高宏丽[1]2004年在《鹅副粘病毒HN和F基因克隆、序列分析及原核表达载体的构建》文中指出鹅副粘病毒（GPMV）是副粘病毒科，副粘病毒亚科，腮腺炎病毒属，APMV-1中的成员，引起鹅副粘病毒病。该病自1997年由扬州大学王永坤教授报道以来，在国内很多地区的鹅群中流行。鹅副粘病毒病是以消化道病变为主要特征的具有高度发病率和死亡率的烈性传染病，给这些地区的养鹅业造成了巨大的经济损失。初步实验表明，GPMV与传统的NDV的致病性不同，并且常规的NDV疫苗不能提供有效的保护。因此从分子生物学水平上对该病原进行研究具有重要的意义。血凝素-神经氨酸酶（HN）糖蛋白和融合（F）糖蛋白是GPMV的两种主要的囊膜糖蛋白。HN糖蛋白具有血凝素和神经氨酸酶两种活性，F糖蛋白的裂解能力是病毒毒力的主要决定因素。本研究根据GenBank发表的GPMVSFO2株及其它NDV全基因序列，借助Oligo4.1软件，分别设计两对和一对引物，分别采用RT-巢式PCR和RT-PCR方法对鹅副粘病毒JS/1/97/Go株的HN基因和F基因进行了体外扩增，扩增出与预期设计大小相符的HN基因和F基因的特异性条带。将扩增出的DNA片段克隆到pMD18-T载体中，转化TG1感受态细胞，经AMP/IPTG/X-gal平板筛选，酶切和PCR鉴定后获得阳性重组质粒。序列测定表明：HN基因全长1716bp，编码571个氨基酸残基，与参考序列比较，核苷酸的同源性为82.1%-98.4%, 推导氨基酸同源性为88.3%-99.5%,有4个糖基化位点,其中3个高度保守。F基因全长为1662bp，编码553个氨基酸残基,与参考序列相比,核苷酸的同源性为84.2%-99.8%,氨基酸同源性为87.7%-99.8%,有6个糖基化位点,其中5个高度保守。F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为112R-R-Q-K-R-F117，与NDV的强毒株特征相符。根据测序结果,利用DNAstar软件预测抗原表位,参考测得的HN基因的序列设计一条引物，扩增HN基因5’端的含有叁个抗原表位的基因片段(命名为HNp),测序结果表明长为606bp,编码201个氨基酸残基,与HN全长基因的相应区域同源性比较,核苷酸和氨基酸残基各有2个变异，但不改变表位预测结果。将HN基因和HNp基因亚克隆到原核表达载体pProEX HTb中，将鉴定为阳性的重组质粒转化到DH5α中。将F基因分别亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1和原核表达载体pET-30a(+)中，将鉴定为阳性的重组质粒转化到TG1中。本实验克隆了JS/1/97/Go株的HN基因和F基因，根据测序结果进行序列分析，并与参考的NDV毒株进行了核苷酸和推导氨基酸的同源性比较，为证实GPMV和传统NDV之间的亲缘关系提供了理论基础，同时预测了F和HN基因的抗原表位，构建了含有GPMV的F基因、HN基因、HNp基因的原核表达载体，为原核表达和进一步研究GPMV的致病性及鉴别诊断提供了分子生物学水平上的理论依据，并为表位疫苗的研究奠定了基础。
杨玉菊[2]2005年在《GPMVF、HN及NP基因的多表达系统与DNA疫苗的研究》文中指出1997 年以来,在我国许多地区爆发了由鹅副粘病毒(Goose Paramyxovirus,GPMV)引起的鹅的烈性传染病。该病是以消化道和呼吸道病变为主要特征,具有高度的发病率和死亡率,给养鹅业带来了严重的危害。目前,临床上对GPMV 感染尚无特效的治疗药物,接种疫苗是预防和控制该病发生的主要手段和途径。应用传统的活疫苗如LaSota、C30 等由于其基因型不同(传统的疫苗属于基因Ⅱ型、Ⅲ型,而GPMV 属于基因Ⅶ型),因而造成疫苗只能起到部分的保护作用。目前应用的油乳灭活苗对该病起到了一定的控制作用,但由于灭活苗在灭活过程中造成抗原表位的缺失或抗原性减弱,而不能产生足够的保护水平,以至于需要重复接种,使用很不方便,并且灭活苗免疫不能产生细胞内源性蛋白,因而不能诱导细胞毒性T 细胞(CTL)的产生,而CTL 是真正有效的免疫效应细胞,在抗病毒中起着重要的作用。随着分子免疫学、分子病毒学和分子生物学等相关技术的发展,如何利用基因工程技术生产基因工程疫苗来预防和控制该病成为一项迫在眉睫的问题。本研究首先通过RT-PCR 技术成功的扩增了GPMV 的叁段主要保护性抗原基因,并进行了克隆、序列的测定与分析。结果表明:(1)GPMV JS/1/97/Go 分离株F 基因由ATG 到TGA共1662 个核苷酸,编码553 个氨基酸残基;有6 个潜在的糖基化位点;F 蛋白裂解位点序列为112R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株的特征;具有基因ⅦNDV 的典型特征,即101 位和121位分别为K(赖氨酸)和V(缬氨酸)两个特征性氨基酸;与其它10 个国内外参考毒株的核苷酸的同源性为83.8%-97.9%,推导氨基酸的同源性为87.3%-97.3%。(2)HN 基因的ORF为1716 个核苷酸,编码571 个氨基酸;有5 个潜在糖基化位点;12 个保守的半胱氨酸(Cys)残基;与其它9 个国内外参考毒株的核苷酸的同源性为82.4%-98.5%,推导氨基酸的同源性为88.4%-98.1%。(3)NP 基因由起始密码子到终止密码子共1470 个核苷酸,编码489 个氨基酸残基,有4 个保守的半胱氨酸残基;与其它9 个国内外参考毒株的核苷酸的同源性为85.2%-98.6%,推导氨基酸的同源性为90.8%-99.6%。本实验首先将克隆到pMD18-T 的NP 基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6P 的多克隆位点中,构建表达GPMV NP 基因的原核表达载体pGEX-6P-NP。接下来将GPMV 的F 和HN分别亚克隆到含有禽痘病毒早/晚启动子LP2EP2的pSY538 载体的EcoRⅠ酶切位点上,然后分别通过SmaⅠ或XbaⅠ酶切位点将带有P11 启动子的LacZ 基因也克隆到此载体上,最后将F 和LacZ 基因、HN 和LacZ 分别克隆到pSY681 载体NotⅠ位点上,从而成功的构建了分别含有GPMV F、HN 基因的重组禽痘病毒转移载体,分别命名为pSY681-F-LacZ 和pSY681-HN-LacZ;为了构建双基因的转移载体,将带有LP2EP2 启动子的F 基因亚克隆到前面已构建好的pSY681-HN-LacZ 载体的XhoⅠ位点上,即得到同时含有F 和HN 的双基因重组禽痘病毒转移载体。最后将GPMV 能诱导宿主产生保护性免疫反应的主要抗原基因F、HN和NP 作为候选基因,以具有CMV 的启动子真核表达载体pcDNA3.1+作为载体,构建了含有以上叁种基因的DNA 疫苗。将pGEX-6P-NP 阳性重组子转染于大肠杆菌BL21 中,经IPTG 诱导,由SDS-PAGE 电
杨志[3]2005年在《GPV与GPMV重组禽痘病毒转移载体和DNA疫苗的构建》文中指出鹅细小病毒(goose parvovirus)和鹅副粘病毒(goose paramyxovirus)分别是小鹅瘟和鹅副粘病毒病的病原。小鹅瘟和鹅副粘病毒病都是养鹅生产中的烈性传染病,发病范围较广。除了小鹅瘟在非洲和美洲还未见报道外,几乎在世界各国均有暴发这两种疫病的报道。近年来,随着规模养鹅数量的增加,这两种疫病的危害性显得越来越突出。疾病暴发时来势迅猛,往往来不及进行有效治疗即造成染病鹅的死亡,而且还有可能造成细菌和真菌的继发性感染。各个品种的鹅均能感染这两种疾病,不仅小鹅易感,大鹅也易感。染病鹅死亡率较高,尤其是10 日龄内的雏鹅死亡率可达100%,给养鹅业生产带来及大的经济损失。雏鹅患病时,这两种疾病的症状类似,基层兽医工作人员和养殖单位经常将两种疾病混淆。目前对这两种疾病尚无有效的治疗方法,仍以预防为主,所以对于防治这两种疫病的疫苗研究工作尤为重要。预防这两种疫病的疫苗目前只是传统的灭活苗和弱毒苗,随着基因工程手段向疫苗研制工作的技术渗透,基因工程疫苗在疫病预防工作方面逐渐成为研究的热点,其中以病毒为载体的重组疫苗和DNA 疫苗尤为突出。这两种疫苗是借助分子生物学手段将外源特异性抗原基因分别重组到病毒活载体和构建到DNA 疫苗表达载体上,在注射到宿主体内后,使外源基因进行高效、持久的表达,诱导机体产生特异性免疫应答,达到预防疾病的作用。这两种疫苗有各自的优点,重组禽痘病毒疫苗研究得相对来说较早,也比较深入,引起免疫应答的效果也比较好;DNA 疫苗虽然还处于研究阶段,但它除了具有常规疫苗的各种优点以外,还具有生产工艺简单、生产成本低廉和安全性高等优点,而且对它的研究还在不断完善,开发潜力十分巨大。DNA 疫苗的众多特点无疑已使其成为继灭活苗、弱毒苗和亚单位苗之后的第叁代疫苗杰出代表。本实验是根据鹅细小病毒和鹅副粘病毒的生物学特点和当前疫苗研究工作的趋势所展开的,总共分为两部分:(1)扩增出鹅细小病毒疫苗株的结构蛋白基因VP3,并构建出重组质粒pcDNA3.1-VP3。然后将含有巨细胞病毒(CMV)启动子PCMV、VP3 基因、BGHpA 叁部分的DNA 片段PCMV-VP3-BGHpA 插入到分别带有鹅副粘病毒囊膜糖蛋白基因HN 和F 的重组质粒pcDNA3.1-F 和pcDNA3.1-HN 上,成功构建出双基因DNA 疫苗重组质粒pcDNA3.1-VP3-F、pcDNA3.1-VP3-HN。(2)将重组质粒pSY538-VP3 上含有启动子LP2EP2和VP3 基因的片段LP2EP2-VP3 插入到重组质粒pSY681-F 和pSY681-HN 中,构建出双基因重组禽痘病毒转移载体pSY681-VP3-F、pSY681-VP3-HN。重组质粒的构建工作是基因工程疫苗研究的前期工作,也是疫苗有效性和可靠性的关键保障。有了外源基因在理论上能够高效表达的可能性,才有可能使后期免疫工作得以顺利进行。一种疫苗能否达到令人满意的免疫效果受到众多条件的限制,为使其能达到令人满意的免疫效果,还需要在实践中逐渐的逐渐摸索不断完善。本实验所构建出的四个双基因重组质粒,为研制预防这两种疫病的基因工程疫苗奠定了基础。
李彤彤[4]2011年在《鹅副粘病毒E01株HN蛋白的表达及其相关免疫效果的初步研究》文中研究指明本研究主要将本实验室分离、鉴定并纯化的鹅源副粘病毒E01株进行了基因组RNA的提取,参考GenBank收录的ZJ1株鹅源副粘病毒全基因组核苷酸序列,在HN基因的ORF上下游设计1对特异性引物HNF1/HNR1,通过RT-PCR方法扩增得到HN基因片段。并将其连接至克隆载体pMD-18T上,得到克隆质粒,命名为T-HN。将编码HN蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列分别与13株国内外NDV毒株进行同源性比较,并绘制系统发育树。结果显示,同源性分别在65.7%-99.0%和84.6%-99.0%。属于基因Ⅶ型NDV。在HNF1/HNR1的5’端进行修饰,分别加入EcoRI和SalI限制性酶切位点得到用于扩增HN基因ORF的第二对引物HNF2/HNR2,以质粒T-HN为模板,PCR扩增得到用于原核表达的HN ORF片段,将其克隆至原核表达载体pET-32a上,构建了原核表达质粒pET-HN,并转化表达菌BL21(DE3)中,通过IPTG的诱导表达,将表达蛋白进行SDS-PAGE检测,用全病毒高免血清进行Western blot检测,出现特异性条带。依照相同方法重新修饰HNF1/HNR1的5’端,分别加入EcoRI和Not I限制性酶切位点得到用于扩增HN基因ORF的第叁对引物HNF3/HNR3,以质粒T-HN为模板,PCR扩增得到用于真核表达的HN ORF片段,将其克隆至真核表达载体pVAXl上’构建了真核表达质粒pVAX-HN,将其转染Vero田胞72h后,进行间接免疫荧光试验,出现特异性绿色荧光,提取阳性转染细胞总RNA,进行RT-PCR扩增,可见一条大小约1.7kb的条带,说明真核表达质粒能够表达HN蛋白。GPMV HN蛋白在原核和真核系统中的成功表达为高效的亚单位基因工程疫苗的研制、新型诊断方法的建立及鹅源副粘病毒基因融合功能的研究奠定基础。为验证HN蛋白与HN基因的DNA疫苗pVAX-HN的免疫效果,本研究还将原核表达的HN蛋白复性产物与重组质粒pVAX-HN同时免疫7日龄SPF鸡,每次免疫前采血,用间接ELISA测定血清中抗体水平。同时设生理盐水对照组和pVAXl空质粒对照组为阴性对照组,减毒活疫苗Lasota为阳性对照组。试验结果表明,两个免疫组叁次免疫后产生的血清抗体显着高于阴性对照组。说明表达产物及DNA疫苗能够刺激机体免疫系统产生免疫反应,该项结果为后续制备鹅源新城疫基因工程疫苗奠定了基础。
藏玉婷[5]2007年在《鹅副粘病毒HN及F基因在昆虫杆状病毒表达系统的表达》文中提出鹅副粘病毒(Goose Paramyxovirus，GPMV)与新城疫病毒(New castle disease virus，NDV)基因核苷酸同源性来看，GPMV与NDV属于同种病毒，GPMV是NDV的一个变异，而不是一个新种病毒，是NDV毒株在水禽上引起发病，且病毒毒力加强。但是，GPMV与传统的NDV又有不同，差异主要在血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)及融合蛋白(Fusion protein，F)上，常规的NDV疫苗不能提供有效的保护，因此从分子生物学水平上对该病进行研究具有重要的意义。HN和F蛋白是GPMV诱导体液免疫的重要靶抗原，在抗病毒免疫中起着重要作用，无疑HN和F基因已成为研制GPMV基因工程苗及免疫监测试剂的首选基因。本试验根据GenBank所发表的HN及F基因的cDNA序列，利用Primer5.0软件，参照昆虫细胞杆状病毒表达系统的质粒图谱，设计引物，以本实验室所保存的pMD18-T-HN及pMD18-T-F阳性质粒为模板扩增出HN及F基因，分别命名为pMD18-T-GPMV-HN及pMD18-T-GPMV-F。将其克隆至昆虫杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A的XhoⅠ和EcoRⅠ之间的多克隆位点上，分别命名为pBlue-GPMV-HN及pBlue-GPMV-F。纯化该重组质粒并与杆状病毒共转染Sf9昆虫细胞，4d后获得重组病毒，名为P1。将经过3轮蚀斑筛选纯化，PCR鉴定获得重组病毒，分别命名为rBv-HN及rBv-F。将重组病毒反复扩毒3次，获得高浓度的重组病毒名为P3，接种Sf9单层细胞上，4d后收获病变细胞，经SDS-PAGE电泳鉴定，表达F蛋白分子量约为60ku，表达HN蛋白分子量约为66ku，与理论值相符。表达产物HN蛋白的Western blot和Dot-ELISA结果表明其可与鸡抗GPMV血清发生特异性抗原反应，证实所表达的HN蛋白有较好的反应原性。本研究将株的HN及F基因利用昆虫杆状病毒表达系统中表达，并获得了HN主要抗原位点基因的表达，对GPMV的基础性研究、预防控制和病毒诊断试剂研制奠定重要的物质基础。
纪巍[6]2009年在《鸭副粘病毒分离鉴定、F基因序列分析及生物学特性研究》文中认为鸭副粘病毒病(Duck Paramyxo Virus Disease)是由鸭副粘病毒(Duck Paramyxo Virus)引起的一种病毒性急性传染病。该病以气管环出血,肺脏弥漫性出血,脾脏肿大为主要特征。鸭副粘病毒属于副粘病毒科(Paramyxoviridae),副粘病毒亚科,腮腺炎病毒属(Rubulavirus)。长期以来,禽1型副粘病毒不感染水禽,水禽即使带毒也不发病。但近年来,该病的流行又呈现出新的特点:高抗体禽群发生该病,禽1型副粘病毒对水禽的致病力逐渐增强,水禽(鹅、鸭、企鹅等)不再仅是禽1型副粘病毒的宿主和储存库,已成为禽1型副粘病毒的易感禽类。其中鹅、鸭的易感性最高,且不同日龄的鹅、鸭均易感,日龄越小,发病率和死亡率越高,半个月内的雏鸭、雏鹅发病率和死亡率最高。近年来,该病在我国呈上升趋势,给我国养鸭业乃至整个养禽业带来巨大的经济损失。2006-2008年在山东地区部分养鸭场出现鸭子大量死亡现象,本实验室从来自潍坊、滨州、肥城、东营、泰安、济南的鸭病料和鸭胚中分离得到六株鸭副粘病毒。应用RT-PCR技术对这六株副粘病毒的F基因扩增后进行序列测定,并与传统疫苗株、标准强毒株F48E9和已发表的24株鸭副粘病毒进行同源性比较、进化树分析,旨在从分子生物学水平阐明山东地区鸭副粘病毒分离株之间的亲缘关系以及与其它地区流行株之间的亲缘关系,为该病的预防和控制提供理论依据。本课题分二部分进行研究。第一部分:一株经鸭胚传递的鸭副粘病毒的分离鉴定及生物学特性研究2008年6月份山东省某种鸭场260日龄的种鸭出现产蛋下降,但未出现死亡,该种鸭群所产种蛋连续3批在孵化至20~25胚龄时出现约10%的死胚,出壳后雏鸭弱雏较多,部分雏鸭出壳后即出现神经症状,表现为头颈扭转、角弓反张、斜颈、左右摇摆、站立不稳、瘫痪等,剖检可见脑膜出血、肺脏出血、十二指肠黏膜弥漫性出血。为确定发病原因,我们对死亡鸭胚、1日龄的病死鸭及出现神经症状的雏鸭进行了病原的分离、鉴定,确定为副粘病毒,命名为SDFCH株,对该分离株的生物学特性进行了研究。毒力测定结果表明该病毒鸡肧平均致死亡时间(MDT)为56.6 h;1日龄SPF鸡脑内接种分离病毒致病指数(ICPI)为1.78;6周龄SPF鸡静脉接种致病指数(IVPI)为2.59。攻毒雏鸭生长缓慢,精神沉郁,剖检可见气管弥漫性出血、肺脏出血、腺胃乳头出血、胰脏出血、十二指肠黏膜弥漫性出血,个别雏鸭脑膜出血。第二部分:鸭副粘病毒山东株F基因克隆与序列分析对2006-2008年从山东省不同地区规模化鸭场采集的疑似鸭副粘病毒病症状的病料进行了鸭副粘病毒的分离鉴定及F基因克隆和序列分析,结果表明F基因的核苷酸序列较稳定,不同地区6株鸭副粘病毒毒株的F基因全基因组序列均由1662bp组成,彼此间核苷酸序列同源性达95.3%～99.8%,亲缘关系密切;与Genbank已发表的鸭副粘病毒参考毒株的同源性介于87.4%~97.8%;与Genbank已发表的鹅副粘病毒参考毒株的同源性介于95.7~98.4%;与传统的疫苗株Lasota株的同源性在87.7%~88.3%之间;与F48E9的同源性在90.3%~91.0%之间。系统进化树分析表明这6株毒株与江苏、黑龙江、广东的鹅副粘病毒毒株和鸭副粘病毒毒株亲缘性较近,属于同一分支。本研究对所测定的6株鸭副粘病毒毒株F基因所对应的氨基酸序列分析表明:6株毒株之间的氨基酸同源性为95.3%~98.0%;与Genbank已发表的鸭源副粘病毒的氨基酸同源性为87.4%~97.5%;与鹅源副粘病毒的氨基酸同源性为96.4%~98.4%。6株毒株与鹅源副粘病毒的亲缘性较近,因此推测鸭副粘病毒是由鹅源副粘病毒进化而来。
舒秀伟[7]2005年在《鸡IL-2基因的克隆、原核表达及对DNA疫苗免疫增强作用的实验性研究》文中进行了进一步梳理根据Sundick 等发表的鸡IL-2 基因(chIL2)序列设计并合成了特异性引物,以经ConA 诱导的鸡脾淋巴细胞提取的总RNA 为模板,用RT-PCR 方法扩增出450bp 的目的片段,并将其克隆到pBluescriptⅡKS(+)载体上,酶切鉴定及序列测定结果表明该基因为鸡IL-2 基因。它包括鸡IL-2 基因的全部开放阅读框,编码由142 个氨基酸组成的蛋白质。与GeneBank 上已知的鸡IL-2 基因相比,除在编码氨基酸的第49 位缺失一个氨基酸外,其他与Broiler、SC、Chenren 和Xiaoshan鸡完全一致,具有较近的亲缘关系;与Kestrel 来航鸡、来航SPF 鸡、Obese、Silky和Xianju 鸡等相比有1~4 个氨基酸的差异。经序列分析表明,该基因是目前发现的唯一有氨基酸缺失的鸡IL-2 基因。将克隆的鸡IL-2 基因亚克隆到GST 融合基因表达载体pGEX-6P-1 的相应位点,构建重组表达载体pGEX-cIL2。将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,用0.1mM 的IPTG 进行诱导,SDS-PAGE 分析表明,在相对分子质量约为40kD (融合蛋白)处有明显的蛋白质表达条带,而未经诱导的pGEX-cIL2 在40 kD 处无条带产生,表达的融合蛋白约占菌体总蛋白的50%左右。结果表明pGEX-cIL2 能够表达GST-chIL2 融合蛋白,其中鸡IL-2 分子量为14kD,与预期的鸡IL-2 成熟蛋白大小一致。以含鸡IL-2 基因的质粒载体为模板,设计一对用于真核表达的引物,扩增出鸡IL-2 基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3 的相应位点,构建了鸡IL-2 基因的真核重组表达质粒pcDNA-cIL2。经酶切、PCR 鉴定及序列测定分析,结果表明所构建的重组质粒为鸡IL-2 基因特异性真核表达质粒。构建的真核表达质粒经纯化后,与表达鹅副粘病毒HN 蛋白的DNA 疫苗共同免疫14 日龄SPF 鸡,14d 后加强免疫,二免后14d 用致死剂量的鹅副粘病毒强毒攻击。结果表明表达质粒pcDNA-cIL2 能够增强鹅副粘病毒HN DNA 疫苗对强毒的攻击,保护率达65%;血凝抑制试验也证实,共注射pcDNA-cIL2 组诱导的HI 抗体较单纯免疫HN DNA 疫苗组高2~3 个滴度。
刘新鑫[8]2008年在《APMV-1 F基因表达及复合间接ELISA方法的建立与应用》文中研究表明禽副粘病毒(APMV)病,是当今危害全球养禽业的重要疫病之一。其病原有九个血清型(APMV 1~9),禽副粘病毒1型只有新城疫病毒(NDV),一般只有鸡和火鸡感染发病。而1997年后我国江苏等地鹅群发生高致病性高死亡率的鹅病,经一系列诊断确定病原体为禽副粘病毒1型,后命名为鹅副粘病毒(GPMV)。现已证实了传统的新城疫病毒(NDV)和鹅副粘病毒(GPMV)已发生明显变异,同时也证实了相同动物来源的APMV-1 F蛋白具有较高的保守性。目前市场上现有的检测NDV抗体水平的试剂盒检测GPMV抗体水平存在一定的误差、漏检等问题。因此本研究选用表达的F蛋白建立了针对GPMV和NDV抗体水平都适用的检测方法,为今后的形成标准化的检测试剂盒奠定基础。首先对国家标准毒株F_(48)E_9 F基因进行了原核表达,诱导产生了大量可溶性F蛋白,具有一定的反应原性。然后根据前期工作所得的GPMV NA-1株F蛋白,建立了检测GPMV抗体水平的间接ELISA方法,经过一系列优化条件,确定最佳包被量为0.21μg/孔,酶标二抗的最佳稀释度为1:1 500。经过初步应用,表明该方法具有敏感性强、重复性好、操作简单等优点。最后利用表达的NDV F_(48)E_9株F蛋白和GPMV NA-1株F蛋白按一定比例混合包被酶标板,研制了能同时检测GPMV和NDV抗体水平的复合间接ELISA方法。最终确定包被总量为0.52μg/孔,两种重组蛋白的比例为1:1,经过临床样本的初步应用,与单个间接ELISA检测方法相比有一定的优势,希望能为今后标准化的检测试剂盒奠定基础,同时也对鸡群和鹅群中APMV-1抗体水平的监测和免疫效力的评价提供重要的应用价值。
张伟[9]2008年在《鹅副粘病毒F基因的克隆、分析及核酸探针检测方法的建立》文中进行了进一步梳理鹅副粘病毒病(Goose Paramyxo Virus Disease)是由鹅副粘病毒(Goose Paramyxo Virus)引起的一种急性、高度接触性传染病。该病以肠道糠麸样溃疡,胰腺、脾脏肿胀且表面有大小不等的灰白色坏死灶为主要特征。鹅副粘病毒属于副粘病毒科(Paramyxoviridae),副粘病毒亚科,腮腺炎病毒属(Rubulavirus)的病毒。由于该病发病急、致死率高,对养禽业的发展构成了严重威胁,所以被世界卫生组织(OIE)列为A类烈性传染病。长期以来,我国普遍采用接种疫苗为主的鹅副粘病毒病综合防制措施,使的该病得以控制,但近年来,该病的流行又呈现出新的特点:高抗体禽群发生该病,禽1型副粘病毒对水禽的致病力逐渐增强,水禽(鹅、鸭、企鹅等)不仅是禽1型副粘病毒的宿主和储存库,而且成为禽1型副粘病毒的易感禽类。其中鹅的易感性最高,且不同日龄的鹅均易感,日龄越小,发病率和死亡率越高,半个月内的雏鹅发病率和死亡率最高,高达100%。近年来,该病在我国呈上升趋势,给我国养鹅业乃至整个养禽业带来巨大的经济损失。在对2005年从山东省梁山县某鹅场分离的一株鹅副粘病毒野毒株(暂名为LS-1株)进行生物学特性研究的基础上,扩增其F基因,并与传统疫苗株、标准强毒株F48E9和已发表的江苏分离株进行同源性比较、进化树分析,旨在从分子生物学水平阐明梁山地区与其它地区流行株之间的亲缘关系,为该病的预防和控制提供理论依据。本课题分为叁部分进行研究。第一部分:鹅副粘病毒LS-1株的分离鉴定及生物学特性研究该研究从梁山县一例以肠道糠麸样溃疡,胰腺、脾脏肿胀且表面有大小不等的灰白色坏死灶为主要特征的病死鹅中分离到一株病毒,血凝试验和血凝抑制试验表明该分离株具有血凝性,且其血凝特性能被新城疫病毒标准阳性血清抑制,而不被H9N2亚型禽流感病毒标准阳性血清所抑制。毒力测定结果表明该病毒鸡肧平均致死亡时间(MDT)为39.5h;1日龄SPF鸡脑内接种分离病毒致病指数为1.76;6周龄SPF鸡静脉接种致病指数(IVPI)为2.42。动物回归实验结果表明攻毒鹅表现典型的临床症状和病理变化。第二部分:鹅副粘病毒LS-1株F基因的克隆与序列分析根据GenBank中已发表的鹅副粘病毒F基因序列设计合成两对特异性引物,利用RT-PCR技术扩增出鹅副粘病毒LS-1株F基因全序列,与pMD-18T载体连接后进行序列测定、分析。结果表明:鹅副粘病毒LS-1株F基因核苷酸长度为1653bp,编码551个氨基酸,有6个糖基化位点,其裂解位点的氨基酸序列为112-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Phe-117,与已发表的强毒株裂解位点的氨基酸序列相符,从分子水平上表明鹅副粘病毒山东分离株(LS-1)为一强毒株。该毒株F基因与目前已发表的鹅副粘病毒F基因核苷酸同源性在87.0~98.4%之间,推导的氨基酸序列同源性在87.0%～98.5%之间;与传统疫苗株LaSota、强毒株F48E9的核苷酸和氨基酸同源性均分别为84.3%和86.8%。第叁部分:鹅副粘病毒核酸探针检测方法的建立与应用根据GenBank中已发表的鹅副粘病毒F基因序列,设计合成一对引物,利用RT-PCR扩增出一条与目的片断大小一致,约856bp的基因片段,回收并纯化此PCR产物。用随机引物法合成cDNA,用地高辛标记,建立鹅副粘病毒核酸探针检测方法。该探针能与鹅副粘病毒核酸发生特异性杂交,而与H9N2亚型禽流感病毒、鹅细小病毒、大肠杆菌等核酸杂交均为阴性,且最低检出限量为3pg/μL。疑似病例检测结果表明,气管、肺脏、脾脏、肝脏均可检测出鹅副粘病毒,其中以气管的检出率最高。
周丽[10]2007年在《鹅副粘病毒NP蛋白ELISA抗体消长规律及其与HI抗体的相关性》文中研究说明鹅副粘病毒病又称鹅源新城疫，是由鹅副粘病毒(Goose Paramyxovirus，GPMV)引起的一种急性、烈性传染病。该病以鹅消化道和呼吸道病变为主要特征，具有高度的发病率和死亡率，给养鹅业带来了严重的危害。由于目前我国对鹅副粘病毒病的危害性缺乏足够重视，尚缺乏完善的疾病诊断、监测技术。面对该病在我国有逐步扩大的趋势，开展鹅副粘病毒病的诊断和检测技术的研究迫在眉睫。在血清学的临床检测方面，目前已经有多次关于鸡新城疫ELISA与HI检测比较的报道，然而对于鹅副粘病毒病却未见这方面的报导。本研究以NP蛋白为检测抗原对鹅副粘病毒病进行了ELISA与HI检测抗体相关性的比较。GPMV属于副粘病毒科，副粘病毒亚科，腮腺炎病毒属，禽副粘病毒(Avian Paramyxovirus APMV)Ⅰ型中的成员，具有基因Ⅶ型新城疫(NDV)的典型特征。NP蛋白是鹅副粘病毒核衣壳的主要结构蛋白，在自然感染或者疫苗免疫后的动物中都可以产生针对NP蛋白的抗体，具有重要的诊断价值。本研究通过原核表达载体pET-30a，成功构建了重组质粒pET-30a-NP，并通过大肠杆菌表达系统原核表达GPMV-NP蛋白。以纯化的NP蛋白为包被抗原建立了ELISA检测方法，通过对各个反应条件的优化，最终确定了最佳反应条件。本实验选取50只来源于肇东非疫区的鹅，随机分为A、B、C、D 4组。A组为非免疫对照组；B组为免疫组；C组为免疫攻毒组；D组为人工感染组。分别在第一次免疫前、免疫后及攻毒后第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、18周采血。对上述血清进行ELISA定量检测及HI抗体的检测。比较各组鹅群NP蛋白ELISA抗体和HI抗体的相关性，分别建立了相关的回归方程。免疫组：ELISA=0.1981 HI+0.0541(r=0.9134，P＜0.05)；免疫攻毒组：ELISA=0.1807 HI-0.0744 (r=0.8240，P＜0.05)；人工感染组：ELISA=0.2728 HI-0.4498(r=0.8795，P＜0.05)。对各组ELISA与HI的敏感性进行比较的结果显示，ELISA检测敏感性均高于HI方法。结果表明：GPMV两种检测方法所测得抗体之间呈显着相关，该结果为ELISA检测方法取代HI试验提供了理论依据。本研究对鹅副粘病毒两种检测方法作了初步实验室探索，而在实际临床检测中，能否采用NP蛋白为包被抗原的ELISA检测方法代替传统的HI试验还有待大量动物实验的验证。从而为深入研究GPMV的临床检测提供一定依据。
参考文献：
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[2]. GPMVF、HN及NP基因的多表达系统与DNA疫苗的研究[D]. 杨玉菊. 东北农业大学. 2005
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[4]. 鹅副粘病毒E01株HN蛋白的表达及其相关免疫效果的初步研究[D]. 李彤彤. 南京农业大学. 2011
[5]. 鹅副粘病毒HN及F基因在昆虫杆状病毒表达系统的表达[D]. 藏玉婷. 东北农业大学. 2007
[6]. 鸭副粘病毒分离鉴定、F基因序列分析及生物学特性研究[D]. 纪巍. 山东农业大学. 2009
[7]. 鸡IL-2基因的克隆、原核表达及对DNA疫苗免疫增强作用的实验性研究[D]. 舒秀伟. 吉林大学. 2005
[8]. APMV-1 F基因表达及复合间接ELISA方法的建立与应用[D]. 刘新鑫. 吉林大学. 2008
[9]. 鹅副粘病毒F基因的克隆、分析及核酸探针检测方法的建立[D]. 张伟. 山东农业大学. 2008
[10]. 鹅副粘病毒NP蛋白ELISA抗体消长规律及其与HI抗体的相关性[D]. 周丽. 东北农业大学. 2007
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