术上的限制、疗效欠佳,或对正常生理的干扰,靶向肿瘤转移抑制基因控制肿瘤转移的治疗策略在临床的应用尚处于起步阶段,仍面临众多挑战。在众多肿瘤转移抑制因子中,KAI 1(Kang Ai 1,抗癌1号)/CD82是研究最为详细的肿瘤转移抑制因子之一。KAI 1/CD82广泛表达于不同组织,在肿瘤组织中表达经常被下调或缺失。与其他大多数肿瘤转移抑制因子不同,KAI 1/CD 82可在多个环节阻断肿瘤的转移:KAI 1/CD82可促进肿瘤细胞的同型粘着,抑制瘤细胞从原发瘤脱离。KAI 1/CD82可抑制细胞外基质分子降解,抑制细胞-细胞外基质粘附;KAI1/CD82也可抑制细胞迁移运动、诱导肿瘤细胞衰老或休眠。KAI 1/CD82属于四跨膜蛋白家族成员,包含四个跨膜结构域、两个细胞外环(EC1和EC2)、一个胞内小环、和胞内N端和C端。目前,KAI 1/CD82各部分结构域所对应的功能基本弄清楚,但其胞外小环结构域(EC1)的功能研究欠缺,尚不清楚。既然EC1结构域在长期生物进化过程中一直存在于四跨膜蛋白家族的所有成员中,必定有其重要的功能。为验证这一假设,在前期研究中,我们合成了CD82-EC1结构的氨基酸序列模拟肽(CD82-EC1-m P),并发现CD82-EC1-m P可以抑制肿瘤细胞体外迁移运动。在本研究中,我们进一步研究了CD 82-EC1-m P对肿瘤细胞转移行为的影响,并对其影响机制做了初步探讨。同时观察了CD82-EC1-m P体内抗肿瘤转移作用。一、体外培养细胞,采用划痕法,transwell法,观察CD82-EC1-m P肿瘤细胞粘附、贴壁,的迁移及生长的影响。结果:1.CD82-EC1-m P促进肿瘤细胞的粘连聚集2.CD82-EC1-m P抑制肿瘤细胞的贴壁生长3.CD82-EC1-m P抑制肿瘤细胞的迁移结论:CD82-EC1-m P抑制肿瘤细胞体外迁移,可能是其转移抑制作用的主要机制之一。二、采用Western Bloting、细胞免疫荧光化学等技术,对CD82-EC1-m P抑制细胞迁移机制进行初步研究。结果:1.CD82-EC1-m P可抑制Vimentin的表达,促进Vimentin的磷酸化。促进磷酸化的Vimentin向细胞表面分布。2.CD82-EC1-m P促进E-Cadherin的表达。3.CD82-EC1-m P抑制β-Catenin在细胞核分布,促进β-Catenin在细胞膜分布。4.CD82-EC1-m P抑制GSK3β磷酸化,激活GSK3β,促进β-Catenin磷酸化结论:CD82-EC1-m P下调Wnt信号通路,抑制GSK3β磷酸化从而激活GSK3β,GSK3β使β-Catenin磷酸化降解,减少β-Catenin由胞质进入细胞核,从而抑制Vimentin的表达。另外,CD82-EC1-m P促进β-Catenin向胞膜分布并加强与E-Cadherin复合体形成。叁、经尾静脉注射,建立纯系小鼠和裸鼠模型,观察CD82-EC1-m P对体内肿瘤转移的影响。结果:1.CD82-EC1-m P抑制小鼠肺癌LLC细胞在ICR小鼠形成肺转移。2.CD82-EC1-m P抑制人肺癌H1299细胞裸鼠体内肺转移。3.CD82-EC1-m P抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞裸鼠体内肺转移。4.CD82-EC1-m P抑制人结肠癌SW620细胞裸鼠体内肺转移。(本文来源于《大连医科大学》期刊2018-06-01）
王洋洋[7]（2018）在《UHRF2通过其RING结构域抑制p21的表达对DNA损伤修复的作用机制研究》一文中研究指出目的本文旨在研究E3连接酶UHRF2与p21之间的相互作用关系,探索UHRF2在修复HEK293细胞中由羟基脲(HU)引起的DNA损伤的机制。方法本文通过Western blotting检测过表达UHRF2对于p21表达量的调节作用;免疫荧光染色(IF)验证UHRF2与p21的亚细胞定位关系;免疫共沉淀(Co-IP)验证UHRF2与p21的相互结合关系以及探索其主要的结合结构域;半衰期(Half-life)实验检测UHRF2对p21半衰期的调节作用;体内泛素化实验检测UHRF2对p21的泛素化作用;Western blotting与免疫荧光染色相结合,探索UHRF2如何作用于p21来修复羟基脲引起的DNA损伤。结果Western blotting显示,在HEK293、Hela、LO2、HepG2细胞中过表达UHRF2后,HEK293、Hela细胞中p21的表达量明显降低,而LO2、HepG2细胞中p21的表达量未见有明显差异;IF与Co-IP证实,在HEK293、Hela细胞中,UHRF2与p21相互结合,且UHRF2的RING结构域为主要的结合结构域;Half-life实验证明,在HEK293细胞中,过表达UHRF2明显缩短p21的半衰期,而RING结构域的缺失则挽回p21半衰期的缩短;Western blotting显示,MG132的加入抑制了过表达UHRF2对于p21表达量的抑制作用;泛素化实验则进一步证明了过表达UHRF2促进p21的泛素化;IF证明过表达UHRF2促进DNA损伤修复;Western blotting证明,p21随着羟基脲处理时间的增加逐渐减少,而过表达UHRF2更进一步地抑制p21的表达,同时在羟基脲处理细胞24h后,促进DNA损伤修复;Western blotting进一步证明,过表达UHRF2促进DNA损伤修复的作用在敲低p21之后遭到明显削弱。结论UHRF2能够与p21相互结合,可以缩短p21的半衰期,通过泛素化作用抑制p21的表达。UHRF2可以促进DNA损伤修复,并且这一过程是通过负向调控p21的表达量来实现的。当然,其中的一些潜在作用机制有待进一步的研究。(本文来源于《重庆医科大学》期刊2018-05-01）
张海霞[8]（2018）在《抗人神经菌毛素1b结构域单克隆抗体的制备及其抑制血管生成作用初探》一文中研究指出神经菌毛素1(Neuropilin1,NRP1)作为一种跨膜糖蛋白在轴突导向,血管生成和肿瘤免疫等多种反应过程中发挥着重要的作用。研究发现,NRP1是血管内皮生长因子(VEGF)的非酪氨酸激酶受体,促进VEGF与其受体(VEGFR)的结合,对血管生成具有极大的促进作用,其中b1b2结构域是其与VEGF165的主要结合位点。研究发现,NRP1高表达于多种肿瘤细胞表面,尤其是上皮细胞肿瘤。阻断NRP1不仅能直接对肿瘤细胞的迁移及肿瘤的发生发展产生抑制作用,而且能够阻断其与VEGF165的结合,间接抑制肿瘤局部血管的生成与发展,继而影响肿瘤的生长发展。因此,NRP1有望成为抗肿瘤治疗的新突破点。本研究首先通过PCR技术得到人NRP1 b结构域(HuNRP1b)的编码序列,并将其克隆入原核表达载体,经表达、纯化后,获得重组HuNRP1b蛋白;将重组HuNRP1b蛋白免疫小鼠,制备出抗HuNRP1b单克隆抗体(McAb)。随后,采用体内、体外实验分析McAbs结合肿瘤细胞的能力及抑制血管生成的活性,为其后续的抗肿瘤研究提供基础。一.重组HuNRP1 b结构域蛋白的获得利用PCR方法得到HuNRP1b的编码基因,构建重组质粒pET30a-HuNRP1b,经双酶切和测序验证后将质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,构建重组表达菌BL21(pET30a-HuNRP1b)。经0.6 mM/L IPTG进行低温诱导,SDS-PAGE分析融合蛋白His-HuNRP1b的表达。经变性、复性、纯化等步骤制备可溶的重组蛋白。经SDS-PAGE分析,融合蛋白His-HuNRP1b成功获得表达、纯化,浓度约为3.0mg/ml。二.制备抗HuNRP1 b结构域单克隆抗体并分析其生物学特性选取8wkBalb/c鼠,将上述获得的纯化蛋白His-HuNRP1b进行小鼠腹部皮下免疫,100μg/只,免疫3次,间隔2wk。第一次免疫,将纯化His-HuNRP1b与等体积完全弗氏佐剂混合,充分乳化后在小鼠腹部皮下进行多点注射。再次免疫,佐剂更换为不完全弗氏佐剂,抗原、剂量、免疫途径均同上。1wk后,取小鼠眼眶下静脉丛血,检测其血清效价,取效价高者进行加强免疫。加强免疫时,采用尾静脉直接注射不加任何佐剂的His-HuNRP1b。3 d后取免疫鼠脾脏,制备单细胞悬液,与sp2/0-Ag-14骨髓瘤细胞融合,ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株。将阳性杂交瘤细胞株经过2-3次亚克隆后得到稳定的单克隆细胞株,小鼠腹腔注射法制备腹水McAbs。采用Western-Blot、间接免疫荧光法(IFA)、细胞免疫化学(ICC)、免疫组织化学法(IHC)研究McAbs的生物学特性。本研究共获得4株腹水McAbs,分别为1H4、2G7、3H4、8G9,它们的ELISA效价依次为 1:256 000、1:64 000、1:256 000、1:128 000,亚类分别为:IgG2b、IgG1、IgG2b、IgG2b。Western-Blot鉴定结果显示,McAbs(1H4、2G7、3H4、8G9)只与融合蛋白HuNRP1b结合而不与空载体表达菌结合,在36 kDa的位置出现特异性条带;且该McAbs可以与高表达天然HuNRP1的乳腺癌细胞株(MCF-7、BT474、SK-BR-3、MDA-MB-231)结合,在大小约120 kDa的位置有特异性条带。表明本研究所获得的McAbs不仅可以识别重组HuNRP1 b结构域蛋白而且可以识别全长的HuNRP1。IFA结果表明,McAbs(1H4、2G7、3H4、8G9)可以与人脐静脉内皮细胞(HUVEC),人乳腺癌细胞株(MDA-MB-231、MCF-7)及人白血病细胞株(k562)结合,观察到亮绿色荧光,表明所获得的McAbs均能够特异性识别天然的HuNRP1。ICC结果显示,McAbs(1H4、2G7、3H4、8G9)作用于HUVEC细胞及MDA-MB-231细胞时,在胞膜及胞浆内可见棕褐色信号,其中McAbs:2G7、3H4、8G9结合能力较强。4株McAbs采用IHC实验分析临床样本的结果表明,在9例乳腺癌样本中McAbs分析发现有6例呈HuNRP1阳性;7例肺癌样本中有3例呈阳性;3例食管癌及3例肾癌均呈阳性,这与商品化的抗用HuNRP1抗体检测结果一致。表明获得的McAbs可以特异性识别肿瘤细胞及肿瘤组织中的HuNRP1。叁.抗HuNRP1 b结构域单克隆抗体抑制血管生成活性的研究运用Transwell小室迁移实验,分析McAbs对HUVEC细胞的迁移的影响。在小室的下室加入10ng/ml VEGF165,上室分别加入终浓度为50 ng/孔的McAbs(1H4、2G7、3H4、8G9)阻止细胞向下迁移,每组设叁个复孔,同时设PBS组作为对照。实验结果显示,McAbs(1H4、2G7、8G9)相对于PBS组细胞迁移抑制率约为15%,3H4组未表现出抑制作用。运用Matrigel体外成管实验分析McAbs对HUVEC细胞体外成管的影响,细胞接种后,每孔加入10 ng/ml VEGF165刺激细胞成管,实验孔加入McAbs(1H4、2G7、8G9),50ng/孔,设PBS孔作对照,继续培养6h,镜下观察细胞成管情况,发现PBS组的HUVEC细胞可以形成明显管状结构,而McAbs组大部分细胞仍附于Matrigel表面生长,抑制率约为10%,体外实验表明McAbs(1H4、2G7、8G9)对于局部血管生成具有一定的抑制作用。利用鸡胚尿囊膜血管生成实验,进一步分析McAbs对新生血管发生发展的影响。以硅胶环作为载体在健康发育的鸡胚内血管生长相对不丰富位置分别放入McAbs(1H4、2G7、3H4、8G9),保持终浓度为100 ng/枚,同时设终浓度为100 μg/枚的地塞米松组作为阳性对照,设PBS100μL/枚作为阴性对照。结果显示,McAbs(1H4、8G9)组及地塞米松组鸡胚绒毛尿囊膜血管的生长受到了明显的抑制,但McAbs(2G7、3H4)组抑制效果较不明显。最后,采用SCID小鼠体内种植Matrigel小体实验研究McAb对动物体内血管的生成的抑制作用。将100μgMcAb1H4、5×106MCF-7细胞与500μ1Matrigel混匀,于SCID小鼠腹部皮下注射。6天后取出小鼠体内种植的Matrigel小体,观察小体内血管的发育情况,并对其进行包埋、制成切片,通过苏木素-伊红(HE)染色及IHC方法进一步分析Matrigel小体内血管的发育。HE染色和IHC实验发现McAb 1H4可以干扰Matrigel小体内MCF-7细胞对小体内血管生成的吸引作用。综上所述,本研究成功制备出4株抗HuNRP1bMcAb,且具有识别天然HuNRP1的能力。其中,McAbs 1H4、2G7、8G9具有一定的体外抑制HUVEC迁移及成管能力,其中McAb 1H4具有体内抑制肿瘤血管生成的能力。该特异性McAb的获得为研究靶向抑制肿瘤部位血管生成及肿瘤的发生、发展提供了生物材料。(本文来源于《扬州大学》期刊2018-04-05）
梁姗姗[9]（2018）在《SCSMV-P1蛋白抑制RNA沉默的关键结构域及氨基酸定位》一文中研究指出RNA 沉默(RNA silencing)和 RNA 沉默抑制子(RNA silencing suppressor,RSS)是寄主和病毒之间长期进化过程中形成的防御和反防御的相互拮抗机制。甘蔗条纹花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus,SCSMV)和小麦花叶病毒(Triticum mosaic virus,TriMV)都是属于马铃薯Y病毒科Potyviridae禾本科病毒属Poacevirus的成员,均通过编码P1来抑制RNA沉默介导的宿主防御,但是其抑制RNA沉默的机制至今仍然不清楚。本研究首先利用农杆菌浸润本氏烟的瞬时表达实验验证P1蛋白是强RNA沉默抑制子,明显提高了外源基因GFP表达活性。同时,还发现HC-Pro与P1共表达会大大降低P1的沉默抑制子活性。利用酵母双杂交Y2H和双分子荧光互补BiFC实验发现,P1与HC-Pro之间没有发生直接互作,表明HC-Pro可能通过间接方式来影响P1的沉默抑制活性。此外,P1与甘蔗和拟南芥泛素化途径中的关键蛋白质SKP1不存在直接相互作用。通过对P1蛋白的理化性质、蛋白质结构、保守结构域和位点以及选择压力等生物信息学预测分析,克隆构建了 11个缺失突变体和4个点突变子,其中这11个缺失突变体包括7个分段缺失突变体、2个保守结构域缺失突变体和N末端、C末端缺失突变体;4个点突变子包括2个保守位点和3个正向选择位点。利用GFP介导的农杆菌浸润本氏烟的瞬时表达实验表明,C末端15个氨基酸P1(△343-358)的缺失、2个保守氨基酸基序P1(△65-79),P1(△108-122)是P1发挥沉默抑制子活性的关键结构域。此外,正选择位点H263也是P1发挥沉默抑制子功能的关键氨基酸位点。本研究结果为进一步解析P1蛋白抑制RNA沉默的作用分子机制奠定了基础,也为探索SCSMV与寄主甘蔗互作研究提供了参考。(本文来源于《福建农林大学》期刊2018-04-01）
戴华,戴长松,张海霞,沈颖[10]（2018）在《人神经菌毛素1 b结构域单克隆抗体的制备及其抑制血管生成作用》一文中研究指出目的:制备抗人神经菌毛素1(human neuropilin 1,Hu NRP1)b结构域单克隆抗体(monoclonal antibodies,m Ab),为靶向抑制肿瘤血管生成提供生物材料。方法:运用杂交瘤技术,将Hu NRP 1 b结构域重组蛋白(TF-Hu NRP1b)免疫BALB/c鼠,共免疫3次,取免疫鼠的脾脏细胞与sp2/0细胞进行融合,采用间接免疫荧光法(immunofluorescent assay,IFA)筛选稳定分泌抗Hu NRP1bm A,以Western blot、IFA、流式细胞术分析m Ab的特异性。以MTT法及小室迁移实验分析m Ab抑制血管生成的能力。结果:获得1株稳定分泌抗Hu NRP1bm Ab的细胞株4F11。Western blot结果表明,本研究所获得的m Ab 4F11只与重组Hu NRP1b发生反应,与对照蛋白不发生反应;IFA及流式细胞分析结果表明,所获得的m Ab能够识别肿瘤细胞MDA-MB-231、Hep G2以及人脐静脉内皮细胞表达的天然Hu NRP1蛋白;MTT法及小室迁移实验表明,所获得的m Ab 4F11具有抑制人脐静脉内皮细胞增殖、迁移的能力。结论:成功制备出抗Hu NRP1b的m Ab,该m Ab的获得将为进一步研究Hu NRP1的功能及靶向抑制肿瘤血管生成提供生物材料。(本文来源于《南京医科大学学报(自然科学版)》期刊2018年03期）
抑制结构域论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的通过原核基因工程技术获得登革2型病毒(DENV2)包膜蛋白第Ⅲ结构域(EDⅢ)重组蛋白,检测其抑制登革病毒感染细胞的效率。方法利用聚合酶链反应技术扩增DENV2编码EDⅢ重组蛋白的基因片段,构建pET28b(+)-EDⅢ原核表达载体并在大肠埃希菌中诱导EDⅢ重组蛋白表达,进行质谱鉴定。将登革病毒感染VeroE6细胞(经EDⅢ重组蛋白孵育),根据空斑减少数量计算EDⅢ重组蛋白对登革病毒感染的抑制率。结果成功表达并纯化EDⅢ重组蛋白。EDⅢ重组蛋白可以抑制登革病毒感染的VeroE6细胞,且抑制率与蛋白水平呈正相关,当蛋白水平为100μg/mL时,病毒抑制率为90.5%。结论 DENV2EDⅢ重组蛋白能够抑制DENV2吸附和感染细胞,为以EDⅢ重组蛋白为靶标研制药物和疫苗提供重要的实验基础。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
抑制结构域论文参考文献
[1].刘继东,杨燕,刘莹.慢病毒靶向溴样结构域蛋白4通过抑制SHH通路对非小细胞肺癌细胞A549能量代谢水平的影响[J].内科急危重症杂志.2019
[2].潘冠和,杨笑涵,廖雁玲,杨昭群,刘耀洪.重组登革病毒包膜蛋白第Ⅲ结构域抑制登革病毒感染的研究[J].检验医学与临床.2019
[3].牛国娟.两种含Ig结构域蛋白以及STAT激活抑制蛋白在日本囊对虾先天免疫中的功能研究[D].山东大学.2019
[4].李涛,陈岺曦,孙梁博,闫小晶,连继勤.叁结构域蛋白21通过下调自噬相关蛋白4B抑制肝细胞癌细胞增殖的实验研究[J].第叁军医大学学报.2019
[5].杨笃晓.SlingshotN端结构域自抑制机制及其被F-actin激活机制的研究[D].山东大学.2018
[6].何欣.CD82胞外小环结构域氨基酸序列模拟多肽抑制肿瘤细胞体外迁移及体内转移作用及作用机理的研究[D].大连医科大学.2018
[7].王洋洋.UHRF2通过其RING结构域抑制p21的表达对DNA损伤修复的作用机制研究[D].重庆医科大学.2018
[8].张海霞.抗人神经菌毛素1b结构域单克隆抗体的制备及其抑制血管生成作用初探[D].扬州大学.2018
[9].梁姗姗.SCSMV-P1蛋白抑制RNA沉默的关键结构域及氨基酸定位[D].福建农林大学.2018
[10].戴华,戴长松,张海霞,沈颖.人神经菌毛素1b结构域单克隆抗体的制备及其抑制血管生成作用[J].南京医科大学学报(自然科学版).2018
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