贵州鸡源H9N2亚型禽流感病毒对鸡、鸭和小鼠致病性研究

论文摘要

低致病性禽流感在禽类之间普遍存在,其病毒已在多种哺乳动物上分离到。为研究低致病性禽流感在不同畜种间跨畜种传播感染情况,了解低致病性禽流感的致病机制,为禽流感的防治以及公共卫生安全提供参考和理论依据,故本实验用鸡、鸭和小鼠三种动物来研究低致病性禽流感跨畜种感染动物的情况,了解不同动物的致病特点及致病机理。方法:实验选用52d黑羽乌骨鸡24只,52d樱桃谷鸭24只,6-8周昆明系小白鼠24只,随机分成四组,按0d、3d、6d、9d作分组标记,每组鸡、鸭和小鼠6只,感染前0d组为阴性对照,感染后3d、6d、9d为阳性对照。0d阴性对照注射0.2mLPBS,3d、6d和9d阳性对照注射107.0EID50/0.2mL H9N2 AIV（鸡鸭翅下静脉,小鼠尾静脉）。按0d、3d、6d、9d采集脏器组织和血液样品作为后续实验的材料。具体实验如下:（1）用血凝实验来测三种动物的血凝效价,观察临床和解剖病理症状,测肺系数,用三类细胞分析仪检测三种动物的血液生理指标及用免疫球蛋白G（IgG）ELISA试剂盒检测其IgG抗体水平;（2）将肺脏、气管等组织制作成切片,通过苏木素-伊红（HE）染色,并观察其病理变化情况;（3）用实时荧光定量PCR检测三种动物肺组织中的病毒含量;（4）将肺脏、气管等组织制作成切片,通过甲苯胺蓝（TB）染色,观察三种动物感染以后的肥大细胞（MC）的情况;（5）用ELISA试剂盒检测三种动物血液中的肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素2（IL-2）、组胺的含量（HIS）;（6）用实时荧光定量PCR方法检测肺组织中钙调蛋白（CaM）mRNA的转录情况,并用ELISA试剂盒检测三种动物肺组织中CaM的含量。结果:（1）感染后血凝效价均≥24,对照组均<24;感染动物荧光RT-PCR检测均有扩增曲线,空白对照没有扩增曲线;（2）鸡的白细胞在9d时显著下降（P<0.05）,鸭的在3d时极显著升高（P<0.01）,小鼠的白细胞在6d和9d时极显著升高（P<0.01）;鸡的红细胞在9d时显著降低（P<0.05）,鸭在3d和6d时极显著升高（P<0.01）,9d时显著升高（P<0.05）,小鼠在3d时显著升高（P<0.05）,6d和9d时极显著升高（P<0.01）;鸡血小板在6d时显著升高（P<0.05）,鸭在3d和6d时极显著升高（P<0.01）;感染后,鸡、鸭和小鼠IgG水平显著升高;（3）感染病毒后,鸡出现精神浓郁,食欲减退,胸腺和肺脏肿大,胸腔有积液,肺泡腔有明显的红细胞,肺组织大量的中性粒细胞,气管腔内可见有红细胞及渗出物;鸭有胸腔积液,肺肿大,肺组织有出血和大量的中性粒细胞;小鼠出现精神沉郁,食欲减退,肺肿和脾肿大,肺组织有红细胞。从病理评分上看,鸡、鸭和小鼠感染后3d和6d时病理评分值极显著升高（P<0.01）,6d时病理评分值最高,9d时与6d比,鸭和小鼠的病理评分值显著下降(（P<0.05）,鸡在6d时病理评分值极显著高于鸭（P<0.01）,而显著高于小鼠（P<0.05）;（4）感染后,鸡鸭在肺、气管、肠、法氏囊和胸腺组织中的MC数量极显著升高（P<0.01）,在脾组织中的MC数量显著升高（P<0.05）;（5）感染后三种动物肺组织的含毒在3d时含毒量最高,含毒量鸡>鸭>小鼠;（6）感染后,鸡、鸭和小鼠外周血中的IL-2、TNF-α、HIS均显著升高（（P<0.05））;（7）感染后,三种动物肺组织中的CaM转录水平显著升高（P<0.05）,但CaM蛋白的表达量极显著降低（P<0.01）。结论:1.证实低致病性禽流感可跨种畜传播,鸡易感,鸭次之,小鼠最不易感;2.低致病性禽流感可造成动物肺组织为主的病理损伤,鸡的病理损伤最严重,小鼠的最轻;3.低致病性禽流感感染后可引起炎性反应,并可诱导炎性因子释放,导致病理损伤;4.低致病性禽流感可上调CaM mRNA在肺组织中的转录水平,但抑制CaM蛋白在肺组织中的表达。

论文目录

摘要

Abstract

英文缩略

文献综述

1 禽流感病毒生物学特性概述

2 H9N2禽流感跨宿主感染概况

3 禽流感对机体免疫的影响

4 钙调蛋白

5 研究的目的与意义

前言

试验研究

1 材料

1.1 实验动物与病毒

1.2 实验试剂及材料

1.3 主要仪器

2 方法

2.1 实验动物分组与攻毒

2.2 攻毒检测

2.3 血液指标的测定

2.4 IgG的测定

2.5 病理观察

2.5.1 临床与解剖症状观察

2.5.2 组织病理观察

2.6 病毒检测

2.6.1 引物设计

2.6.2 病毒RNA的提取及鉴定

2.6.3 RT-PCR产物的纯化

2.6.4 RT-PCR产物的连接

2.6.5 RT-PCR的转化

2.6.6 重组质粒的提取

2.6.7 重组质粒PCR鉴定及浓度测定

2.6.8 荧光标准曲线的建立

2.6.9 鸡、鸭和小鼠病毒含量的检测

2.7 MC的观察

2.7.1 组织固定

2.7.2 组织脱水与包埋

2.7.3 切片制作

2.7.4 脱蜡与复水

2.7.5 染色

2.7.6 脱水与封片观察

2.7.7 MC计数

2.7.8 MC脱颗率的计算

2.8 IL-2、TNF-α和 HIS的检测

2.9 CaM的测定

2.9.1 引物的合成

2.9.2 RNA提取及c DNA合成

2.9.3 CaM基因的RT-PCR扩增

2.9.4 RT-PCR产物的纯化与连接

2.9.5 RT-PCR产物转化与重组质粒的提取

2.9.6 重组质粒PCR鉴定与测序

2.9.7 CaM转录水平的检测

2.9.8 CaM含量的测定

2.10 数据统计

3 结果

3.1 HA攻毒检测结果

3.2 血液生理指标结果

3.2.1 白细胞结果

3.2.2 中性粒细胞结果

3.2.3 淋巴细胞结果

3.2.4 红细胞结果

3.2.5 血小板结果

3.2.6 血液指标变化幅度

3.3 IgG结果

3.4 病理变化

3.4.1 临床病理观察

3.4.2 肺脏系数

3.4.3 组织切片观察

3.5 病毒含量检测

3.5.1 HA基因的克隆与质粒的鉴定

3.5.2 标准曲线的建立

3.5.3 敏感性与重复性实验

3.5.4 病毒在肺组织的复制情况

3.6 MC的观察

3.6.1 鸡MC的观察

3.6.2 鸭MC的观察

3.6.3 小鼠MC的观察

3.7 IL-2、TNF-α和 HIS的结果

3.7.1 IL-2 结果

3.7.2 TNF-α结果

3.7.3 HIS结果

3.7.4 IL-2、TNF-α和 HIS变化幅度

3.8 CaM的结果

3.8.1 鸡CaM及内参的扩增结果

3.8.2 鸭CaM以内参的扩增结果

3.8.3 小鼠CaM以内参的扩增结果

3.8.4 CaM的转录结果

3.8.5 CaM的含量结果

4 讨论

4.1 低致病H9N2 亚型禽流感可感跨种属感染动物

4.2 低致病流感对血液指标的影响

4.2.1 低致病性禽流感引起鸭和小鼠白细胞显著升高

4.2.2 低致病性禽流感引起鸡、鸭和小鼠中性粒细胞数量显著升高

4.2.3 低致病性禽流感引起鸡淋巴细胞数降低,鸭和小鼠的显著升高

4.2.4 感染低致病性禽流感鸡的红细胞降低,鸭和小鼠的显著升高

4.2.5 低致病性禽流感引起鸡和鸭的血小板总数量显著升高

4.3 低致病性禽流感引起鸡、鸭和小鼠Ig G显著升高

4.4 低致病性禽流感鸡、鸭和小鼠明显的病理损伤

4.5 低致病性禽流感病毒在鸡肺中的含毒量最高

4.6 低致病性禽流感引起鸡、鸭MC数明显升高

4.7 低致病性禽流感引起鸡、鸭和小鼠的IL-2、TNF-α和 HIS显著升高

4.7.1 低致病性禽流感引起鸡、鸭和小鼠IL-2 浓度的显著升高

4.7.2 低致病性禽流感引起鸡、鸭和小鼠TNF-α的显著升高

4.7.3 低致病性禽流感引起鸡、鸭和小鼠HIS的显著升高

4.8 低致病性禽流感显著上调CaM mRNA的转录,但抑制CaM蛋白的表达

5 结论

参考文献

附录

附图

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 马卫红

导师: 欧德渊

关键词: 小鼠,致病性

来源: 贵州大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 贵州大学

基金: 贵州省科技计划项目:烟田空茬期生态养鸡关键技术研究与示范(黔科合支撑[2017]2534号)

分类号: S852.65

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贵州鸡源H9N2亚型禽流感病毒对鸡、鸭和小鼠致病性研究

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