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Viperin催化解旋酶甲硫氨酸的氧化并促进其蛋白稳定及功能

2020-12-02阅读(902)

Viperin催化解旋酶甲硫氨酸的氧化并促进其蛋白稳定及功能

论文摘要

解旋酶在DNA复制、核糖体合成、RNA剪接等多种细胞过程中发挥着重要作用。解旋酶的翻译后修饰（post-translational modifications,PTMs）对调节其定位、功能和稳定性具有重要作用。本研究中,我们鉴定了一种之前未被发现的解旋酶蛋白翻译后修饰,即解旋酶甲硫氨酸的氧化,并发现这种翻译后修饰广泛存在于DNA解旋酶如卡波氏肉瘤相关疱疹病毒编码的病毒DNA解旋酶ORF44和宿主细胞解旋酶MCM7,以及RNA解旋酶RIG-I中。此外,我们发现宿主蛋白Viperin催化这些解旋酶的甲硫氨酸氧化修饰。Viperin是一个干扰素诱导基因（interferon-stimulated gene,ISG）,其主要功能是参与宿主的天然免疫并发挥抗病毒功能,而该蛋白是否存在其它功能仍不清楚。进一步的功能缺失突变和药理学抑制剂实验证明甲硫氨酸氧化能够有效稳定解旋酶蛋白的表达并增强解旋酶的功能,而这些解旋酶参与到如DNA复制、天然免疫等一系列的细胞过程中。综上所述,本研究证实了Viperin具有催化解旋酶甲硫氨酸氧化的功能,并且发现这种解旋酶的翻译后修饰广泛参与到各种重要的细胞活动过程中。

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 第1章 引言
  •   1.1 卡波氏肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）
  •     1.1.1 KSHV基因组
  •     1.1.2 KSHV生命周期
  •     1.1.3 KSHV病毒基因组的复制
  •     1.1.4 KSHV相关疾病流行病学
  •   1.2 KSHV细菌人工染色体技术（BAC）
  •   1.3 解旋酶（Helicase）
  •     1.3.1 复制解旋酶MCM2-7 复合体
  •     1.3.2 DNA复制解旋酶MCM2-7 复合体的激活过程
  •     1.3.3 DNA复制解旋酶MCM2-7 复合体的翻译后修饰
  •   1.4 宿主蛋白Viperin
  •     1.4.1 Viperin结构域及功能
  •     1.4.2 Viperin抗病毒机制
  •   1.5 研究内容
  • 第2章 材料与方法
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 细胞系
  •     2.1.2 质粒
  •     2.1.3 抗体及试剂
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 RNA干扰
  •     2.2.2 KSHV细菌人工染色体遗传操作
  •     2.2.3 构建i SLK-RGB重组细胞系
  •     2.2.4 质谱分析
  •     2.2.5 免疫共沉淀（co-IP）
  •     2.2.6 蛋白印迹（Western Blot）
  •     2.2.7 免疫荧光（IFA）
  •     2.2.8 KSHV基因组DNA和RNA定量检测
  •     2.2.9 染色质免疫沉淀（Ch IP）
  •     2.2.10 荧光素酶报告基因实验
  •     2.2.11 Click-iT免疫沉淀
  •     2.2.12 蛋白表达和纯化
  •     2.2.13 体外氧化实验
  •     2.2.14 统计分析
  • 第3章 实验结果
  •   3.1 KSHV Helicase和MCM7进化上保守并都与Viperin相互作用
  •     3.1.1 KSHV Helicase和相关蛋白在进化树中的进化关系
  •     3.1.2 KSHV Helicase和MCM7进化上保守性分析
  •     3.1.3 KSHV Helicase（ORF44）对病毒的复制是必须的
  •     3.1.4 KSHV Helicase和MCM7都与Viperin相互作用
  •   3.2 Viperin对于病毒复制是必须的及其蛋白上调机制
  •     3.2.1 Viperin对于KSHV病毒复制是必须的
  •     3.2.2 RTA上调Viperin的表达
  •   3.3 Viperin促进KSHV Helicase甲硫氨酸的氧化
  •   3.4 Viperin诱导的M401的氧化增强KSHV Helicase的稳定性和功能
  •     3.4.1 KSHV Helicase甲硫氨酸位点突变细胞系构建
  •     3.4.2 401 位点甲硫氨酸的氧化增加KSHV Helicase的稳定性
  •     3.4.3 Viperin对于甲硫氨酸氧化增强KSHV Helicase稳定性是必须的
  •     3.4.4 Viperin诱导的M401的甲硫氨酸氧化增强KSHV Helicase功能
  •   3.5 Viperin定位于脂滴对于促进KSHV Helicase甲硫氨酸氧化是必须的
  •   3.6 Viperin诱导的甲硫氨酸的氧化促进MCM7蛋白稳定及DNA复制
  •     3.6.1 Viperin诱导的甲硫氨酸氧化促进MCM7蛋白稳定
  •     3.6.2 Viperin诱导的甲硫氨酸氧化促进MCM7在DNA复制过程中的功能
  •   3.7 Viperin与其他DNA解旋酶相互作用
  •   3.8 Viperin诱导的甲硫氨酸氧化促进RIG-I蛋白的稳定及功能
  •     3.8.1 Viperin诱导的甲硫氨酸氧化促进RIG-I蛋白的稳定
  •     3.8.2 Viperin诱导的甲硫氨酸氧化促进RIG-I蛋白的功能
  •   3.9 Viperin体外催化解旋酶的甲硫氨酸氧化
  • 第4章 实验讨论
  •   4.1 KSHV作为研究同源基因的工具
  •   4.2 Viperin对解旋酶修饰的广谱性
  •   4.3 脂滴对KSHV裂解复制的作用
  •   4.4 氧化还原酶Viperin的底物
  •   4.5 Viperin的抗病毒功能与病毒对Viperin的利用
  • 第5章 实验结论与展望
  •   5.1 实验结论
  •   5.2 实验展望
  • 参考文献
  • 附录1 引物列表
  • 附录2
  • 致谢
  • 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果
  • 专业综述
  •   References

    • 文章来源

    类型: 博士论文

    作者: 董家珍

    导师: 蓝柯

    关键词: 解旋酶,甲硫氨酸氧化,卡波氏肉瘤相关疱疹病毒

    来源: 中国科学院大学(中国科学院上海巴斯德研究所)

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学,生物学

    单位: 中国科学院大学(中国科学院上海巴斯德研究所)

    分类号: Q75

    DOI: 10.27915/d.cnki.gkbsd.2019.000026

    总页数: 133

    文件大小: 5774K

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