卢广[1]2004年在《农杆菌浸泡种苗获得转gna基因苜蓿的研究》文中指出雪花莲凝集素基因(gna基因)是目前防治刺吸式口器害虫危害的一种较为理想的抗性基因。将gna基因插入Ti质粒pB1121中的gus基因的上游，得到植物表达载体pLG66m，并将该表达载体导入农杆菌LBA4404，构建用于植物基因转化的双元表达载体系统。gna基因与gus基因构成融合基因并共用一个CaMV35S启动子，可通过组织学检测gus基因的表达，分析T-DNA区基因向植物细胞染色体的转导和整合情况。本实验目的就是利用构建的双元表达载体系统，寻找一种经济有效的方法研究苜蓿功能基因转化的可行性。 农杆菌浸泡植物种苗的转化方法不需要组织培养及植株再生，是摸索一种新型、快速、方便的基因转化方法的有效尝试。本论文以模式种截型苜蓿为实验材料摸索浸泡法转化植物的各种条件。以吸附的农杆菌菌量为指标，综合种子的催芽时间，接种菌液中表面活性剂的浓度及种苗在菌液中的浸泡时间等叁个方面的因素，摸索出农杆菌处理的最佳条件，即用含0.05％表面活性剂Silwet L-77的农杆菌菌液浸泡在25℃催芽24h的苜蓿种子5-10分钟。 另外，通过对农杆菌在植物细胞壁上的吸附、vir基因的表达及gus基因的瞬时表达的研究，初步探讨了该法对截型苜蓿遗传转化的可行性。显微镜观察结果显示，农杆菌能够进入植物细胞间隙，并在细胞壁上形成细菌的集结；同时发现诱导剂蔗糖和乙酰丁香酮等可明显刺激vir基因的表达；组织学检测表明gus基因在处理种苗上的瞬时表达效率超过90％。植株长出第叁片真叶以后，在一些幼苗根部仍能检测到gus基因的表达。因此，通过直接浸泡的简单处理，外源基因能够进入截型苜蓿细胞核中并得到有效表达。 此外，应用紫花苜蓿的一些普通栽培品种为实验材料，并采用浸泡法研究基因转化时发现，实验的15个品种中。只有6个品种检出了gus基因表达的蓝斑，并且渭南苜蓿表达效率最高，为10.5％，但远低于模式种的gus基因表达效率。这说明适合于截型苜蓿转化的各种条件并不能直接应用于紫花苜蓿的所有品种，在实际应用中，使用该方法的合适条件将有待进一步研究。
熊恒硕[2]2006年在《根癌农杆菌介导的Bt和PTA基因转化紫花苜蓿“中苜一号”的初步研究》文中提出紫花苜蓿( Medicago sativa L.)是栽培利用最广泛的豆科牧草,全球种植面积约3500万hm2。苜蓿的大面积种植,也为苜蓿虫害的发生和流行创造了有利的生态条件,近两年来虫害问题日益突出,已成为制约苜蓿产业化发展的主要因素之一。随着生物技术的发展和广泛应用,利用转基因技术改良苜蓿的性状已成为可行的手段。实验选取由本研究室通过常规大田育种技术育成的紫花苜蓿品种“中苜一号”作为基因转化受体,首先,以该品种为对象,选用下胚轴和子叶为外植体,进行组织培养系统学研究,寻找具有相对较高分化率的外植体和适用于该品种的基本培养基等条件;其次,对“中苜一号”进行了除草剂草丁膦(ppt)的敏感性实验,并具体探讨了转化过程中,菌液浓度(OD600),侵染时间,共培养时间等影响转化效率的环节。摸索出转化最佳条件为:以“中苜一号”子叶作为外植体,UM为基本培养基,以OD600为0.6的菌液侵染10分钟,转到加盖有一层灭菌滤纸的培养基上共培养3天后转到筛选培养基上筛选,筛选培养基附加ppt8mg/l及Carb400mg/l。在此基础上以根癌农杆菌菌株EHA105介导,将双基因Bt和PTA转入到紫花苜蓿品种“中苜一号”,最终获得除草剂草丁膦(ppt)抗性的植株,并进行了初步的PCR及RT-PCR分子生物学检测,待进一步的杂交鉴定及昆虫抗性实验。
参考文献：
[1]. 农杆菌浸泡种苗获得转gna基因苜蓿的研究[D]. 卢广. 中国农业大学. 2004
[2]. 根癌农杆菌介导的Bt和PTA基因转化紫花苜蓿“中苜一号”的初步研究[D]. 熊恒硕. 扬州大学. 2006