星星草PutACBP1基因的克隆及其功能分析

星星草PutACBP1基因的克隆及其功能分析

论文摘要

酰基辅酶A结合蛋白(Acyl-CoA-bindingproteins,ACBPs)是一类脂类载体蛋白,具有结合和运输脂类物质的功能,在植物生长发育和逆境(低温、氧化、干旱和重金属)应答调控过程中发挥了重要作用。但其在植物盐碱胁迫应答中的作用未见报道。星星草(Puccinellia tenuiflora 是一种单子叶禾本科盐生植物,是研究植物盐碱应答机制的理想模式植物。本研究,利用分子遗传学技术从星星草中克隆到PutACBP1基因,其开放阅读框为981 bp,编码326个氨基酸。PutACBPl是ACBP家族Class II亚族的成员之一,含有一个ACB结构域和Ankyrin结构域。荧光定量PCR分析表明,PutACBP1基因在星星草根、茎、叶、叶鞘、花、穗和种子均有表达,在叶中的表达量最高,在茎中表达量最低。在逆境(200 mmol/L NaCl、100 mmol/L NaHCO3、75 mmol/L Na2C03 胁迫、160 μmol/L CdCl2、10 mmol/L H2O2 和 4℃)胁迫时,根和叶中的PutACBP1都受诱导表达。这暗示着PutACBP1可能参与了盐碱、氧化、重金属和低温胁迫的应答过程。烟草(Nicotiana tabacum L.)叶片细胞和拟南芥(Arabidopsis thaliana)叶片细胞中定位分析表明,正常条件下PutACBP1定位于在细胞质。通过PutACBP1基因原核表达体系,诱导并纯化到(His)6-PutACBP1融合蛋白,利用磷脂结合实验初步证实了 PutACBP1具有与磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine,PC)结合的能力。通过构建pBI121-PutACBP1重组质粒,并利用农杆菌侵染法分别获得PutACBP1过表达拟南芥植株。对转PutACBP1基因拟南芥植株的耐盐性分析表明,在100 mmol/L和125 mmol/L NaCl胁迫下,过表达PutACBP1基因拟南芥的根长和鲜重都优于野生型拟南芥。拟南芥同源基因AtACBP2突变体植株(SALK-023077)的耐盐性分析表明,在100 mmol/L和125 mmol/L NaCl胁迫下,突变体拟南芥植株的根长和鲜重都低于野生型拟南芥。综上所述,在逆境应答过程中,PutACBP1对于植物盐胁迫应答具有正调控作用。同时PutACBP1可能通过与磷脂酰胆碱结合调控其运输到质膜,参与植物的脂类代谢。这些结果为深入研究星星草PuACBP1基因盐碱应答分子调控机理提供了新的证据。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 1 绪论
  •   1.1 盐碱胁迫对植物生长的影响
  •   1.2 星星草盐碱应答机制的研究进展
  •     1.2.1 星星草盐碱胁迫应答的生态生理学研究
  •     1.2.2 星星草盐碱胁迫应答的蛋白质组学研究
  •     1.2.3 星星草盐碱胁迫应答的分子生物学机制
  •   1.3 酰基辅酶A结合蛋白研究
  •     1.3.1 植物ACBP蛋白家族成员组成
  •     1.3.2 植物ACBP的蛋白质结构特征
  •     1.3.3 植物ACBPs与酰基辅酶A酯和磷脂的结合关系
  •     1.3.4 植物ACBPs亚细胞定位情况
  •     1.3.5 植物ACBPs的组织表达特性
  •     1.3.6 ACBPs在植物生长发育中的作用
  •     1.3.7 ACBPs在植物胁迫应答中的作用
  •   1.4 研究目的及意义
  • 2 材料与方法
  •   2.1 植物材料培养及胁迫处理
  •   2.2 PutACBP1基因的搜索及克隆
  •     2.2.1 PutACBP1基因的搜索
  •     2.2.2 PutACBP1基因的克隆
  •   2.3 生物信息学及系统进化分析
  •   2.4 PutACBP1基因表达分析
  •   2.5 PutACBP1在真核细胞中的定位
  •     2.5.1 植物表达载体pBI121-PutACBP1-GFP的构建
  •     2.5.2 植物拟南芥中的表达
  •     2.5.3 农杆菌介导的瞬时表达
  • 6-PutACBP1纯化和结合磷脂实验'>  2.6 重组蛋白(His)6-PutACBP1纯化和结合磷脂实验
  •     2.6.1 原核表达载体的构建
  •     2.6.2 目的蛋白诱导表达及纯化
  •     2.6.3 目的蛋白体外与磷脂结合
  •   2.7 转PutACBP1基因拟南芥的抗性分析
  •     2.7.1 植物表达载体的构建
  •     2.7.2 转基因拟南芥和突变体植株的鉴定
  •     2.7.3 转基因拟南芥植株和突变体植株的抗逆分析
  • 3 结果与分析
  •   3.1 星星草PutACBP1基因克隆与生物信息学分析
  •     3.1.1 PutACBP1基因的克隆
  •     3.1.2 PutACBP1同源蛋白的氨基酸序列比对及系统进化树分析
  •   3.2 星星草PutACBP1基因的表达特征
  •   3.3 星星草PutACBP1蛋白亚细胞定位
  •     3.3.1 亚细胞定位载体的获得与验证
  •     3.3.2 星星草PutACBP1在烟草和拟南芥中的定位
  •   3.4 星星草PutACBP1磷脂结合分析
  •     3.4.1 原核表达载体的构建与鉴定
  •     3.4.2 重组蛋白(His)6-PutACBP1在体外与磷脂结合分析
  •   3.5 星星草PutACBP1基因在拟南芥中的抗性分析
  •     3.5.1 植物表达载体的构建和鉴定
  •     3.5.2 转PutACBP1基因拟南芥和突变体atacbp2植株的检测
  •     3.5.3 转PutACBP1基因拟南芥和突变体atacbp2的抗逆性分析
  • 4 讨论
  •   4.1 星星草PutACBP1基因的特性
  •   4.2 星星草PutACBP1定位于细胞质
  •   4.3 星星草PutACBP1特异性结合磷脂酰胆碱
  •   4.4 星星草PutACBP1响应非生物胁迫
  •   4.5 转PutACBP1基因拟南芥提高植物的耐盐性
  • 5 结论
  • 参考文献
  • 攻读学位期间发表的学术论文
  • 致谢
  • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 王思竹

    导师: 戴绍军

    关键词: 星星草,酰基辅酶结合蛋白,胁迫,功能

    来源: 东北林业大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学,生物学

    单位: 东北林业大学

    分类号: Q943.2

    DOI: 10.27009/d.cnki.gdblu.2019.000630

    总页数: 67

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