甲醇芽孢杆菌凝乳酶的重组表达及其结构特性

论文摘要

为进一步了解微生物凝乳酶的结构特性,根据GenBank数据库中甲醇芽孢杆菌凝乳酶（I3EB99）的氨基酸序列和大肠杆菌密码子的偏爱性,设计合成此凝乳酶的全基因序列,构建原核表达载体,通过BL21（DE3）表达其融合蛋白,将获得的融合蛋白进行His标签特异性亲和纯化,并利用生物信息学方法研究凝乳酶的三维空间立体结构。结果表明,重组表达的甲醇芽孢杆菌凝乳酶质量浓度为0.7 mg/mL,凝乳活力为（15 870±1.17）SU/g,蛋白水解活力为（263.81±0.94）U/g,凝乳活力与蛋白水解活力比值为60.16,符合干酪生产加工的要求。结构特性研究表明,经重组表达后的甲醇芽孢杆菌凝乳酶呈现疏水特性,具有跨膜结构和信号肽,二级结构中α-螺旋少于β-折叠,在分离纯化过程中结构不稳定易降解,该凝乳酶与来自甲醇芽孢杆菌的一种未知蛋白酶是同源蛋白,高级结构与PDB蛋白数据库中的模板蛋白2ra1.1.A相似度最高。通过对甲醇芽孢杆菌凝乳酶结构特性的研究,为深入分析该凝乳酶作用机理及其功能性奠定了理论基础。

论文目录

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.2 仪器与设备

1.3 方法

1.3.1 甲醇芽孢杆菌凝乳酶基因的合成

1.3.2 甲醇芽孢杆菌凝乳酶重组质粒的构建与验证

1.3.2. 1 重组质粒的构建

1.3.2. 2 TOP10克隆菌株感受态的制备

1.3.2. 3 重组质粒转化感受态菌株

1.3.2. 4 重组质粒的扩增及鉴定

1.3.3 重组甲醇芽孢杆菌凝乳酶的表达纯化

1.3.3. 1 pET28a（+）-I3EB99转化至大肠杆菌Rosetta

1.3.3. 2 IPTG诱导p ET28a（+）-I3EB99融合蛋白的表达

1.3.3. 3 pET28a（+）-I3EB99融合蛋白的纯化

1.3.4 凝乳活力的测定

1.3.5 金属离子对甲醇芽孢杆菌凝乳酶凝乳活力的影响

1.3.6 蛋白水解活力的测定

1.3.7 重组甲醇芽孢杆菌凝乳酶质量浓度测定

1.3.8 SDS-PAGE分析

1.3.9 甲醇芽孢杆菌凝乳酶的结构预测[23]

2 结果与分析

2.1 甲醇芽孢杆菌凝乳酶基因的密码子优化设计与全基因合成

2.2 甲醇芽孢杆菌凝乳酶重组表达载体的构建和鉴定结果

2.3 甲醇芽孢杆菌凝乳酶在大肠杆菌中的诱导表达

2.4 重组甲醇芽孢杆菌凝乳酶的分离纯化

2.5 重组甲醇芽孢杆菌凝乳酶的结构特性

2.5.1 甲醇芽孢杆菌凝乳酶的结构预测结果

2.5.2 甲醇芽孢杆菌凝乳酶的序列鉴定

2.5.3 甲醇芽孢杆菌凝乳酶的高级结构

3 结论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 李柳,郑喆,吴凤玉,郝一江,赵笑,曹永强,余志坚,陈超,杨贞耐

关键词: 凝乳酶,全基因合成,原核表达,亲和纯化,结构预测

来源: 食品科学 2019年22期

年度: 2019

分类: 工程科技Ⅰ辑

专业: 轻工业手工业

单位: 北京食品营养与人类健康高精尖创新中心食品添加剂与配料北京高校工程研究中心北京工商大学

基金: 国家自然科学基金青年科学基金项目(31601488)

分类号: TS252.53

页码: 39-46

总页数: 8

文件大小: 4800K

下载量: 116

甲醇芽孢杆菌凝乳酶的重组表达及其结构特性

论文摘要

论文目录

文章来源

相关论文文献

猜你喜欢