陈祎招[1]2003年在《脑胶质瘤细胞对血脑屏障的作用及其分子机制》文中研究指明血脑屏障是中枢神经系统赖以进行各项生理活动的基础。作为中枢神经系统发病率最高的肿瘤，胶质瘤细胞可以在其发生、发展过程中对血脑屏障产生多种作用进而导致多种神经系统症状及并发症的产生。然而，胶质瘤细胞通过哪些分子机制影响血脑屏障结构与功能的变化?目前还不十分清楚。为了探索胶质瘤细胞对血脑屏障的多种作用及其分子机制，本研究通过建立体外血脑屏障模型，探索了胶质瘤细胞对血脑屏障的多种作用及其可能的分子生物学与病理生理学机制。 方法： 1．采用胶质细胞与内皮细胞系ECV304共培养的叁维细胞培养技术建立体外血脑屏障模型；2．运用Beckman全自动生化分析系统分析胶质细胞对内皮细胞系血脑屏障特征酶γ-谷氨酰转肽酶与碱性磷酸酶活性的影响；3．运用内皮细胞紧密连接银染的方法探索胶质细胞对内皮细胞系紧密连接的诱导作用及胶质瘤细胞对血脑屏障内皮细胞紧密连接的影响；4．采用Millipore-ERS系统检测内皮细胞紧密连接的功能状态；5．采用半定量RT-PCR的方法探索胶质瘤细胞及皮质激素治疗对血脑屏障内皮细胞紧密连接蛋白Z0-1、caveolin-1、caveolin-2表达的影响；6．通过WESTERN BLOT检测胶质瘤细胞及皮质激素治疗对血脑屏障内皮细胞紧密连接蛋白occludin的影响；7．采用重水与高效液相系统来检测水的跨血脑屏障转运变化；8．运用RT-PCR技术分析胶质瘤细胞及皮质激素治疗对血脑屏障内皮细胞水通道1及胶质细胞水通道4表达的影响及其病理生理意义；9．采用高效液相色谱系统检测胶质瘤细胞作用后血脑屏障模型基底面细胞外液谷氨酸的浓度变化；10．使用 研究生，陈一招导师，价么祥教救RT一PCR技术分析胶质瘤细胞及皮质激素对血脑屏障内皮细胞及胶质细胞兴奋性氨基酸转运体3表达的影响及其可能病理生理意义。 结果:1.星形胶质细胞可以诱导内皮细胞系形成紧密连接并产生较高的跨内皮阻抗(TER)，于第10d可达321.3 Ocm，;同时，在体外血脑屏障模型中ECV304可与胶质细胞建立终足联系并具有较多线粒体及较少吞饮泡含量等与生理条件下血脑屏障相似的超微特点。在细胞生化特性方面，体外血脑屏障模型具有较高的血脑屏障特征酶Y一GT与ALP活性，可分别达480.24士104.17U/mg蛋白，589.13士 54.35U/mg蛋白。2.胶质瘤细胞作用7天后，血脑屏障模型TER值明显降低，达213.7士56.2 Q cmZ;予以0.1 p mof/L地塞米松治疗后，血脑屏障模型TER值恢复为275.3土48.1 Ocm，。3.血脑屏障内皮细胞间紧密连接银染显示，胶质瘤细胞作用后，血脑屏障内皮细胞间紧密连接中断、不完整，局部区域偶可见残存紧密连接;当予以胶质瘤细胞作用组血脑屏障模型0.1“moFL地塞米松治疗5d后，内皮细胞间紧密连接数量明显增加，但仍存在局部区域的中断、不完整。4.RT一PCR结果显示，胶质瘤细胞可以明显降低血脑屏障内皮细胞20一l、eaveolin一l、eaveolin一2的表达水平，予以地塞米松治疗后血脑屏障内皮细胞20一1表达水平升高。5.Western blot结果显示，胶质瘤细胞可以明显降低血脑屏障内皮细胞。ccludin的表达，地塞米松治疗可以缓解这一过程。6.胶质瘤细胞作用后，体外血脑屏障模型对水由内皮细胞腔面至基底面的扩散明显增强。7.胶质瘤细胞可以诱导血脑屏障内皮细胞水通道1的异常表达并降低胶质细胞水通道4的表达水平。8.地塞米松治疗可以改善胶质瘤细胞作用后胶质细胞的水通道4表达水平并抑制内皮细胞水通道1的异常表达进而减少胶质瘤细胞作用后水由血脑屏障内皮细胞腔面至基底面的扩散。9.正常血脑屏障组基底面细胞外液谷氨酸浓度为14.487士1 .755 —4— 第一军医大学侧枕，低博士学位论久“mol几:胶质瘤细胞作用组基底面细胞外液谷氨酸浓度为22.609土2.124 p mol几:地塞米松治疗组基底面细胞外液谷氨酸浓度为19.906士1.934 pm。讥。10.胶质瘤细胞明显降低了血脑屏障内皮细胞EAAT3的表达水平，地塞米松可以提高胶质瘤细胞作用后的血脑屏障内皮细胞EAAT3表达水平。 结论:1.在体外血脑屏障模型中，ECV304内皮细胞间可以形成大量的紧密连接从而具有内皮细胞及其紧密连接这一血脑屏障机能与结构的主要基础。同时，在超微结构与生化特性方面，体外血脑屏障模型也有着与生理条件下血脑屏障相似的特点。ECV304细胞与星形胶质细胞的体外共培养可以作为研究血脑屏障结构与功能的一种可靠而简便的体外实验方法。2.胶质瘤细胞可以在其发生、发展过程中通过与血脑屏障内皮细胞的相互作用降低内皮细胞紧密连接蛋白occludin、20一1的表达进而破坏血脑屏障内皮细胞间紧密连接。这一过程可能是胶质瘤发生、发展过程中血脑屏障紧密连接破坏的重要分子机制。同时，胶质瘤细胞对血脑屏障内皮细胞紧密连接的破坏不是绝对的，局部区域仍可有残存的紧密连接。3.胶质瘤细胞可以降低血脑屏障内皮细胞c别coliol与caveolin一2的表达，这一过程不仅参与了血脑屏障紧密连接的破坏，还可能与occludin、 20一1的表?
卢建侃[2]2010年在《血脑屏障紧密连接在人脑胶质瘤中的变化及其分子机制》文中指出研究背景：血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)是中枢神经系统的重要结构,它对于维持中枢神经系统内环境的稳定具有极其重要的意义。BBB的存在,使中枢神经系统局部内环境成为区别于人体其他内环境的相对独立整体,从而保证中枢神经系统正常进行各项生理活动。目前认为,血脑屏障是由无窗孔的毛细血管内皮细胞及其间的紧密连接(tight junction, TJ)、星形胶质细胞足突、细胞基膜和周细胞共同组成的一个细胞复合体。在这个细胞复合体中主要的物质结构基础是毛细血管内皮细胞及其紧密相连,紧密连接结构相当稳定,主要起屏障和粘连作用,它与脑毛细血管内皮细胞组成血脑间物质交换的第一道屏障。在人体组织分布上,紧密连接各分子元件的表达有明显的组织特异性。这些表达不同的分子元件在人体内可以组装形成具有不同通透性功能的组织屏障进而适应不同组织器官的功能需要。在血脑屏障中,目前发现构成紧密连接的主要分子元件有：①跨膜蛋白claudin-5, claudin-1, occludin, JAM;②胞浆附属蛋白ZO-1, ZO-2, ZO-3,7H6与cingulin。而血脑屏障胞旁紧密连接通道功能(paracellular-tight junction channels, PTJC)、栅栏功能(fence function)等也被相继的发现。血脑屏障结构与功能的完整性对维持中枢神经系统的正常功能至关重要,同时,紧密连接结构与功能的变化也是多种神经系统疾病病理生理变化的核心过程。随着神经肿瘤学的发展,人们发现,胶质瘤细胞可以在其发生、发展过程中对血脑屏障产生多种作用进而导致多种神经系统症状及并发症的产生。胶质瘤细胞浸润、生长所导致的血脑屏障紧密连接的“破坏”是胶质瘤性脑水肿和癫痫等多种临床表现及并发症发生的主要原因之一脑胶质瘤是颅内发病率最高的原发性脑肿瘤,约占颅内肿瘤的40%左右。目前,即使采用手术、放疗、化疗等综合治疗,脑胶质瘤患者的平均五年生存率常不到30%。尽管近十年来,人们在脑胶质瘤的基础与临床研究方面都取得了很大的进步,但脑胶质瘤仍是致残率、致死率最高的恶性肿瘤之一。其中,作为胶质瘤最常见类型之一的胶质母细胞瘤(glioblastoma, GBM),其平均生存时间更在过去的叁十年间无明显改善。但是,胶质瘤细胞如何引起中枢神经系统的多种病理生理变化?其分子机制如何?这是当前胶质瘤研究中的一个薄弱环节。除此之外,研究者们还发现,位于胶质瘤瘤周和瘤体内的血管内皮细胞及其间的紧密连接可以演变成一种特殊的“血瘤屏障”(blood-tumor barrier, BTB)。这一“屏障”的存在也是目前严重制约脑胶质瘤临床疗效的重要原因之一。长期以来,有关血脑屏障紧密连接在胶质瘤发生发展过程中的具体结构和功能变化及其机制一直不是十分清楚。对于血脑屏障紧密连接在脑胶质瘤中的形态学改变,许多文献叙述却不尽相同。而在胶质瘤对血脑屏障紧密连接的影响方面,不同的学者也取得了“开放”与“完整”的不同研究结果。为了研究胶质瘤细胞对血脑屏障的形态学改变,本研究通过分析21例人脑胶质瘤标本来探索胶质瘤细胞对血脑屏障的超微结构的影响；同时,随着现代分子生物学与实验技术的进步,如何从分子水平上阐明胶质瘤细胞对血脑屏障紧密连接的作用及其分子机制与病理生理意义已成为神经肿瘤学研究的当务之急。研究表明,在构成紧密连接的多种分子元件中,Claudins目前被认为是形成紧密连接超微结构、决定紧密连接屏障特性和离子通透特性的主要元件。Claudins是紧密连接复合体的主要跨膜蛋白,而Claudin-5是脑微血管内皮细胞间紧密连接中的主要黏附分子。目前研究表明,在构成紧密连接的多种分子元件中,Claudin-5是构成内皮细胞紧密连接的骨架蛋白,它参与维持紧密连接特有的栅栏功能和屏障功能,被认为是形成紧密连接超微结构、决定紧密连接屏障特性和离子通透性的主要元件,是紧密连接形成的必要条件。在很多神经系统疾病中,表达下降的Claudin-5已经被证明与血管通透性增加有着密切的关系。在小脑成血管母细胞瘤中,脑微血管内皮细胞Claudin-5表达的下降是其形成瘤囊的重要原因之一。为了研究脑胶质瘤血脑屏障紧密连接主要分子元件的表达变化,从分子水平上阐明胶质瘤细胞对血脑屏障紧密连接的影响及其可能的分子机制与病理生理意义,本研究利用免疫荧光双标及RT-PCR技术,探索了胶质瘤细胞对血脑屏障紧密连接分子元件Claudin-5的影响及其可能的分子机制。目的：1.研究脑胶质瘤血脑屏障内皮细胞间紧密连接超微结构的变化,为脑胶质瘤中血脑屏障的形态学改变提供理论基础。2.阐明血脑屏障内皮细胞间紧密连接结构的变化在胶质瘤发生、发展过程中的病理生理意义。3.研究脑胶质瘤血脑屏障紧密连接主要分子元件的表达变化,从分子水平上探索胶质瘤细胞对血脑屏障内皮细胞间紧密连接结构的变化及其可能的分子机制。方法：1.统计21例脑胶质瘤病例的一般情况,收集上述病例手术后切除的脑胶质瘤组织标本,并收集6例癫痫颞叶切除的颞极远隔部位标本作为正常脑组织对照组；把27例标本分为叁组：正常脑组织组、低级别胶质瘤组与高级别胶质瘤组。2.采用透射电镜观察脑胶质瘤组织及正常脑组织血脑屏障内皮细胞间紧密连接的超微结构特征；3.运用免疫荧光双标染色观察脑胶质瘤组织及正常脑组织血脑屏障内皮细胞间紧密连接蛋白Claudin-5的表达；4.采用半定量RT-PCR的方法探索胶质瘤细胞对血脑屏障内皮细胞紧密连接蛋白分子元件Claudin-5表达的影响。5.统计学分析：采用SPSS13.0统计软件包分析。数据均以x±s表示,不同级别胶质瘤及正常组Claudin-5 mRNA条带OD比值比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用Bonferroni法,以P≤0.05为差异有显着性意义。结果：1.在透射电镜下,正常脑组织微血管相邻内皮细胞间可见连续条带状的紧密连接,细胞间未见裂隙；在低级别胶质瘤中,多数微血管内皮细胞间可见连续的紧密连接,未见明显窗口形成；在高级别胶质瘤中,微血管内皮细胞间紧密连接破坏严重,内皮细胞间可见明显裂隙,在局部还可见残存的紧密连接,部分内皮细胞间连接为缝隙连接,内皮细胞上偶见窗口形成,胞浆中吞饮小泡明显增多,尤以多形性胶质母细胞瘤为着,内皮基膜局部有虫蚀状空洞形成。2.免疫荧光双标染色观察在正常脑组织中,微血管内皮细胞上可见大量Claudin-5表达；在低级别胶质瘤中,微血管内皮细胞上Claudin-5的表达略降低；在高级别胶质瘤中,微血管内皮细胞上无明显Claudin-5的表达。3.PCR结果显示,正常脑组织、低级别胶质瘤、高级别胶质瘤Claudin-5 mRNA表达的相对强度分别为：0.633±0.068、0.519±0.172、0.227±0.148；经比较,高级别胶质瘤Claudin-5 mRNA与正常脑组织、低级别胶质瘤差别有统计学意义(F=17.283,P=0.000),但正常脑组织与低级别胶质瘤Claudin-5 mRNA的表达水平差别无统计学意义(P>0.05)结论：1.胶质瘤细胞在其发生、发展过程中通过与血脑屏障内皮细胞的相互作用破坏血脑屏障内皮细胞间紧密连接超微结构。2.在不同级别脑胶质瘤组织中,血脑屏障紧密连接受破坏的程度不同,脑胶质瘤的级别越高,血脑屏障紧密连接完整性受破坏的程度越大。3.在不同级别脑胶质瘤中,胶质瘤细胞能通过多种途径降低血脑屏障内皮细胞紧密连接蛋白Claudin-5的表达。胶质瘤级别越高血脑屏障内皮细胞间紧密连接蛋白Claudin-5的表达越低。血脑屏障内皮细胞间紧密连接蛋白Claudin-5这一分子元件的表达下降可能是血脑屏障内皮细胞间紧密连接结构受到破坏的重要原因。
王育胜[3]2009年在《脑胶质瘤动物模型中血脑屏障紧密连接的变化》文中认为背景:脑胶质瘤是颅内发病率最高的原发性脑肿瘤,约占颅内肿瘤的40%左右。目前,即使采用手术、放疗、化疗等综合治疗,脑胶质瘤患者的平均五年生存率常不到30%。尽管近十年来,人们在脑胶质瘤的基础与临床研究方面都取得了很大的进步,但脑胶质瘤仍是致残率、致死率最高的恶性肿瘤之一。其中,作为胶质瘤最常见类型之一的胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM),其平均生存时间更在过去的叁十年间无明显改善。从疾病的发生、发展过程来看,脑胶质瘤影响患者生活质量及导致患者死亡的原因主要来自两个方面:①肿瘤细胞本身的恶性增殖;②胶质瘤细胞作用于宿主并导致患者中枢神经系统多种病理生理变化及多种症状与并发症的产生。随着现代分子生物学的发展,人们在胶质瘤细胞恶性增殖分子机制方面取得了很大进展。但是,胶质瘤细胞如何引起中枢神经系统的多种病理生理变化?其分子机制如何?这是当前胶质瘤研究中的一个薄弱环节。众所周知,血脑屏障是维持中枢神经系统内环境稳定的结构基础,一般认为,血脑屏障基本结构包括:脑毛细血管内皮细胞及其间紧密连接,内皮基膜及星形胶质细胞终足形成的胶质膜。其中,脑毛细血管内皮细胞及其间的紧密连接是血脑屏障机能与结构的主要基础。近年来,随着紧密连接基础研究所鹊玫木薮蠼?人们对紧密连接的蛋白组成及其生理功能有了崭新的认识,目前认为,紧密连接由一组蛋白分子所构成的复合体。这些分子包括:①跨膜蛋白,主要由claudins,occludins,junction associated molecules(JAM)等蛋白家族构成;②胞浆附属蛋白,主要由zonula occludens(ZO)等蛋白家族构成。细胞膜上这些紧密连接分子元件彼此相互作用并与邻近细胞膜上紧密连接蛋白相聚合、促使胞膜局部“融合”进而形成冰冻蚀刻电镜下紧密连接所表现的复杂叁维网状超微结构。血脑屏障结构与功能的完整对维持神经系统的正常功能至关重要,同时,紧密连接结构与功能的变化也是多种神经系统疾病病理生理变化的核心过程。随着神经肿瘤学的发展,人们发现,胶质瘤细胞可以在其发生、发展过程中对血脑屏障产生多种作用进而导致多种神经系统症状及并发症的产生。关于脑胶质瘤中血脑屏障的形态学改变,许多文献叙述却不尽相同。而在胶质瘤对血脑屏障紧密连接的影响方面,不同的学者也取得了“开放”与“完整”的不同研究结果。为了研究胶质瘤细胞对血脑屏障的形态学改变,本研究通过建立脑胶质瘤动物模型,探索了胶质瘤细胞对血脑屏障的超微结构的影响;同时,随着现代分子生物学与实验技术的进步,如何从分子水平上阐明胶质瘤细胞对血脑屏障紧密连接的作用及其病理生理意义已成为神经肿瘤学研究的当务之急。为了研究脑胶质瘤血脑屏障紧密连接主要分子元件的表达变化,从分子水平上阐明胶质瘤细胞对血脑屏障紧密连接的影响以及其病理生理意义,本研究利用免疫组化及RT-PCR技术,探索了胶质瘤细胞对血脑屏障紧密连接分子元件claudins-5的作用及其可能的分子生物学与病理生理学机制。目的:1.建立接近人脑胶质瘤的血脑屏障体内模型,研究血脑屏障的生理及病理生理变化。2.研究脑胶质瘤血脑屏障紧密连接超微结构的变化,为脑胶质瘤中血脑屏障的形态学改变提供理论基础。3.研究脑胶质瘤血脑屏障紧密连接主要分子元件的表达变化,从分子水平上阐明胶质瘤细胞对血脑屏障紧密连接的影响以及其病理生理意义。方法:1.培养C6胶质瘤细胞,通过立体定向技术在Wister大鼠右侧尾状核建立脑胶质瘤动物模型;2.脑胶质瘤动物模型建立21天后,通过肉眼和运用MRI检查脑胶质瘤动物模型肿瘤的形成;3.采用透射电镜观察脑胶质瘤动物模型及正常Wister大鼠血脑屏障紧密连接的超微结构特征;4.运用免疫组织化学染色观察脑胶质瘤动物模型及正常Wister大鼠紧密连接蛋白claudin-5的表达;5.采用半定量RT-PCR的方法探索胶质瘤细胞对血脑屏障内皮细胞紧密连接蛋白分子元件claudin-5表达的影响。6.统计学分析:采用SPSS13.0统计软件包分析。数据均以x~-±s表示,不同部位及正常组claudin-5 mRNA条带OD值比较采用单向方差分析和多重比较,如果满足方差齐性采用Fisher方差分析及LSD法进行多重比较,若不满足方差齐性采用近似F检验Welch法方差分析及Tambanes's T2法进行多重比较,以P≤0.05为差异有显着性意义。结果:1.C6肿瘤细胞接种于Wister大鼠右侧尾状核21天后,肉眼及MRI可见脑胶质瘤动物模型右脑形成肿瘤,肿瘤占位效应明显,肿瘤周边有局部水肿。2.透射电镜下,正常Wister大鼠脑组织微血管相邻内皮细胞间可见连续条带状的紧密连接,细胞间未见裂隙;在脑胶质瘤肿瘤中心组织,仅有22.23%微血管相邻内皮细胞间可见条带状紧密连接,其余内皮细胞间可见明显裂隙,部分内皮细胞间连接为缝隙连接;在脑胶质瘤肿瘤边缘组织中,有57.15%微血管内皮细胞间存在紧密连接,其余内皮细胞间局部可见裂隙,部分内皮细胞间可见缝隙连接。在脑胶质瘤肿瘤远隔部位,有95.65%微血管相邻内皮细胞紧密连接未见破坏,细胞间紧密连接为连续条带状。距肿瘤中心越远,相邻微血管内皮细胞间紧密连接越完整。3.胶质瘤细胞作用21天后,免疫组织化学染色观察紧密连接蛋白claudin-5的表达,发现正常Wister大鼠脑组织微血管内皮细胞claudin-5呈强阳性表达,而肿瘤中心组织微血管内皮细胞claudin-5表达呈阴性;肿瘤边缘微血管内皮细胞claudin-5呈弱阳性表达。4.RT-PCR结果显示肿瘤边缘和肿瘤中心claudin-5表达明显减少,与正常脑组织相比,差异有统计学意义(P=0.000,P=0.000),肿瘤远隔部位claudin-5表达也减少,但差异无统计学意义(P=0.960)。结论:1.通过立体定向技术可以成功在Wister大鼠右侧尾状核建立C6脑胶质瘤动物模型,并且通过MRI可见肿瘤占位效应明显,局部形成水肿带。2.胶质瘤细胞在其发生、发展过程中可破坏血脑屏障内皮细胞间紧密连接超微结构。3.在C6脑胶质瘤动物模型不同位置的脑组织中,血脑屏障紧密连接受破坏的程度不同。4.胶质瘤细胞可以降低血脑屏障内皮细胞claudin-5的表达,这一过程可能参与了血脑屏障紧密连接的破坏。
吕清[4]2013年在《靶向于脑胶质瘤的脂质体给药系统的研究》文中认为脑胶质瘤是最常见的颅内肿瘤,约占脑肿瘤的半数左右,其生长特点为浸润性生长。目前临床治疗以手术切除为主,由于胶质瘤呈浸润性生长,没有明确边界,手术不易全切,因此需要结合术后的放、化疗进行全脑的综合治疗,因此化疗成了胶质瘤患者手术治疗后一种必不可少的辅助治疗手段。但是化疗药物难以被输送入脑以及入脑后对正常脑组织的毒副作用成为其提高疗效的重要障碍,面对脑胶质瘤的生长特点和目前不容乐观的治疗手段,亟待寻找新的策略来构建有效的给药系统治疗脑胶质瘤。本文第一章,首先研究了单一配体修饰的脂质体给药系统在静脉给药后的脑靶向特性。利用脑毛细血管内皮细胞和肿瘤细胞上高表达的转铁蛋白受体,采用转铁蛋白(transferrin, Tf)修饰脂质体后,可使其在体外实验中以完整的形式穿过血脑屏障(blood-brain barrier, BBB),同时提高了药物顺铂的BBB透过率,并增加了对肿瘤细胞的杀伤作用。在此基础上,本文第二章利用脑血管内皮细胞高表达的转铁蛋白(Tf)受体和肿瘤细胞上高表达的叶酸(Folate)受体,构建了双重修饰(Tf, Folate)的阿霉素脂质体。首先将叶酸(Folate)连接至二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000得到DSPE-PEG2000-F。采用薄膜分散和硫酸铵梯度法制备阿霉素脂质体,优化筛选确定主要磷脂为DSPC,水化介质120mM硫酸铵,药脂比1：15,载药时间60min,成功制备了高包封率和稳定性的双配体脂质体。其在脑毛细血管bEnd3细胞中摄取远大于普通脂质体(p<0.05),摄取过程受网格蛋白和小窝内陷介导的细胞内吞作用,并受转铁蛋白和叶酸的影响；同时其在BBB模型中的药物透过速率及其进一步透过BBB后对下层C6细胞的毒性,均显着高于其他脂质体组。转铁蛋白和叶酸共同修饰的阿霉素脂质体具有较好的体外脑胶质瘤靶向治疗作用。本文第叁章进一步研究了双配体修饰的阿霉素脂质体的体内靶向性,并对其进行胶质瘤的治疗学评价。采用纹状体注射C6细胞建立脑胶质瘤大鼠模型,组织和细胞水平验证结果表明模型构建成功。采用小动物活体成像技术和冰冻切片考察双配体制剂在荷瘤大鼠体内的分布,结果表明双配体制剂能够进入脑内并在肿瘤部位集。同时药效学实验发现较之其他对照组,双配体脂质体可以抑制C6脑胶质瘤体积的增长,提高荷瘤大鼠的生存时间。核磁共振成像实验(MRI),苏木精-伊红(H&E)染色实验和TUNEL一步凋亡法进一步表明双配体脂质体具有较好的体内外抗肿瘤作用。同时,P-gp免疫组化实验显示双配体修饰的脂质体给药组肿瘤细胞上的P-糖蛋白表达明显小于阿霉素脂质体和阿霉素脂质体。以上结果表明,双配体修饰的阿霉素脂质体在减少药物给药剂量、降低毒副作用的同时,能够显着提高药物对脑胶质瘤的治疗效果,并有望成为脑胶质瘤靶向治疗的良好载体。
赵彬[5]2016年在《二甲双胍调节脑胶质瘤周围脑水肿的机制研究》文中研究指明研究背景和目的:颅内肿瘤是神经科临床工作中非常常见的一类疾病。在所有的脑肿瘤中,原发性脑胶质瘤占到75-80%,是最常见的恶性脑肿瘤。脑胶质瘤导致的脑水肿可以造成脑组织的压迫损伤,引起颅内压增高,最终导致脑缺血、脑疝、和死亡等严重后果。早在20世纪60年代就开始有各种研究尝试运用药物减轻消除脑水肿,如糖皮质激素等,其作用机理及各种药物副作用也逐渐被临床认识到。因此,我们想找到一种对消除脑水肿作用更强,同时更加安全的药物,从而能降低脑胶质瘤患者病死率、致残率,并改善患者预后。脑水肿大致可分为四类,分别是血管源性脑水肿、细胞性脑水肿、渗透压性脑水肿和脑积水性脑水肿。由脑肿瘤直接导致的脑水肿类型主要涉及前两类。血管源性脑水肿的发生机制主要是肿瘤具有占位效应,对瘤周脑组织具有压迫作用,导致血脑屏障(Blood Brain Barrier,BBB)受损、破坏,毛细血管通透性增加,水分渗出增多,水分积存于血管周围及细胞间隙所致。同时由于蛋白类物质的渗漏,细胞外液渗透压升高,增加水分的渗出,从而加重脑水肿程度。脑肿瘤导致的细胞性脑水肿则是由于脑肿瘤压迫脑组织,导致脑组织缺血、缺氧,神经细胞膜功能障碍,线粒体叁磷酸腺苷(ATP)生成减少,神经细胞膜的钠-钾ATP酶、钙-镁ATP酶等活性降低,细胞内外的钠、钾、钙、镁离子交换障碍,出现细胞内高钠,细胞间隙液高钾的反常现象。同时出现细胞内钙超载,从而出现神经细胞肿胀,细胞内水肿。此两种类型的脑水肿常常共存并相互演变,形成恶性循环。在正常生理情况下,血管内皮细胞及之间的紧密连接是血脑屏障的重要组成部分。紧密连接分子,如紧密连接蛋白3,紧密连接蛋白5和紧密连接蛋白12,以及其它的跨膜蛋白,如occludin等在内皮细胞相互连接方面起到至关重要的作用。完整的血脑屏障可以阻止血管内的液体大量进入脑组织。而脑肿瘤发生后,由于肿瘤快速生长,压迫周围正常脑组织,造成局部缺血缺氧,导致肿瘤周围细胞性水肿的同时,也对周围完整的血脑屏障造成结构性破坏。有研究表明,脑胶质瘤可以通过释放大量的血管内皮生长因子(VEGF)造成血管内皮的紧密连接分子表达异常、出现缺陷,从而导致液体从血管内渗漏,形成脑水肿。此外,水通道蛋白AQP4在脑肿瘤导致的细胞性水肿的形成过程中扮演重要角色。生理情况下水通道蛋白AQP4在血管周围的星形胶质细胞足突密集表达。而在脑胶质瘤组织中,AQP4正常的表达定位不复存在,而是在细胞膜上广泛分散性表达。AQP4的表达上调可以增加神经胶质细胞的透水性,与脑水肿形成的程度高度相关。二甲双胍是一种临床常用的治疗2型糖尿病的降糖药物,药性稳定,副作用较少。大量研究证据表明,二甲双胍除具有降低血糖的作用以外,对血管壁的通透性也具有调节作用。此外,近年来的研究结果还发现二甲双胍在体外可以通过调控水通道蛋白AQP4的表达水平影响星形胶质细胞的透水性。因此,本课题的研究目标是分别通过体外培养内皮细胞和体内脑胶质瘤动物模型的两种方式,评估二甲双胍对脑胶质瘤周围水肿形成的影响,并进一步探讨其可能的机制。方法:为了研究二甲双胍对血管源性脑水肿的调节机制,本实验首先运用体外培养的b End3单层内皮细胞,建立了体外血脑屏障模型。通过测量b End3单层内皮细胞的电阻值,评价二甲双胍对缺氧以及VEGF孵育造成的内皮细胞通透性改变的作用。同时,通过免疫印迹法,观察紧密连接蛋白,如Occluding,Claudin-5,ZO-1和ZO-2在b End3细胞中的表达水平的变化。为了研究二甲双胍对细胞性脑水肿的调节机制,我们建立了星形胶质细胞的体外培养,并进一步观察二甲双胍对星形胶质细胞中的AMPK的激活,NF-κB和AQP4表达的调节作用。最后,通过建立脑胶质瘤水肿的体内动物模型,观察在大鼠体内二甲双胍对脑胶质瘤造成的血管通透性改变的作用,以及对脑胶质瘤周围组织中AQP4表达的影响,初步评价二甲双胍对脑胶质瘤导致的脑水肿的作用。结果:经测定,本实验中培养的b End3细胞模型的电阻值为(341±36)Ω.cm2,所以本实验中的细胞模型符合体外研究血脑屏障通透性的标准要求。通过缺氧以及VEGF孵育的方法,我们发现,二甲双胍可以减轻缺氧或者VEGF孵育造成的内皮细胞通透性增加。进一步的实验发现,缺氧或者VEGF孵育可以降低紧密连接蛋白,如Occluding,Claudin-5,ZO-1和ZO-2在b End3细胞模型中的表达水平。然而,0.5 m M的二甲双胍可以使其表达正常化。因此,我们的实验结果表明,二甲双胍可能通过增加紧密连接蛋白的表达水平,减轻由于缺氧或者VEGF的暴露造成的内皮细胞通透性的升高。脑胶质瘤在生长的过程中,能够分泌大量VEGF以及造成局部缺氧的环境,破坏血脑屏障,诱发血管源性脑水肿。因此,我们的实验结果预示,二甲双胍可以对抗脑胶质瘤生长造成的血管源性脑水肿。然而,脑胶质瘤生长还可能造成细胞性脑水肿,我们的实验进一步阐明了二甲双胍的药理作用还包括对星形胶质细胞的AQP4蛋白表达的调节作用。该调节作用可能是通过激活AMPK,从而抑制NF-κB的活性,来降低VEGF诱导的AQP4的表达上调。由于AQP4的表达量与细胞性脑水肿的形成呈正性相关,因此我们的实验结果预示,二甲双胍可能减轻脑胶质瘤造成的细胞性脑水肿。最后,我们建立了脑胶质瘤水肿的体内动物模型,发现在大鼠体内二甲双胍可以降低C6脑胶质瘤造成的血管通透性增加,下调胶质瘤周围组织中的AQP4的表达,从而降低脑组织中的液体量,抑制或减轻脑水肿的发生。结论:本课题通过体外细胞模型实验和在体动物模型实验发现验证了二甲双胍可以同时减轻血管源性脑水肿和细胞性脑水肿。这预示着二甲双胍可以对抗脑胶质瘤瘤周水肿的形成。对临床上治疗脑胶质瘤可能具有积极的意义。
乔文芳[6]2008年在《细胞因子IL-1β和IL-18在缓激肽与罂粟碱伍用开放血肿瘤屏障中的表达》文中认为前言脑胶质瘤是神经系统肿瘤中发病率和死亡率最高的肿瘤,占颅内肿瘤的40%左右,但其病因并不十分清楚。在胶质瘤的化疗方面给予血肿瘤屏障(blood-tumorbarrier,BTB)开放剂后给药能够有效地提高化疗疗效。BK(Bradykinin,BK)能够非选择性地增加血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)的通透性。其机制可能是:BK与B2受体特异性结合,导致细胞内Ca~(2+)增多,促使细胞内NO及cGMP浓度增加,使肿瘤毛细血管内皮细胞内转运小泡增多,或使血管内皮细胞间的紧密连接(tightjunction,TJ)开放,进而增加血脑屏障的通透性。最近发现,颈内动脉注射罂粟碱(papaverine,PA),可以通过抑制血管平滑肌收缩而缓解血管痉挛,同时可能会导致血脑屏障通透性的破坏。其分子机制可能是通过抑制平滑肌细胞中cAMP或cGMP磷酸二脂酶的活性而使得细胞间cAMP或cGMP浓度升高。一些炎性物质可以引起动脉平滑肌紧张程度的降低从而引起血管舒张以及静脉压的升高或血管内流体静压的升高。这些都可以引起血管内皮细胞间的紧密连接的开放。有研究发现,IL-1β能够引起动物可逆性的血脑屏障损伤。IL-1β引起的血脑屏障通透性的增高是由中性粒细胞介导的,中性粒细胞的缺失会导致此效应的丧失。所以血脑屏障通透性的增高可能与内源性的IL-1β的产生有关。IL-1β促进组织内cGMP的浓集,而cGMP又可以促进Ca~(2+)的释放。IL-18是白介素1家族的成员,在体外,IL-18刺激星形胶质细胞中IL-1β的产生,也可以通过TNF-α引起血单核细胞产生IL-1β和IL-8。一种假说认为IL-18在调节IL-1β方面发挥作用,并且能够直接影响IL-1β在脑部的作用。本研究首先建立大鼠脑胶质瘤模型,颈内动脉给予BK和罂粟碱,通过电镜观察血肿瘤屏障紧密连接的开放程度以及吞饮小泡的数量变化,明确BK和罂粟碱伍用对血肿瘤屏障的开放的影响;同时测定肿瘤组织内IL-1β和IL-18的含量及其与血肿瘤屏障开放程度的关系,为证实IL-1β和IL-18参与开放血脑屏障的机制提供理论上的依据,并为治疗脑胶质瘤提供理论依据和治疗学上的新靶点。材料和方法一、实验材料1、实验动物本研究采用中国医科大学实验动物中心提供的Wistar大鼠160只,均为雌性,体重在180～200g。2、实验细胞株本研究采用大鼠C6胶质瘤细胞株由中国医科大学细胞生物学实验室提供。3、主要试剂兔抗大鼠IL-1β抗体,兔抗大鼠IL-18抗体均购于武汉博士德试剂公司;缓激肽购于美国Sigma Chemical公司;盐酸罂粟碱购于沈阳第一制药厂;辣根过氧化物酶结合羊抗兔免疫球蛋白和SABC法免疫组化试剂盒均购于武汉博士德试剂公司;β-actin,辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二次抗体,FITC标记的山羊抗兔二次抗体均购于北京中山公司;伊文思蓝购于日本Fluka公司;常规电镜制备所需试剂由本校电镜室提供。4、主要仪器二氧化碳培养箱;超净工作台;大鼠脑立体定向仪;PurfusorCompact S型微量输液泵;电热恒温干燥箱;电子分析天平;恒温水浴箱;低温冷冻离心机;紫外分光光度计;通用电泳仪;转印仪;正置荧光显微镜;-80度深低温冰箱;恒温冰冻切片机,液氮罐;Motic Images Advanced3.2图象分析系统;透射电镜。二、实验方法1、建立大鼠C6胶质瘤模型。2、动物处理及分组经大鼠胶质瘤侧颈动脉灌注小剂量缓激肽及/或罂粟碱,应用western blot法测定不同动物处理组(正常组,假手术组,PA组,BK组,PA+BK组,1/2PA+BK组,PA+1/2BK组,1/2PA+1/2BK组)肿瘤部位IL-1β及IL-18蛋白表达水平的变化。3、通过伊文思蓝试验测定血肿瘤屏障通透性。4、电镜观察血肿瘤屏障超微结构的变化。5、应用Western blot法及免疫组织化学SABC法测定各不同给药组肿瘤组织IL-1β、IL-18蛋白的分布和表达。6、图象分析Western blot结果用Chemi Imager5500V2.03软件扫描,用FluorChen2.0软件定量分析显色带的IDV值。免疫组化结果用Motic Images Advanced 3.2实时图象分析系统采集照片并进行定量分析。7、统计学处理所有数值均以均数±标准差表示,实验数据采用SPSS10.0统计软件进行单因素方差分析,P＜0.05为差异有统计学意义。实验结果一、血肿瘤屏障通透性的变化通过伊文思蓝试验发现,PA组,BK组,以及PA+BK组肿瘤部位组织蓝染,而空白组及假手术组未见蓝染。与空白组(0.244541±0.042274μg/g)及假手术组(0.345083±0.04982μg/g)的EB含量相比,其他各组脑组织中EB含量均升高,其中PA+BK组最高,为0.960309±0.071750μg/g(P＜0.05),其次为1/2PA+BK组(0.732120±0.067341μg/g,P＜0.05),BK组(0.663774±0.036010μg/g P＜0.05),PA组(0.603132±0.34442μg/g,P＜0.05)。二、电镜观察血肿瘤屏障超微结构的变化电镜观察发现空白组及假手术组血肿瘤屏障都没有开放,单独给与罂粟碱(PA)及缓激肽组(BK)血脑屏障部分开放,罂粟碱与缓激肽(PA+BK)伍用组血脑屏障明显开放,1/2PA+BK组及PA+1/2BK组血脑屏障部分开放,1/2PA+1/2BK组血脑屏障未见开放。叁、Western Blot法测定给药后肿瘤组织IL-1β和IL-18蛋白的表达测定结果均采用各组IDV值与其内对照β-actinIDV值的比值,空白组及假手术组只表达少量的IL-1β;给药后脑肿瘤表达IL-1β均增加,其中PA组脑肿瘤组织表达的IL-1β值为0.98570±0.04475(n=8,p＜0.05);BK组脑肿瘤组织表达的IL-1β值为1.16340±0.08745(n=8,p＜0.05);PA+BK组脑肿瘤部位表达的IL-1β最多,值为1.54100±0.08417(n=8,p＜0.05);1/2PA+BK组及PA+1/2BK组肿瘤表达的IL-1β减少,与PA及BK组相比无统计学意义,1/2PA+1/2BK组肿瘤表达的IL-1β较少。各组大鼠脑中IL-18的表达趋势和IL-1β相似,空白组及假手术组只表达少量的IL-18;给药后脑肿瘤表达IL-18增多,PA组为0.97839±0.07478(n=8,p＜0.05);BK组为0.99791±0.06956(n=8,p＜0.05);PA+BK组脑肿瘤部位表达的IL-18最多,值为1.61476±0.08623(n=8,p＜0.05);1/2PA+BK组肿瘤部位表达的IL-18值为1.19166±0.07203(n=8,p＜0.05);PA+1/2BK组及1/2PA+1/2BK组肿瘤部位表达的IL-18较少,只与空白组相比有统计学意义。四、免疫组化法测定肿瘤微血管上IL-1β和IL-18蛋白的表达空白组和假手术组也基本没有阳性表达,给PA后,肿瘤微血管上略有IL-1β表达,其IDV值为0.02580±0.00442(n=6,p＜0.05);BK组的IDV值为0.02660±0.00423(n=6,p＜0.05);PA+BK组肿瘤微血管上IL-1β表达最高,IDV值为0.03980±0.00425(n=6,p＜0.05);1/2PA+BK组及PA+1/2BK组IL-1β表达少,与PA/BK组相比无统计学意义;1/2PA+1/2BK组肿瘤微血管基本没有IL-1β阳性表达。IL-18的表达趋势与IL-1β相似,正常组和未给药组基本没有阳性表达,PA组的IDV值为0.01960±0.00344(n=6,p＜0.05);BK组的IDV值为0.02660±0.00216(n=6,p＜0.05);PA+BK组肿瘤微血管上IL-18表达最高,IDV值为0.03600±0.00249(n=6,p＜0.05);1/2PA+BK组及PA+1/2BK组IL-18表达较少,只与PA组相比有统计学意义;1/2PA+1/2BK组肿瘤微血管IL-18表达很少。讨论本实验利用大鼠胶质瘤模型证明:罂粟碱与缓激肽伍用可以开放血脑屏障,其程度大于单用缓激肽或罂粟碱。细胞因子IL-1β及IL-18的表达量随着血脑屏障开放程度的增加而增加,表明它们在血脑屏障的开放机制中发挥作用。过去研究发现BK和罂粟碱都可以通过cGMP引起血脑屏障开放。BK激活后的下游信号物NO供体,cGMP,以及可溶性鸟苷酸环化酶激活剂可以独立地引起血肿瘤屏障的通透性增加。根据我们的研究结果发现罂粟碱单独使用或者与缓激肽伍用都可以增加血脑屏障的通透性。并且罂粟碱与缓激肽伍用对血肿瘤屏障的开放具有协同作用。目前的研究表明,NO依赖性的Ca~(2+)调节是IL-1β参与的多种信号级联反应中的一部分。NO/cGMP信号系统是细胞内IL-1β导致Ca~(2+)释放的机制中的一部分。脑实质中IL-1的持续性表达增高将会导致选择性的中性粒细胞的增多,而中性粒细胞的增多与血脑屏障的破坏和轴索的脱髓鞘有关。Hu和Fraser发现细胞因子IL-1β能够增强正常情况下血脑屏障对BK的反应。细胞因子IL-1β的表达量随着血脑屏障开放程度的增加而增加。IL-1β可能是BK与罂粟碱引起血脑屏障开放的下游靶点物质之一。但是IL-1β如何通过NO/cGMP信号系统引起血脑屏障开放,在此开放机制中IL-1β的具体作用还不太清楚。我们的实验结果表明,IL-18与IL-1β的变化是一致的,也与随着血脑屏障开放程度的增加而增加。但是具体的机制尚不清楚。综上所述,我们的研究结果提示缓激肽与罂粟碱伍用对血脑屏障开放有协同作用。罂粟碱单用也可以开放血脑屏障。细胞因子IL-1β和IL-18的表达随着血脑屏障开放程度的增加而增加。在临床治疗上可以考虑将缓激肽与罂粟碱伍用作为血肿瘤屏障开放剂,从而使得抗肿瘤药物能够更大程度地到达肿瘤部位,提高疗效。结论1、本研究首次证明,缓激肽与罂粟碱伍用增加了血肿瘤屏障的通透性。2、单独应用罂粟碱,增加了血肿瘤屏障的通透性。3、在缓激肽与罂粟碱伍用增加了血肿瘤屏障的通透性的过程中,细胞因子IL-1β和IL-18的表达显着增加。
徐越[7]2008年在《脑胶质瘤端粒酶反义寡核苷酸纳米微粒的制备及治疗研究》文中研究表明一、概述脑胶质瘤是最常见的颅内原发肿瘤,生长迅速,目前治疗大多为常规手术切除并加以放疗、化疗以及免疫治疗,但由于肿瘤细胞具有侵袭能力的特征,恶性肿瘤向周围“正常脑组织”浸润性生长,导致手术难以完全切除,术后复发率高,不能改善大多数病人的预后,一般存活时间少于诊断后18个月,因此探索有效治疗方法成为神经外科学的难题。随着肿瘤分子生物学的发展,研究已证实,端粒与端粒酶是细胞分裂和增殖的基础,端粒是真核细胞染色体末端由重复DNA序列和蛋白质组成的复合物,正常情况下随每一轮的细胞分裂而缩短,当端粒缩短到一个临界长度时,细胞停止分裂而衰老死亡。故端粒长度是决定细胞增殖能力和寿命的分子标志。端粒酶是一种由hTERT、hTR和hTPI组成的特殊逆转录酶,能以自身的hTR为模板,通过逆转录方式催化端粒重复序列(TTAGGG)复制防止端粒的缩短,维持细胞的增殖活性,阻滞因端粒缩短诱发的细胞衰老凋亡。端粒酶异常再活化是恶性胶质瘤细胞无限增殖和凋亡抑制的根本原因,因此作为目前已知的最广泛、特异性最高的肿瘤标记物,其活性与颅内恶性肿瘤发生、发展及预后密切相关,抑制端粒酶的活性就可有效的抑制恶性肿瘤的发生和发展。以端粒酶为靶点,应用端粒酶抑制剂协同常规方法治疗脑肿瘤已成为一种新策略。目前有多种方法可抑制端粒酶,其中以反义核酸技术尤为突出,成为当前肿瘤多基因治疗的研究热点,通过反义技术设计制备的反义寡核苷酸(antisenseoligodeoxynucleotides,ASODN)是一类经人工合成或构建的反义表达载体表达的寡核苷酸片段,其特有的核苷酸序列决定了它能与靶DNA或靶RNA的碱基互补,多途径封闭靶基因的表达。已有大量研究表明,ASODN在体外和瘤内的注药有明显的抑制脑胶质瘤细胞恶性增生,促其调亡作用,并能增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,对于治疗脑胶质瘤具有潜在的活力。但由于ASODN为多聚阴离子,而细胞膜上带一定的负电荷不易透过细胞膜、且在转运过程中还易被核酸内切酶迅速降解。因此需要一种载体来协助运载。纳米粒(nanoparticles NP)作为新型给药体系,一般指粒径在1～1000nm的粒子,是一类高分子物质材料,药物可以溶解、吸附或包裹于材料中,具有尺寸效应、表面效应、易吸收等生物优势。当前纳米技术在靶向给药和医用高分子材料研究领域的应用日益广泛,通过这种技术,国内外已有多种方法将ASODN吸附镶嵌在NP表面来增加其对肿瘤细胞的转染和稳定性,但体内给药后,效果并不理想。为此需要寻求一种有效纳米载药材料来包裹,协助运载保护ASODN。二、研究目的本研究优选可降解的高分子材料a-氰基丙烯酸正丁酯(butyleyanoacrylateBCA)为制备NP的载体,采用界面聚合法,ASODN为模药,通过优化工艺,包裹制备载药纳米粒(ASODN in NP),并制成冻干品后,考察其稳定性,将其转染C6脑胶质瘤细胞,观察其对细胞抑制的影响。叁、主要研究方法、内容和结论第一部分ASODN in NP制备工艺的优化:本实验以可降解的高分子材料B C A为制备NP的载体,ASODN为模药,采用界面聚合法,以NP的粒径和粒径分布为主要控制指标,通过相关文献和预实验确定单因素。根据单因素试验结果,优选ASODN浓度、pH值及Tween-80量3个主要因素,每个因素选择3个水平,按正交试验设计原理用正交设计表L_9(3~4)安排试验,以粒径、载药量、包封率为考察指标,优化NP的制备工艺,筛选处方,确定最优制备条件:ASODN浓度为5.0×10~(-6)mol/L、pH值为8.0及7wween-80用量为1.25g。。第二部分:ASODN in NP性质的研究、纯化及冻干工艺的考察。按照最优条件所制备3批NP混悬液为均匀半透明状分散系,体系略带乳光,包封率(EE)、载药量(DL)分别为96.67+1.45%,10.1±0。35%;取NP混悬液适当稀释后,用激光粒度分析仪测定叁批样本的平均粒径为94.9±6.2 nm,多分散度为0.05±0.012,说明粒径分布均匀,透射电镜下观察,见粒子形状规则,大小均匀,无粘连;对载药纳米制剂的纯化工艺进行了考察,试验结果表明:采用超速冷冻离心法,在4℃时以20000rpm的转速离心30min,洗涤离心叁次能达到很好的纯化效果;对ASODN in NP冻干工艺考察结果表明:以5%乳糖为冻干保护剂,冷冻干燥样品可以得到光滑圆整的ASODN in NP冻干品。第叁部分:ASODN in NP稳定性性研究。采用加速试验,在温度(40±2)℃,湿度(75±5)%的条件下考察了叁批ASODN in NP冻干品的稳定性,一共考察3个月,分别于0、1、2、3月取样。检测项目包括性状、鉴别、检查,具体考察项目为外观色泽、PH值、粒径、包封率、载药量、再分散性、再分散后的澄明度等。作为对照,在室温下考察ASODN in NP混悬溶液的稳定性叁个月,考察项目同上。结果:在加速试验考察期内,ASODN in NP冻干品的外观色泽变化不大,pH在规定范围内,粒径、包封率、载药量均无明显改变,再分散性良好,澄明度合乎要求。叁批ASODNin NP混悬液在室温稳定性试验考察期内,可见粒径逐渐增大,包封率和载药量逐渐减小,混悬液颜色逐渐变混变深,并有絮凝现象出现。说明随着时间的推移,ASODN in NP混悬液不稳定。说明将ASODN in NP混悬液冷冻干燥后,可大大提高其稳定性。按照最优制备工艺方法制备ASODN 1n NP,同时将传统的ASODN吸附在NP表面(ASODN-NP)和游离ASODN(FREE ASODN)作为对照。上述溶液与小牛血清混合,置于恒温水浴箱中37℃水浴;灭活血清酶后;加入4mmol/L的NaOH溶液适量。然后采用含7 M尿素的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行电泳分析,用EBS进行染色,将凝胶置于紫外光下,显影照相。实验结果:ASODNin NP样品有明显的亮条带,亮条带为游离的ASODN,FREE ASODN则没有亮条带,ASODN-NP样品,亮度不及ASODN in NP样品,说明FREE ASODN已完全降解,ASODN被包裹制备的NP能够有效的保护ASODN不被血清中的核酸酶降解,这种保护作用明显优于传统的通过离子相互作用将ASODN吸附在聚合物表面制备的NP。第四部分:ASODN in NP对C6胶质瘤细胞的抑制作用。本实验分5个组:A组.仅加入培养液的空白对照组;B组.未加ASODN的空白NP组(BCA-NP);C组.游离ASODN组(FREEASODN);D组.传统吸附制备的NP组(ASODN-NP);E组.本实验制备的包裹ASODND的NP组(ASODNinNP)。1.流式细胞术检测细胞周期:取对数生长期的C6细胞于24孔板中传代培养24h后,加入上述各实验组转染48h后,制成流式细胞检测样品后,上流式细胞仪进行细胞周期分析。流式细胞仪检测结果发现,转染后与对照组相比,除BCA-NP外,其他各组细胞周期均发生显着变化,其中ASODN in NP组差异非常显着(P<0.01),表现合成前期(Go/G1)期细胞比例显着增高,DNA合成期(S期)细胞比例减少;与传统的吸附法制备的NP相比,ASODN inNP组也表现出显着性差异(p<0.01),G2/M期细胞数目无显着变化,说明ASODN in NP可有效阻滞C6胶质瘤细胞于G1期向S期,抑制细胞增殖,促进了细胞凋亡。2.CCK-8试剂盒测定细胞相对生长率。取传代后处于对数生长期C6细胞,经胰酶消化,低速离心收集,在细胞计数板上记数,调整细胞密度至5×10~7/L,接种于96孔培养板,置含CO_2孵箱中培养,倒置显微镜下观察细胞生长情况;更换培养液,再培养24 h后,将实验各组不同浓度的稀释液(ASODN终浓度分别为5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0μmol)加入各孔细胞上开始转染,以未转染空白组做为对照。ASODN in NP组与ASODN-NP组加入与ASODN组等量的ASODN,空白对照组只加培养液。培养24h后向每孔加入CCK-8液10μl继续培养4 h,吸弃上层液体,在酶标仪上测定各样品组各孔的450 nm处的吸光度值(A值),按以下公式计算细胞相对生长率(RGR%)。RGR%=实验组A值/对照组A值×100%。对C6胶质瘤细胞的生长抑制实验结果表明,通过BCA包裹制备的ASODNin NP,在ASOND相对终浓度5-10μmol/L时,良好的C6细胞生长情况就开始受到抑制,增殖减慢,凋亡增多,其效应优于FREE ASODN和ASODN-NP组,在ASODN相对终浓度10-15μmol/L时表现出较强的抑制效应,且随浓度的增加增殖活力进一步降低,对C6细胞增殖率的剂量依赖性降低趋势显着优于其他各组,可使ASODN能更有效的发挥对胶质瘤细胞的抑制效应。
罗子淼[8]2018年在《智能靶向递药系统用于脑胶质瘤的治疗》文中指出脑部肿瘤的治疗因其病灶部位的特殊性以及复杂性至今仍是诸多肿瘤治疗中最为棘手且最具挑战性的课题之一,具有治疗难、预后差的特点。多形性神经胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)是脑内最常见且死亡率最高的一类原发性恶性肿瘤,其5年存活率不超过10%。手术切除是临床中脑胶质瘤治疗的首选方案,但浸润区的胶质瘤细胞很难被完全清除,而放疗又具有严重的副作用,因此,化疗作为脑胶质瘤最主要的辅助治疗手段其治疗效果尤为关键。在传统的系统化疗中,血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)作为药物的第一重障碍阻挡了绝大多数的静脉注射药物进入脑组织。而临床中用于脑胶质瘤治疗的替莫唑胺等一线化疗药物虽具有一定的入脑量,但其治疗效果也很大程度上受到脑内非特异性分布的局限。与此同时,脑胶质瘤内部的渗透与滞留增强(enhanced permeability and retention,EPR)效应相对较弱,以U87 MG胶质瘤为例,其瘤内新生血管平均孔径仅为7~100 nm。由此可见,由于脑胶质瘤生理、病理的复杂性,静脉注射药物最终达到胶质瘤部位的药物量远小于其他外周实体瘤。因此,在脑胶质瘤的治疗中除了对胶质瘤部位的充足递药这一关键性问题以外,药物在胶质瘤内的是否充分释放也极大地影响着脑胶质瘤的治疗效果。鉴于以上脑胶质瘤治疗的现状、局限以及胶质瘤不同发展阶段的生理病理特征,本论文中构建了两种纳米靶向递药系统,拟通过不同靶向策略最终达到提高脑胶质瘤治疗效果的目的。针对药物入脑后非特异性分布的缺陷,本文首先构建了一种核酸适配体AS1411修饰的聚谷酰基谷氨酸-紫杉醇共价键合物AS1411-PGG-PTX纳米靶向递药系统,以胶质瘤内部的EPR效应为基础,通过AS1411与人胶质瘤细胞U87MG表面的核仁蛋白(Nucleolin)特异性识别和内化从而增加药物在胶质瘤组织的分布。实验结果表明,AS1411的修饰显着增加了AS1411-PGG-PTX对U87 MG细胞的靶向作用,相比PGG-PTX,AS1411-PGG-PTX的U87 MG细胞体外摄取量与体内胶质瘤组织蓄积量分别提高了大约3倍和2.2倍。同时AS1411-PGGPTX也表现出明显提高的组织穿透能力,其叁维肿瘤球的渗透深度为PGG-PTX的2.4倍。此外,细胞实验中还发现AS1411-PGG-PTX对新生血管内皮细胞也具有一定的靶向作用。最终AS1411-PGG-PTX的靶向作用使其治疗组的荷瘤小鼠表现出显着优于PGG-PTX及Taxol组的体内脑胶质瘤抑制效果以及明显延长的中位生存期。而当脑胶质瘤内BBB尚未被破坏时,结合脑内药物释放不充分的现状,本文进一步地构建了一种由HIFU体外智能控释的Angiopep-2修饰的载阿霉素Dox/全氟辛烷PFOB的PLGA纳米靶向递药系统ANP-D/P,旨在通过Angiopep-2对BBB及U87 MG胶质瘤细胞的双级靶向作用,增加药物的入脑量并提高药物在胶质瘤内的蓄积,再通过HIFU辐照诱导药物在肿瘤部位瞬时充分释放,从而进一步提高脑胶质瘤的抑制效果。实验结果表明,Angiopep-2短肽的修饰使ANP-D/P在跨BBB速率以及脑胶质瘤内蓄积两方面分别提高了17倍和13.4倍。且在HIFU辐照的诱导下,ANP-D/P中Dox在2 min内的释放量可以达到47%。体外细胞凋亡实验中ANP-D/P HIFU+组有将近90%的细胞进入凋亡状态,而体内一个给药周期后ANP-D/P HIFU+组脑胶质瘤切片中也呈现出几乎消失的肿瘤细胞痕迹。最终,接受HIFU辐照的ANP-D/P HIFU+治疗组中的荷瘤小鼠也表现出显着长于单独使用化疗药物ANP-D/P、NP-D及Lip-D组的中位生存期。综上所述,本文结合脑胶质瘤临床化疗的局限以及胶质瘤本身的生理、病理特征构建了两种纳米靶向递药系统,通过不同的靶向策略逐步、有效地提高了脑胶质瘤内的药物浓度,进而达到了显着提高脑胶质瘤治疗效果的目的,同时也为临床脑胶质瘤的治疗提供了新的思路。
袁梦珍[9]2016年在《脉冲低剂量率放射治疗对斑马鱼原位脑胶质瘤模型治疗效果和放疗损伤的实验研究》文中研究说明目的：建立胚胎斑马鱼原位U87-MG细胞株脑胶质瘤模型,研究脉冲低剂量率放射治疗(PLDR)对该模型的治疗效果及放疗损伤效果,并探索肿瘤侵袭性生长及放疗对斑马鱼血脑屏障的影响。方法：通过显微镜下注射,将表达红色荧光蛋白的U87-RFP胶质瘤细胞注射在胚胎斑马鱼的脑组织中。24小时后,将成功接种脑胶质瘤的斑马鱼分为3组：对照组(n=25),常规放疗组(RT, n=25),脉冲低剂量率放疗组(PLDR, n=25). RT组和PLDR组全鱼接受6 Mv X-ray直线加速器放疗。RT组剂量为2Gy/次／天,连续治疗4天；PLDR组剂量为0.2G ry/次,共10次、间隔叁分钟1次、有效剂量率达到6.7 cGy/min给予,连续治疗4天。通过注射4',6-二脒基-2-苯基吲哚来观察血脑屏障的变化。使用共聚焦显微镜进行拍照,LeicaLAS-AF显微图像分析软件进行测量。所有数据采用SPSS16.0统计学软件进行数据分析。结果：成功建立胚胎斑马鱼原位U87R细胞株脑胶质瘤模型。经放疗后治疗组肿瘤明显缩小,PLDR组对肿瘤的抑制效果显着比RT组好,两组间差异具有显着性差异,P<0.05。对照组、RT组、PLDR组中位生存时间为8、10、11天。治疗组生存时间明显较对照组延长,差异具有统计学意X, P<0.05。PLDR组中位生存时间较RT组稍长,差异没有统计学意义,P>0.05。放疗后斑马鱼血管损伤率在RT组和PLDR组为32%和20%,差异具有统计学意义,P<0.05。尾部卷曲率(肌肉损伤)在RT组和PLDR组为24%和16%,差异具有统计学意义,P<0.05。并未观察到肿瘤侵袭生长及放疗后斑马鱼血脑屏障的破坏。结论：胚胎斑马鱼原位脑U87R细胞株胶质瘤模型成功的建立。通过实验发现在对肿瘤的局部控制上,PLDR组较RT组更有效。并且,PLDR组更能减少正常组织的放射损伤。因此,PLDR也许可以成为高级别脑胶质瘤放射治疗的一种新的有效分割方式。
全毅[10]2010年在《Angiopep-2靶头阿霉素（PEG-PE）纳米颗粒治疗大鼠脑胶质瘤动物模型的研究》文中认为目的：作为脑胶质瘤的重要辅助手段,化疗深受难以跨越血脑屏障的困扰,而近几年的热点靶向治疗可为此开辟一条道路。方法：本论文的第一部分和第二部分采用已成熟合成技术合成阿霉素包载(PEG-PE)纳米颗粒并通过投射电镜、粒径检测仪等手段检测颗粒大小及分布情况,结果显示纳米颗粒大小均匀饱满、无粘连,药物包封率在90%以上,与参考文献叙述基本一致。本论文第叁部分和第四部分构建稳定表达萤火虫荧光素酶pGL4.50的C6细胞株C6Luc,采用立体定向手术在Wistar大鼠右侧尾状核接种DAPI荧光标记的C6Luc细胞,于接种后0d、7d、14d、21d通过Xenogen活体动物体内成像系统观察肿瘤生长情况,次日起记录体重、神经学评分,处死后灌流取脑常规HE染色,GAFP、S-100免疫组化染色。同时进行裸鼠C6Luc成瘤实验,判定细胞体内生长的稳定性。结果显示肿瘤模型于接种后7 d出现明显体重及行为改变,病理切片可见肿瘤细胞沿神经纤维向周边侵袭,占位明显,肿瘤组织内见多处出血灶。免疫组化染色显示胶质纤维酸性蛋白GFAP及中神经纤维S-100蛋白强阳性表达,肿瘤细胞聚集,血脑屏障严重破坏,并沿侵袭组织向对侧生长。大部分死于30d内,1只出现自发消退现象。本论文第五章利用前面动物模型和剂型工作基础对经靶头基修饰的纳米颗粒进行动物体内实验。分别采取指标检检测及自然死亡率判断纳米颗粒对接种后动物模型肿瘤的杀伤作用,结果表明纳米颗粒具有很强的抑制肿瘤能力。结果：经Angiopep-2靶头基修饰的纳米颗粒PEG-PE具有很强的血脑屏障跨越能力,对脑胶质瘤的治疗具有一定促进作用,可为临床前期或基因递送治疗提供载体基础。
参考文献：
[1]. 脑胶质瘤细胞对血脑屏障的作用及其分子机制[D]. 陈祎招. 中国人民解放军第一军医大学. 2003
[2]. 血脑屏障紧密连接在人脑胶质瘤中的变化及其分子机制[D]. 卢建侃. 南方医科大学. 2010
[3]. 脑胶质瘤动物模型中血脑屏障紧密连接的变化[D]. 王育胜. 南方医科大学. 2009
[4]. 靶向于脑胶质瘤的脂质体给药系统的研究[D]. 吕清. 浙江中医药大学. 2013
[5]. 二甲双胍调节脑胶质瘤周围脑水肿的机制研究[D]. 赵彬. 吉林大学. 2016
[6]. 细胞因子IL-1β和IL-18在缓激肽与罂粟碱伍用开放血肿瘤屏障中的表达[D]. 乔文芳. 中国医科大学. 2008
[7]. 脑胶质瘤端粒酶反义寡核苷酸纳米微粒的制备及治疗研究[D]. 徐越. 南方医科大学. 2008
[8]. 智能靶向递药系统用于脑胶质瘤的治疗[D]. 罗子淼. 华东师范大学. 2018
[9]. 脉冲低剂量率放射治疗对斑马鱼原位脑胶质瘤模型治疗效果和放疗损伤的实验研究[D]. 袁梦珍. 广西医科大学. 2016
[10]. Angiopep-2靶头阿霉素（PEG-PE）纳米颗粒治疗大鼠脑胶质瘤动物模型的研究[D]. 全毅. 延边大学. 2010
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