肝螺杆菌LAMP快速检测方法的建立与初步应用及其小鼠感染模型的构建

论文摘要

肝螺杆菌（Helicobacter hepaticus,Hhepaticus）是一种革兰氏阴性、微需氧、螺旋弯曲状细菌,呈世界性分布,可感染多种哺乳动物,主要以隐性感染方式定殖于动物消化道,可引起慢性肝炎、盲肠结肠炎、胆管炎甚至诱发肝癌、肝胆管腺瘤、结肠癌等病变。不仅严重危害动物健康,影响动物试验、干扰实验结果,还可能危及公共卫生安全,是啮齿类实验动物重要的致病菌之一。建立快速、精准、适宜推广的肝螺杆菌检测体系,将有助于实验动物微生物质量控制以及实验动物标准化和规范化进程的推进。研究发现,在人类肝炎、肝癌等相关临床标本中可检测到肝螺杆菌特异性16S rRNA序列,肝螺杆菌感染小鼠引起的疾病进程、组织病理特征与人类慢性肝病和肠炎非常相似,提示肝螺杆菌与人类消化道疾病可能相关。因此,构建肝螺杆菌感染小鼠模型将有助于深入探索人类相关疾病致病机制,为相关研究及特异性药物筛选提供工具。鉴于肝螺杆菌在人工培养基中难以生长,本研究建立了肝螺杆菌LAMP快速检测方法,并采用该方法对上海市实验动物生产许可证单位的大鼠、小鼠开展了流行病学调查。通过人工感染方式构建了肝螺杆菌感染BALB/c小鼠模型,从免疫学、组织病理学、肠道菌群结构等角度研究肝螺杆菌感染引起的宿主损伤。1肝螺杆菌LAMP快速检测方法的建立鞭毛蛋白是肝螺杆菌重要的毒力因子,具有高度的保守性。本文根据H hepaticus的fal B基因保守区域设计一组特异性引物,包含一对外引物F3、B3,一对内引物FIP、BIP和一条环引物LB。经过条件优化、特异性和敏感性分析,建立了肝螺杆菌LAMP快速检测方法。结果显示,建立的LAMP扩增方法特异性良好,仅能检测出Hhepaticus,其他常见细菌未见特异性扩增。检出的最低模板量为86.9 fg/μL,是普通PCR所需模板量的1/10。与现有技术相比,该方法不受培养条件和检测仪器的限制,具备简便、快捷、特异、灵敏的优势,适宜基层的推广应用,适用于实验动物、相关动物源性生物制品、细菌培养物及实验动物环境中H hepaticus的检测,为Hhepaticus的快速检测和实验动物质量控制提供了技术支撑。2上海地区实验大鼠、小鼠肝螺杆菌LAMP检测与分析采用建立的LAMP方法对近年来上海市实验动物生产许可证单位实验大鼠、小鼠进行H hepaticus检测。共检测1492只动物（清洁级大鼠54只,SPF级大鼠200只,清洁级小鼠267只,SPF级小鼠971只）,且受检动物均饲养于屏障系统。结果显示,2014、2016、2017年所涉动物设施均存在不同程度的污染,清洁级动物所在设施污染率分别为75.00%、75.00%、40.00%,SPF级动物所在设施污染率分别为66.67%、23.08%、50.00%。动物的总阳性率为8.65%,2014～2017年分别为11.85%、3.51%、10.71%。大鼠总阳性率为5.91%,2014～2017年分别为2.78%、3.85%、13.24%,清洁级、SPF级大鼠的阳性率分别为9.26%、5.00%;小鼠总阳性率为9.21%,2014～2017年分别为15.69%、3.44%、10.42%,清洁级、SPF级小鼠的阳性率分别为8.24%、9.47%。对阳性动物按不同品系进一步归类,结果显示阳性率相对较高的品系有基因工程、BALB/c、ICR、KM等。总体而言,大鼠、小鼠均有不同程度的阳性检出率,不同年份、不同级别间差异不大,未见明显规律。调查结果为进一步补充、完善啮齿类实验动物螺杆菌流行病学资料和我国实验动物的微生物学质量控制提供了参考和数据。3肝螺杆菌感染BALB/c小鼠模型的建立及评价通过灌胃、腹腔注射接种方式造模,每只小鼠接种0.2 mL标准菌株悬液（1×109 CFU/mL）,连续接种3次,每次间隔48h。结果显示,H.hepaticus感染可引起小鼠体重显著下降、白细胞显著升高（P<0.01）。于造模后2w,4w,6w,8w,12w,16w,20w,24w采集血液和脏器标本,测定小鼠体重、白细胞、血清ALT和AST水平变化,检测细菌在体内的定殖分布规律,并对宿主细胞因子表达水平以及组织病理学进行分析。感染小鼠血清AST（P<0.001）和ALT（P<0.01）水平显著升高,且呈持续上升趋势。组织分布检测结果表明,接种后2w所有小鼠盲肠均能检测到H.hepaticus;接种后6w肝脏首次检测出阳性,接种后8w肝脏呈现100%阳性;灌胃组和腹腔注射组胃组织分别于接种后8 w和16 w可检测到阳性;其余组织均未能检测出阳性。由此可见Hhepaticus进入小鼠体内最先在肠道定殖,随着感染时间的延长可在肝脏、胃等组织中定殖。组织病理学分析显示,感染鼠肝细胞可见明显空泡变性、脂肪变性、灶性坏死、炎性细胞浸润,胃部可见黏膜上皮细胞呈乳头状增生增厚,不同部位肠道组织可见水肿、充血、黏膜层变性、坏死、糜烂,炎性细胞浸润,随着感染时间的延长病变程度增加,其它组织未见明显病变。细胞因子检测结果显示,感染组小鼠IL-6、TNF-α、IL-1β表达水平显著上调（P<0.001）,表明H.hepaticus可促进BALB/c小鼠肝组织细胞炎性因子表达。Hhepaticus感染小鼠模型的构建为进一步研究其致病机制以及人类相关疾病提供了工具。4肝螺杆菌感染BALB/c小鼠肠道菌群结构分析根据细菌16S rDNA基因V4-V5可变区片段设计引物接头进行PCR扩增,采用Illumina高通量测序技术对H hepaticus感染小鼠的肠道菌群特征进行运算分类单位（operational taxonomic unit,OTU）聚类、多样性、群落结构组成及差异性分析以及代谢功能预测等。结果表明,实验组动物的肠道菌群多样性显著低于对照组（P<0.01）。实验组和对照组OTU数目分别为89和209,两组共有73个OTU。在门水平,实验组和对照组菌群序列均分属于7个菌门,两组样本中拟杆菌门（Bacteroidetes）和厚壁菌门（Firmicutes）均为丰度最高的两个门。两组样本共有5个门重叠,又分别有2个独有的门,实验组独有疣微菌门（Verrucomicrobia）和 Epsilonbacteraeota,对照组独有软壁菌门（Tenericutes）和蓝藻菌门（Cyanobacteria）。在属水平,两组样本共检测到74个属,实验组样本隶属45个属,对照组样本隶属64个属,其中两组共有35个属,实验组独有10个属,对照组独有29个属,实验组拟杆菌属、Muribaculaceae、毛螺菌属、布劳特菌属（Blautia）、Rumini clostridium等含量相对较高。线性判别分析（linear discriminant analysis Effect Size,LEfSe）显示,在门的水平仅Epsilonbacteraeota存在显著性差异;在属的水平有31个属存在显著性差异,实验组拟杆菌属、梭菌属、黄杆菌属、瘤胃球菌属、克雷伯菌属、肠球菌属和螺杆菌属等的丰度显著高于对照组,而毛螺菌科NK4A136group、颤螺旋菌属、普雷沃菌属、肠杆菌属、理研菌科RC9gutgroup丰度则显著低于对照组。上述结果表明H.hepaticus感染可引起小鼠肠道菌群的群落丰富度和多样性明显降低,为揭示H hepaticus与宿主肠道菌群的调控机制提供了资料。

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摘要

Abstract

符号说明

前言

第一部分文献综述

第一章肝螺杆菌研究进展

1 病原特性

1.1 分类学

1.2 形态特征

1.3 培养特性

2 流行病学

3 致病机理

3.1 鞭毛蛋白

3.2 尿素酶

3.3 黏附素

3.4 细胞致死性膨胀毒素

3.5 毒力岛

4 致病性

4.1 肝脏疾病

4.2 肠道疾病

4.3 与人类疾病的关联

4.4 对试验的干扰

5 检测方法

5.1 分离培养法

5.2 组织化学法

5.3 血清学方法

5.4 PCR方法

6 预防控制

第二章国内外实验大小鼠细菌学检测项目与检测方法的评价

1 检测内容（项目）

2 检测方法

3 结语

第二部分试验研究

第一章肝螺杆菌LAMP快速检测方法的建立

1 材料

1.1 试验菌株

1.2 主要试剂及仪器

2 方法

2.1 模板制备

2.2 引物设计与合成

2.3 LAMP检测体系建立与优化

2.4 结果判定

2.5 LAMP特异性检测

2.6 LAMP灵敏度检测

2.7 临床应用验证

3 结果

3.1 LAMP检测方法的建立

3.2 LAMP特异性检测

3.3 LAMP灵敏度检测

3.4 临床应用验证结果

4 讨论

第二章上海地区实验大鼠、小鼠肝螺杆菌LAMP检测与分析

1 材料

1.1 样品来源

1.2 主要试剂

2 方法

2.1 样品处理

2.2 LAMP检测

3 结果

3.1 设施污染分析

3.2 病原检测结果分析

4 讨论

第三章肝螺杆菌感染BALB/c小鼠模型的建立及评价

1 材料

1.1 实验动物

1.2 菌株

1.3 主要试剂

1.4 主要仪器

1.5 培养基配制

2 方法

2.1 菌悬液制备

2.2 小鼠H.hepaticus感染模型的建立

2.3 菌株分离与鉴定

2.4 血液生化指标检测

2.5 细菌组织分布检测

2.6 组织病理学检查

2.7 肝组织相关细胞因子表达检测

3 结果

3.1 小鼠体重、精神、粪便状况检查

3.2 细菌分离与鉴定

3.3 血液白细胞数检查

3.4 血液生化指标检测

3.5 组织分布检测

3.6 组织病理学观察

3.7 细胞因子表达水平检测

4 讨论

第四部分肝螺杆菌感染BALB/c小鼠肠道菌群结构分析

1 材料与方法

1.1 实验动物

1.2 主要试剂

1.3 主要仪器

2 方法

2.1 取材

2.2 DNA抽提

2.3 PCR扩增

2.4 文库构建

2.5 高通量测序

2.6 生物信息学分析

3 结果

3.1 多样性分析

3.2 细菌群落结构分析

3.3 物种丰度差异性分析

3.4 肠道菌群定量PCR检测

3.5 代谢功能预测分析

4 讨论

参考文献

全文结论

致谢

攻读学位期间发表的学术论文、申请专利

文章来源

类型: 博士论文

作者: 冯洁

导师: 高崧,高诚

关键词: 肝螺杆菌,环介导等温扩增,检测,小鼠,模型

来源: 扬州大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 扬州大学

分类号: S852.61

DOI: 10.27441/d.cnki.gyzdu.2019.001870

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肝螺杆菌LAMP快速检测方法的建立与初步应用及其小鼠感染模型的构建

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