导读:本文包含了转基因山羊论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:转基因,乳腺,基因,层析,山羊,生物反应器,绒山羊。
转基因山羊论文文献综述
周敏雅,陆睿,张婷,袁婷婷,卢瑶瑶[1]（2019）在《重组人SOD1/3转基因山羊的制备及表达产物的检测》一文中研究指出设计了以hSOD1、hSOD3为编码序列,以山羊β-酪蛋白/CMV杂合启动增强子构建乳腺特异性表达载体rhSOD1、rhSOD3,共转染母山羊胎儿成纤维细胞,采用PCR和扩增产物序列分析筛选获得SOD1/3克隆细胞株,应用体细胞核移植(SCNT)制备双转基因山羊。出生小羊经PCR和扩增产物序列分析验证是否成功整合外源基因,经Western blotting、ELISA及体外活性检来验证分析表达产物。结果表明:获得SOD1/3转基因山羊胎儿成纤维细胞系6株;原代双转基因体克隆山羊1只(♀);从该转基因羊乳汁中检测到rhSOD1、rhSOD3,浓度分别为:88.81±8.36 mg/L和267.82±12.67 mg/L;转基因羊乳汁中重组人SOD酶活性为1 432±157 U/mL。研究表明,以双载体和单标记基因转染山羊胎儿成纤维细胞可获得双基因整合转基因细胞系,并且以SOD1与SOD3功能基因均可在山羊乳腺中共同表达,表达产物具有较好的生物学活性。(本文来源于《生物技术通报》期刊2019年05期）
孟鹏[2]（2019）在《转基因山羊精液冷冻保存方法的优化及生产应用》一文中研究指出本课题组前期利用慢病毒转基因技术,构建猪瘟病毒结构蛋白E2和口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因的慢病毒表达载体,包装病毒颗粒,用慢病毒感染胚胎,制备得到转基因山羊,为基因工程疫苗的研究提供病毒的抗原蛋白。本研究利用PCR技术,从转基因胚胎移植后代中筛选转基因公羊。同时,为了快速扩繁转基因羊群体,使转基因山羊精液得到长期保存,充分发挥和提高优良转基因公羊的利用率,本研究对转基因公羊的精液品质进行分析,比较转基因公羊和普通公羊的精液品质,并通过进一步探究山羊精液的冷冻保存稀释液配方及其冷冻过程,摸索出一个更优化的冷冻保存方案。获得结果如下:1.转基因胚胎移植受体母羊生产后代后,选择公羊采集血液,并从血液中提取基因组DNA,进行PCR鉴定,PCR产物经胶回收后连接T载体进行测序验证;提取成年转基因公羊精液基因组,再次鉴定验证。结果显示,3只PCDH-BP5/11-OFMDV-VP1转基因羊和3只PCDH-BP5/11-CSFV-E2转基因羊的精液基因组中都整合有外源基因。2.转基因公羊与普通种公羊的精液品质,从射精量,精液密度,精子活率、质膜完整性、线粒体活性以及脂质氧化水平等各个检测指标相比较,均为差异性不显着(P>0.05),表明转基因公羊性能良好,可以作为种公羊进行扩繁。3.总结出一个更为优化的山羊精液冷冻稀释液配方,即冷冻稀释A液:Tris0.5mg/mL,葡萄糖52mg/mL,果糖52mg/mL,柠檬酸叁钠3.5mg/mL,EDTA 0.7mg/mL,番茄红素1.0mg/mL,海带多糖1.0mg/mL,枸杞多糖2.0mg/mL,富含胆固醇的环糊精CLC 1.5mg/mL,庆大霉素0.3mg/mL,一般配制成100mL,在终体积的基础上加入15%的蛋黄。冷冻稀释B液:在A液的基础上加5%甘油。优化稀释液与普通稀释液相比较,冻存后精子的活率、质膜完整性、线粒体活性和脂质氧化水平等几个指标差异性显着(P<0.05);而转基因羊和普通公羊精液冻存后,其冷冻效率无差异(P>0.05)。本研究证明实验获得的转基因公山羊精子基因组中含有外源基因,同时利用优化的冷冻保存方案保存大量转基因羊精液,为后续扩繁转基因羊群体奠定了基础。利用优化的山羊精液冷冻保存方法制备的冻精,可进行人工授精,且与自然配种产羔率相近,说明优化的冷冻稀释液优良,可进行临床应用。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2019-05-01）
魏彪[3]（2018）在《猪瘟和口蹄疫病毒结构蛋白转基因奶山羊的制备》一文中研究指出猪瘟和口蹄疫分别感染猪和偶蹄动物,传播范围广,危害大,造成了严重的经济损失。当前主要采用病毒弱毒苗和灭活苗防控,但是两者都有一定的缺陷,所以研发一种抗猪瘟和口蹄疫病毒的基因工程亚单位疫苗十分必要。研究发现,猪瘟病毒结构蛋白E0、E2和口蹄疫病毒结构蛋白中的VP1蛋白能够诱导动物体内产生针对病毒的中和抗体。因此,本实验利用慢病毒转基因技术,制备猪瘟和口蹄疫病毒重要结构蛋白奶山羊乳腺生物反应器。构建了猪瘟病毒结构蛋白E0、E2和口蹄疫病毒结构蛋白(VP1蛋白)外源基因的慢病毒表达载体,包装病毒颗粒,转染山羊乳腺上皮细胞验证猪瘟病毒结构蛋白E0、E2和口蹄疫病毒结构蛋白(VP1蛋白)在宿主细胞内的表达;用慢病毒感染胚胎,制备转基因羊,获得如下结果:1.利用PCR技术克隆了CSFV-E0、CSFV-E2、AFMDV-VP1、OFMDV-VP1目的基因,并在5’端加His-Flag标签;克隆两个乳腺特异性的BLG启动子,分别为BLG5和BLG11;利用上述元件构建出乳腺特异性的慢病毒载体PCDH-BP5/11-CSFV-E2、PCDH-BP5/11-CSFV-E0、PCDH-BP5/11-AFMDV-VP1、PCDH-BP5/11-OFMDV-VP1双酶切鉴定验证了载体构建成功。2.将慢病毒包装质粒PMD2G、PSPAX和慢病毒载体质粒PCDH-BP5/11-CSFV-E2、PCDH-BP5/11-CSFV-E0、PCDH-BP5/11-AFMDV-VP1、PCDH-BP5/11-OFMDV-VP1共转293T细胞,得到了带有目的基因的慢病毒,感染乳腺上皮细胞,RT-PCR和Western blotting检测到乳腺上皮细胞上清中有CSFV-E2、CSFV-E0、AFMDV-VP1和OFMDV-VP1的表达。3.利用超数排卵技术,获得山羊受精卵180枚,将病毒液注射到受精卵透明带间隙,选择存活的胚胎149枚,移植受体50只,获得后代35只,经PCR鉴定,获得PCDH-BP5/11-AFMDV-VP1转基因羊4只,PCDH-BP5/11-OFMDV-VP1转基因羊6只,PCDH-BP5/11-CSFV-E0转基因羊3只,PCDH-BP5/11-CSFV-E2转基因羊3只。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2018-05-01）
申瑶[4]（2018）在《乳腺特异表达抗人黑色素瘤/CD28双特异性抗体转基因山羊的研究》一文中研究指出黑色素瘤是威胁全球健康的恶性肿瘤,严重威胁人类的健康。目前已有15种抗体药物被FDA批准应用于恶性肿瘤的治疗。但是化疗药物的疗效并不理想,使黑色素瘤面临越来越高的发病率和死亡率。现阶段单一靶点治疗的抗体应用已经有所局限,抗体药物将来的发展方向是多个靶点或者多种手段的联合治疗。迄今为止,介导杀死癌细胞的大多数双特异性抗体具有用于有效激活T细胞的CD3结合位点。在80年代末发现另一个靶位点是CD28,抗CD28单克隆抗体9.3提供了在T细胞活化中旁路辅助细胞需求的信号。从那时起,已经描述了许多具有CD28结合位点的双特异性抗体,其能够不与TCR/CD3结合而激活T细胞。这种效应可通过T细胞和结合的癌细胞之间的突触间隙的形成来解释,由这些细胞的接近产生。这使得T细胞能够将其毒素释放到该间隙中,这导致间隙中的毒素浓度局部的远高于无向释放的。被称为r28M的双特异性蛋白质针对黑素瘤相关的蛋白聚糖和T细胞上的人CD28分子。为使该抗体可以在转基因山羊乳腺中获得高效表达,本研究选择了牛β-乳球蛋白的基因组框架与r28M编码序列组合成了一系列新的min基因编码框架。内含子在r28M内的插入位点会影响基因转录过程中的正确剪切,本研究设计构建了以pcDNA3.0为载体框架的四种双特异性抗体质粒GN2017m、GN2017R、GN2017R4、GN2017用于细胞水平cDNA、蛋白的表达检测。通过RT-PCR及SDS-PAGE检测发现GN2017R4在细胞水平有目的蛋白表达。构建能在乳腺反应器特异表达的质粒pTM-GN2017R4,利用Cre/loxp重组酶系统将pTM-GN2017R4目的基因定位整合入人溶菌酶转基因山羊细胞内,通过体细胞核移植方法制备抗人黑色素瘤CD28双抗转基因山羊。将上述pTM-GN2017R4质粒与PBS185质粒共转染人溶菌酶山羊成纤维细胞,利用嘌呤霉素抗性筛选得到阳性克隆,通过PCR及测序验证目的基因是否整合到预定位点,最终成功获得了定位整合阳性细胞株,并作为体细胞核移植的供体。选择30头2岁左右健康关中奶山羊作为供体,控制同步发情,最终超数排卵处理后总共获得卵母细胞248个,融合后获得重构胚159株,移植入20头受体母羊内。35天后进行B超妊娠检查,共检查到11头母羊出现孕囊,怀孕率为55%(11/20)。剖腹取出35天大小羊胎儿,经PCR方法和测序鉴定,此胎儿为pTM-GN2017R4转基因羊。本研究利用转基因山羊乳腺生物反应器为大量生产GN2017双特异性抗奠定了坚实的基础。(本文来源于《扬州大学》期刊2018-04-01）
徐晟[5]（2017）在《重组人乳铁蛋白转基因奶山羊的制备及表达产物提取和抗菌活性研究》一文中研究指出乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)是一种铁结合性糖蛋白,因其生物活性功能广泛,已被应用于医药开发、食品加工、保健品生产等领域。目前,国内外市场上销售的乳铁蛋白及其相关产品主要从牛乳中分离纯化所得。因其来源的限制,天然乳铁蛋白的产量已经无法满足人们日益增长的需求。因此,利用转基因技术生产重组人乳铁蛋白(RecombinentHuman Lactoferrin,rhLF)作为天然乳铁蛋白的替代品,已经成为研究和开发乳铁蛋白的主要途径。本研究中,使用本实验室保存的乳腺特异性表达重组人乳铁蛋白载体菌株,通过扩增后获得乳腺特异性表达载体(PCL25/hLF),双酶切并切胶回收目的基因片段(zpz-1);利用细胞显微注射技术,将zpz-1注射入雌性奶山羊胎儿成纤维细胞(N31);通过G418筛选,获得16株胎儿成纤维细胞单克隆细胞株。经PCR检测,其中7株整合PCL25/hLF基因。以其中1株(N31zpz-1-13)作为供核细胞,使用核移植、电融合等技术获得重构胚140枚,移植136枚,共移植9只受体,其中2只受体于移植后第22周分娩,获得2只雌性奶山羊,分别编号为zp-71和zp-72,只有zp-71健康成长至体成熟。经PCR检测,zp-71整合PCL25/hLF基因。待zp-71体成熟后发情时进行人工配种,于配种后第22周分娩,连续收集30天羊乳。ELISA检测zp-71羊乳清中rhLF的表达水平;使用AKATA蛋白纯化系统,运用阳离子交换层析技术分离纯化rhLF;以青链霉素、人初乳浓缩乳清为阳性对照,以正常羊乳浓缩乳清为阴性对照,以纯化的rhLF(lmg)、转基因奶山羊zp-71的浓缩乳清为实验组,制备药敏纸片,进行抑菌试验。ELISA检测zp-71乳清中rhLF的结果显示:转基因奶山羊zp-71分娩后连续30天的乳清中均含有rhLF。对比天然乳铁蛋白的表达特点,本验室保存的PCL25/hLF表达载体(含β-casin与CMV复合启动子)能在转基因羊乳腺中有效稳定地表达。离子交换层析的结果显示:以0.5MNaCl-HAC-Tris作为洗脱液进行洗脱,得到两个洗脱峰。SDS-PAGE电泳结果及凝胶成像结果显示:洗脱峰Ⅰ中含有多条带,洗脱峰Ⅱ为单一条带;Western Blotting结果显示:洗脱峰Ⅱ中的产物为rhLF。抑菌试验结果显示:转基因奶山羊zp-71的乳清及其纯化产物均具有抑菌活性,4h的抑菌圈分别为1.70cm和1.30cm。本研究表明:应用实验室前期构建的PCL25/hLF乳腺特异性表达载体制备的转基因山羊具有乳腺特异表达rhLF功能;并且,重组人乳铁蛋白表达产物可以从转基因羊乳汁中提取;提取获得的rhLF和浓缩的转基因乳清抑菌试验显示均有抑菌活性。由此证明:人乳铁蛋白基因转基因山羊乳腺中表达的重组人乳铁蛋白在乳汁中单独存在,而且具有与天然人乳铁蛋白相似的抗菌活性。研究也表明:运用以HAC-Tris-NaCl为缓冲体系进行洗脱的阳离子交换层析技术可有效提取转基因羊乳中的rhLF,这一结果在国内外尚未见报道。同时此方法的建立也为转基因奶山羊乳中重组人乳铁蛋白的提取建立了技术基础,为今后工业化大规模分离纯化rhLF提供参考。(本文来源于《扬州大学》期刊2017-06-14）
刘丹丹[6]（2017）在《Nramp1基因定点整合转基因山羊的制备》一文中研究指出结核病是威胁全球健康的慢性传染性人畜共患病,目前缺乏有效的预防和根治方法。目前认为结核病的发病机理是:致病性结核分支杆菌通过呼吸系统进入体内,与肺部巨噬细胞膜表面受体结合后形成吞噬小体,通过获取铁等金属离子,产生大量活性酶类,从而抵抗巨噬细胞的杀伤作用,在细胞内寄生,从而难以治愈。Nramp1蛋白的功能之一是将金属离子从吞噬体内腔转运到细胞质内,通过限制金属离子限制病菌生产活性酶的能力,阻止结核分支杆菌的增殖。通过转基因手段来增强羊Nramp1基因过表达,培育抗病种群,可成为控制羊结核病一个新的切入点。Cre/loxp位点特异性重组系统由Cre重组酶和loxp位点两部分组成,Cre重组酶不仅具有催化活性,而且与限制酶相似,能识别特异的DNA序列,即loxP位点,使loxP位点间的基因序列被删除或重组。该定点整合方法主要有以下优点:(1)外源基因能够准确地整合到宿主染色体的特定位点;(2)减少转基因生物中外源基因的拷贝数,整合上的外源基因多数都是未发生重排的单拷贝。本研究主要通过Cre/loxp重组酶系统将Nramp1基因定点整合入人溶菌酶转基因山羊细胞内,从而通过核移植方法制备抗结核分支杆菌的Nramp1转基因山羊。首先分离了人溶菌酶高表达转基因山羊耳成纤维细胞3-376♂,其基因组内包括盒式交换系统loxp1-Neo-Tk-loxp表达框架,并且此框架中loxp序列为突变型,即将野生型loxp位点的反向重复序列“ATAAC”突变为“CACCT”。人工合成含有Nrampl基因的表达框架,第132位氨基酸由异亮氨酸(I)突变为苏氨酸(T),此突变蛋白特异性表达于巨噬细胞中,具有抗胞内菌活性,尤其适用于预防和治疗胞内菌引起的感染。通过酶切,连接等步骤得到框架为 loxp2-polyA-Nrampl-Purocoda-loxp 的Nramp1 定点表达载体质粒 pTM-Nramp1。将上述pTM-Nramp1质粒与pBS185质粒共同转染3-376♂细胞,嘌呤霉素抗性筛选得到22株克隆,经PCR及测序鉴定,其中3株目的基因已经整合到预定位点,为定位整合阳性细胞株,整合效率为13.6%(3/22),挑取其中状态良好的11号细胞作为体细胞核移植的核供体。挑选50头2岁左右健康母羊作为供体羊,同步发情,超数排卵处理后获得卵母细胞总数为155个,移核卵数111个,融合后获得重构胚105株,融合率94.59%(105/111),移植入13头受体母羊输卵管内。35天后进行B超妊娠检查,共检查到6头母羊出现孕囊,怀孕率为46%(6/13)。47天时剖腹取出一个胎儿,155天顺产获得一只健康公羊,经PCR方法和测序鉴定,此胎儿和新生小羊均为Nramp1定位整合转基因公羊,该公羊目前仍然健康,这为Nramp1转基因羊的扩繁奠定坚实的基础。(本文来源于《扬州大学》期刊2017-06-01）
诺明途,梁浩,聂永伟,邰大鹏,乃门塔娜[7]（2016）在《转基因阿尔巴斯白绒山羊外源DsRed基因拷贝数与外源基因表达的关系》一文中研究指出转基因动物的外源基因通过使用体细胞克隆与胚胎移植的方法将表达载体转入细胞后获得,大多以随机整合的形式存在于受体动物的基因组中,而转基因动物中外源基因的整合拷贝数是影响外源基因表达水平及遗传稳定性的重要因素之一,作为转基因动物遗传稳定性的鉴定指标,获得存活的转基因动物后便有必要对其外源基因拷贝数进行检测。为了研究转基因阿尔巴斯白绒山羊(Capra hircus)基因组内外源海葵红色荧光蛋白(red fluorescence protein from Discosoma sp.,Ds Red)基因的拷贝数与其表达量之间是否存在一定的联系,本研究采用较鉴定外源基因拷贝数的传统方法DNA印迹杂交(Southern blot)更为高效率、高灵敏度、高准确性的绝对定量q RT-PCR法检测了6只转基因白绒山羊外源Ds Red基因表达框中3个不同片段的拷贝数。结果表明,外源基因3个片段的拷贝数分别为巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)启动子:2.80±0.38~13.68±0.16;Ds Red基因:1.34±0.04~11.84±0.02;CMV启动子与Ds Red连接处:1.58±0.04~19.22±0.38。通过q RT-PCR中相对定量的方法检测了6只转基因白绒山羊外源Ds Red基因m RNA表达量,将其与外源基因中3个不同片段的拷贝数数据分别使用SPSS软件进行相关性分析后,相关性系数P值的结果为:CMV启动子为P=0.763;Ds Red基因为P=0.665;CMV启动子与Ds Red连接处为P=0.803,3组P值均大于0.05,无显着性相关。上述结果表明,在所检测的6只转基因阿尔巴斯白绒山羊中外源CMV启动子启动的Ds Red基因的表达量与其在转基因白绒山羊基因组内的拷贝数在0.05的水平没有显着相关性。另外验证了绝对定量q RT-PCR法在大型转基因家畜的外源基因拷贝数的研究中的可靠性:其重复性良好,误差可控,可以成为检测转基因动物外源基因拷贝数的首选方法。(本文来源于《农业生物技术学报》期刊2016年06期）
诺明途[8]（2016）在《转基因阿尔巴斯白绒山羊外源基因沉默相关研究》一文中研究指出转基因沉默(Transgenic Silencing)现象普遍存在于转基因动植物上,因而给转基因动物的培育和应用价值带来了新的难题。目前,学界对转基因沉默现象及其发生机制进行了广泛的研究。从所报道的转基因沉默的例子来看,几乎所有的转基因沉默现象都与外源启动子的甲基化、组蛋白乙酰化异常及外源基因拷贝数有关。在过去5年时间里,本实验室累计获得了上百只携带报告基因DsRed(Red fluorescence protein from Discosoma sp.海葵红色荧光蛋白)的PO代转基因白绒山羊,其中一部分存在转基因沉默的现象。转基因沉默现象会严重制约转基因动物外源基因的有效表达,对转基因沉默现象的机理进行研究,并对其提出可能的解决方案,可以为今后提高转基因动物外源基因的表达效率提供实验依据。本研究从以上转基因白绒山羊中选取了有代表性的6只进行研究,培养其耳尖成纤维细胞,以及一部分表皮来源的细胞。研究发现,在荧光激发器激发下,与对照组相比,在部分成年转基因白绒山羊个体及所采细胞样品中均检测不到红色荧光,这与CMV启动子的特性并不相符,表明发生了转基因沉默现象。经过对选取的转基因白绒山羊检测发现,其基因组中均具有完整的外源DsRed基因表达框。实时荧光定量PCR的结果显示,仅在编号为ZK110321的个体中DsRed mRNA较其他个体表达量稍高,但仍低于核供体细胞CFC3-KI的表达水平。Western Blot的检测结果显示,只有ZK110324-1个体和CFC3-KI细胞可以检测到DsRed蛋白的表达。并且根据来自ZK0311-1和ZK110324-1个体的成纤维细胞和表皮细胞的DsRed mRNA表达量的不同的结果可以推断,CMV启动子在白绒山羊不同组织中的沉默程度有所不同。通过实时荧光定量技术的绝对定量方法获得了6只转基因白绒山羊的外源基因拷贝数,但均与DsRed表达量无显着相关性,排除了外源基因拷贝数对DsRed基因表达量的影响。通过重亚硫酸氢盐测序的方法对转基因白绒山羊进行CMV启动子的甲基化状态的研究。本实验中6只健康转基因白绒山羊和未经克隆的核供体细胞CFC3-KI外源CMV启动子的甲基化状态数据显示,有4只成体转基因白绒山羊的外源基因启动子处于很高的甲基化状态(77.4%-88.2%)有一只处于中等偏高的甲基化状态(58.7%),有一只转基因白绒山羊外源基因启动子处于较低的甲基化状态(21.0%),未经克隆的核供体细胞甲基化程度很低(14.3%)。将以上数据与DsRed基因的表达情况关联分析后发现,转基因白绒山羊外源基因的表达水平与启动子的甲基化状态呈显着负相关。因此外源CMV启动子的甲基化水平高是外源基因沉默的主要原因。为使转基因白绒山羊细胞中发生沉默的外源基因恢复表达,本实验采用了甲基化酶抑制剂5氮杂胞苷(5-Azacytidine,5-Az)和去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(Trichostatin A, TSA)处理的方法培养转基因白绒山羊细胞。首先以ZK0311-1和ZKl 10324-1个体的成纤维细胞和表皮细胞进行了最适药物浓度的筛选,结果为：处理成纤维细胞最适5-Az浓度为5μmol/L,TSA浓度为5μmol/L,处理表皮细胞的最适5-Az浓度为20μmol/L,TSA浓度为1μmol/L。5-Az的处理时间为7d,TSA的处理时间为24h。之后使用该浓度处理其他转基因白绒山羊耳尖成纤维细胞后获得了良好的外源DsRed基因恢复表达的效果,经5-Az的处理,使ZK110324-2耳尖成纤维细胞中DsRed mRNA的表达量提高了50.19倍；经TSA的处理,使ZK0311-1耳尖成纤维细胞中DsRed mRNA的表达量提高了15.08倍。另对5-Az处理组的6只转基因白绒山羊耳尖成纤维细胞及核供体细胞外源CMV启动子的甲基化水平进行了检测,结果表明ZK0311-1、ZK110324-1和ZK110324-2的耳尖成纤维细胞CMV启动子的甲基化水平都有显着下降,验证了5-Az降低外源基因启动子甲基化水平的有效性。在药物最适浓度筛选实验中TSA浓度与DsRed mRNA的表达量与呈剂量依赖型关系,推断组蛋白乙酰化异常也是导致转基因白绒山羊外源基因沉默的原因之一。对所获得的两只在全身和细胞水平均未表达红色荧光蛋白的转基因白绒山羊(ZK0310-1和ZK0311-1)耳尖成纤维细胞进行体细胞克隆,经过卵母细胞的综合重编程作用,红色荧光在核移植重构胚胎中获得了恢复表达。通过以上实验我们得出：转基因白绒山羊不同个体中外源基因表达并不相同,甚至发生外源基因沉默,这与外源基因的CMV启动子的甲基化以及转基因动物的组蛋白异常乙酰化有关；CMV启动子在转基因白绒山羊不同组织中的沉默程度有所不同；甲基化酶抑制剂5-Az以及去乙酰化酶抑制剂TSA的处理对转基因白绒山羊细胞的外源基因表达模式又有一定的改变作用,且使用TSA和5-Az进行处理是提高外源基因表达效率的有效措施；将外源基因沉默的转基因白绒山羊细胞作为供体细胞进行体细胞克隆也有助于外源基因的恢复表达。(本文来源于《内蒙古大学》期刊2016-05-17）
宫韶铬[9]（2016）在《外源基因VEGF在转基因绒山羊中的表达和遗传稳定性研究》一文中研究指出血管内皮生长因子(vascular endothelial cell growth factor, VEGF),是一种可以在动物毛囊中表达的毛乳头细胞自分泌生长因子。研究表明,VEGF基因可以在体内诱导血管新生,对于动物毛囊发育和毛发生长起重要作用。因此本实验室选择VEGF基因作为外源基因对阿尔巴斯白绒山羊进行转基因培育,期望获得高产绒量的转基因绒山羊,并为进一步探索VEGF基因在动物体内的作用机理提供实验依据。本实验室近年来通过体细胞克隆技术获得的VEGF转基因绒山羊中,有羊绒产量显着提高和羊绒产量未出现明显改善的转基因绒山羊,并且成年转基因绒山羊通过有计划的配种产生了子代羊。本实验选择了一只产绒量显着提高的转基因绒山羊(1号)及其两只子代(2号、3号)和一只产绒量未见明显改善的转基因绒山羊(4号)及其两只子代(5号、6号)进行检测,并与来自于同一细胞系的体细胞克隆绒山羊(7号)进行对比,确定外源VEGF基因在不同代次转基因绒山羊体内的遗传效率、表达量,为深入探索外源基因在转基因动物中的遗传规律提供实验依据。本实验从DNA、RNA、蛋白质叁个水平对转实验样本进行检测,检测结果如下：(1)通过PCR鉴定,1号、2号、3号、4号羊呈转基因阳性。5号、6号羊呈转基因阴性。(2)使用Glucagon基因作为内参、绝对定量PCR法对外源VEGF基因拷贝数进行检测。得到标准曲线公式：log2N=-0.3879ΔCt+0.3122 (R2=0.9978, p<0.001)计算得到各转基因绒山羊的外源基因拷贝数分别为：1号,1.235；2号,0.977；3号0.962；4号,1.884。1号、2号、3号羊外源基因为单拷贝,4号羊为双拷贝。(3)以GAPDH基因作为内参,使用Real-time-PCR和western blot对外源基因表达量进行检测。结果显示,与7号体细胞克隆羊相比,转基因绒山羊皮肤组织中外源VEGF基因mRNA及蛋白表达量分别是：1号,3.53倍、2.93倍；2号,2.78倍、2.56倍；3号,0.95倍、1.24倍；4号,1.23倍、1.03倍；5号,0.78倍、0.96倍；6号,1.02倍、0.72倍。转基因绒山羊血液中外源VEGF基因mRNA及蛋白表达量分别是：1号,0.57倍、0.98倍；2号,0.78倍、0.87倍；3号,0.69倍、1.12倍；4号,0.32倍、0.94倍；5号,0.91倍、1.12倍；6号,0.89倍、0.83倍。以上结果显示,外源VEGF基因在转基因绒山羊中的表达具有皮肤组织特异性,并且部分转基因绒山羊外源基因可以遗传给下一代转基因绒山羊。外源基因的表达量和遗传效率与拷贝数没有直接关系。上述实验结果为今后深入研究外源基因在转基因动物中的遗传规律打下了基础。(本文来源于《内蒙古大学》期刊2016-04-15）
师丙波[10]（2016）在《CRISPR/Cas9系统介导的VEGF164基因定点敲入绒山羊转基因细胞的构建》一文中研究指出迅速发展的CRISPR/Cas9技术可以在基因组中高效定点的敲除或者敲入靶基因。体细胞核移植技术则可使细胞优异基因型在动物个体层面得以实现或扩大。可是,在转基因动物研究与实践中,经常需要将外源基因定点地整合到基因组中。为此,本研究拟建立一套CRISPR/Cas9介导的靶向定点敲入技术系统,期望与体细胞核移植技术体系联合使用,促进高产绒量转基因绒山羊育种。具体的,利用CRISPR/Cas9技术在绒山羊胎儿成纤维细胞中将VEGF164基因靶向敲入到毛囊特异性启动子KAP6.1的3’UTR,得到可用于体细胞核移植的VEGF164转基因细胞系。试验过程和主要结果如下:1同源打靶载体构建。利用PB513B和pcDNA3.1载体以及合成的T2A序列构建中间载体PB-G。利用KAP6.1区域序列设计左右同源臂,长度分别为1100bp和1500bp,将同源臂连入PB-G得到PB-G-H。PCR获得的VEGF164、DsRed基因,再通过酶切连接连入PB-G-H,成功获得同源打靶载体PB-G-H-VEGF164-DsRed;2 sgRNA的验证。在绒山羊KAP6.1的3’非编码区设计sgRNA。将sgRNA靶位点序列连入pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin,并与pST1374-Cas9-ZFNLS AmpBst共转染绒山羊胎儿成纤维细胞。用T7E1酶切检测和T-A测序检测Cas9作用效果。6个sgRNA中4个sgRNA在靶位点切割有切割,效率分别为36.31%、29.68%、33.84%、9.14%,仅有sgRNA12存在脱靶现象;3基因敲入效率检测。同源打靶载体、sgRNA载体以及pST1374-Cas9-ZFNLS AmpBst共转染绒山羊胎儿成纤维细胞。稻瘟菌素和嘌呤霉素初筛后,用流式细胞仪检测基因敲入效率。4个sgRNA与Cas9介导VEGF164同源重组的效率分别为26.9%、27.6%、26.8%、15.7%;4阳性细胞克隆筛选。利用sgRNA载体以及同源臂载体和pST1374-Cas9-ZFNLS AmpBst共转染胎儿成纤维细胞,利用嘌呤霉素筛选获得阳性细胞克隆。用PCR检测细胞克隆DNA的基因敲入情况,并利用荧光定量PCR检测外源基因的表达情况。结果表明,利用sgRNA5:Cas9结合同源重组进行靶向敲入效果较好,细胞克隆阳性率较高(10/13)。在阳性细胞克隆中,外源基因敲入后可顺利表达,并且不影响KAP6.1的正常表达。综上所述,成功构建出了由PB-G-H-VEGF164-DsRed与pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin和pST1374-Cas9-ZFNLS AmpBst共同组成的绒山羊成纤维细胞定点敲入系统,为利用转基因技术获得高产绒量转基因绒山羊的奠定了理论与技术基础。除此之外,本试验利用此系统成功获得VEGF164基因定点敲入的陕北白绒山羊胎儿成纤维细胞克隆,可以作为供体细胞用于核移植获得转基因绒山羊,具有实用价值。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2016-04-01）
转基因山羊论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本课题组前期利用慢病毒转基因技术,构建猪瘟病毒结构蛋白E2和口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因的慢病毒表达载体,包装病毒颗粒,用慢病毒感染胚胎,制备得到转基因山羊,为基因工程疫苗的研究提供病毒的抗原蛋白。本研究利用PCR技术,从转基因胚胎移植后代中筛选转基因公羊。同时,为了快速扩繁转基因羊群体,使转基因山羊精液得到长期保存,充分发挥和提高优良转基因公羊的利用率,本研究对转基因公羊的精液品质进行分析,比较转基因公羊和普通公羊的精液品质,并通过进一步探究山羊精液的冷冻保存稀释液配方及其冷冻过程,摸索出一个更优化的冷冻保存方案。获得结果如下:1.转基因胚胎移植受体母羊生产后代后,选择公羊采集血液,并从血液中提取基因组DNA,进行PCR鉴定,PCR产物经胶回收后连接T载体进行测序验证;提取成年转基因公羊精液基因组,再次鉴定验证。结果显示,3只PCDH-BP5/11-OFMDV-VP1转基因羊和3只PCDH-BP5/11-CSFV-E2转基因羊的精液基因组中都整合有外源基因。2.转基因公羊与普通种公羊的精液品质,从射精量,精液密度,精子活率、质膜完整性、线粒体活性以及脂质氧化水平等各个检测指标相比较,均为差异性不显着(P>0.05),表明转基因公羊性能良好,可以作为种公羊进行扩繁。3.总结出一个更为优化的山羊精液冷冻稀释液配方,即冷冻稀释A液:Tris0.5mg/mL,葡萄糖52mg/mL,果糖52mg/mL,柠檬酸叁钠3.5mg/mL,EDTA 0.7mg/mL,番茄红素1.0mg/mL,海带多糖1.0mg/mL,枸杞多糖2.0mg/mL,富含胆固醇的环糊精CLC 1.5mg/mL,庆大霉素0.3mg/mL,一般配制成100mL,在终体积的基础上加入15%的蛋黄。冷冻稀释B液:在A液的基础上加5%甘油。优化稀释液与普通稀释液相比较,冻存后精子的活率、质膜完整性、线粒体活性和脂质氧化水平等几个指标差异性显着(P<0.05);而转基因羊和普通公羊精液冻存后,其冷冻效率无差异(P>0.05)。本研究证明实验获得的转基因公山羊精子基因组中含有外源基因,同时利用优化的冷冻保存方案保存大量转基因羊精液,为后续扩繁转基因羊群体奠定了基础。利用优化的山羊精液冷冻保存方法制备的冻精,可进行人工授精,且与自然配种产羔率相近,说明优化的冷冻稀释液优良,可进行临床应用。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
转基因山羊论文参考文献
[1].周敏雅,陆睿,张婷,袁婷婷,卢瑶瑶.重组人SOD1/3转基因山羊的制备及表达产物的检测[J].生物技术通报.2019
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[3].魏彪.猪瘟和口蹄疫病毒结构蛋白转基因奶山羊的制备[D].西北农林科技大学.2018
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[10].师丙波.CRISPR/Cas9系统介导的VEGF164基因定点敲入绒山羊转基因细胞的构建[D].西北农林科技大学.2016
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