丁向彬[1]2008年在《牛体细胞核移植胚胎表观遗传修饰研究》文中认为体细胞核移植的成功说明了高度分化的细胞仍具有支持发育的全能性,卵母细胞胞质中存在着将分化体细胞重编程至多能胚胎细胞状态的全部因子。但是,体细胞核移植的成功率却非常低,而且克隆动物存在不同程度的发育缺陷。目前普遍认为,体细胞核移植的低成功率以及发育异常和供体细胞核的不完全表观遗传重编程有关。DNA甲基化和组蛋白乙酰化是哺乳动物主要的表观遗传修饰形式,是调节基因组功能的重要手段,在胚胎的正常发育过程中具有显着的调控作用。本文对牛体外受精(IVF)胚胎和体细胞核移植(SCNT)胚胎附植前各个发育阶段的DNA甲基化和组蛋白乙酰化状态进行分析,找出体细胞克隆胚胎在基因组甲基化和组蛋白乙酰化水平上与IVF胚胎的差异,研究表观遗传状态对克隆胚体外发育能力的影响。1.研究卵母细胞成熟培养液中添加表皮生长因子(EGF)和胰岛素(Insulin)对其体外发育的影响,精子的不同处理方法对卵泡卵母细胞体外受精的影响以及细胞共培养系统对体外受精胚胎体外发育的影响。结果表明,成熟培养液中添加30 ng/mL EGF可以显着提高卵母细胞的成熟率和受精后的卵裂率;精子经上浮法处理后可以得到较高的卵裂率和囊胚发育率;输卵管上皮细胞共培养可以显着提高受精后的囊胚发育率,可以用于牛IVF胚胎的体外培养。2.探讨了不同激活方法对牛核移植胚胎激活效果和体外发育的影响,以及细胞共培养体系对牛体细胞核移植胚胎体外发育的影响。结果表明,5μmol/L离子霉素联合2mmol/L 6-DMAP激活牛核移植胚胎的效果比较好,可以得到较高的卵裂率和囊胚发育率;输卵管上皮细胞饲养层共培养可以显着提高重构胚的囊胚发育率,比较适合作为体细胞核移植胚胎发育的共培养体系。3.采用免疫荧光染色技术,对牛IVF胚胎和SCNT胚胎附植前各个发育阶段的DNA甲基化和组蛋白乙酰化状态进行检测,研究克隆胚胎在基因组甲基化和组蛋白乙酰化水平上与IVF胚胎的差异。结果表明,克隆胚胎各个发育阶段DNA甲基化水平均高于体外受精胚胎,其中2-细胞到桑椹胚阶段甲基化水平显着高于IVF胚胎,从头甲基化时间提前;克隆胚胎4-细胞到囊胚阶段乙酰化水平低于体外受精胚胎,其中8-细胞阶段乙酰化水平显着低于体外受精胚胎。与体外受精胚胎相比,牛核移植胚胎附植前各阶段存在异常的DNA甲基化和组蛋白乙酰化模式。4.用DNA甲基化酶抑制剂(5-aza-dC)处理牛供体细胞和克隆胚胎,探讨DNA甲基化水平变化与克隆胚胎体外发育之间的关系。结果表明,低浓度的5-aza-dC(20nM,72h)处理供体细胞或者重构胚不能显着提高克隆胚胎的体外发育率,对克隆胚的表观遗传状态没有明显影响;而供体细胞和重构胚均用低浓度5-aza-dC(20nM,72h)处理可以显着提高囊胚发育率和囊胚细胞数,2-细胞阶段DNA甲基化水平降低,8-细胞阶段的DNA甲基化水平显着降低且与IVF胚胎相比差异不再显着,但组蛋白乙酰化水平没有明显改变。说明克隆胚胎DNA甲基化水平影响其体外发育,降低2-细胞和8-细胞阶段的DNA甲基化水平可以提高克隆胚胎的体外发育能力。5.用组蛋白去乙酰化酶抑制剂(TSA)处理牛供体细胞和克隆胚胎,探讨组蛋白乙酰化变化与克隆胚胎体外发育的关系。结果表明,供体细胞经50nM TSA处理12h可以显着提高克隆胚胎的囊胚发育率,而且2-细胞阶段的组蛋白乙酰化水平升高;TSA处理重构胚不能显着提高克隆胚胎的体外发育率,对重构胚的表观遗传状态没有显着影响;供体细胞和重构胚均用低浓度TSA(50nM,12h)处理可以显着提高克隆胚胎的囊胚发育率,8-细胞阶段的组蛋白乙酰化水平显着增加且与IVF胚胎相比差异不再显着,但TSA处理对DNA甲基化水平没有明显影响。说明克隆胚胎组蛋白乙酰化水平影响其体外发育,增加2-细胞和8-细胞阶段组蛋白乙酰化水平可以提高克隆胚胎的体外发育能力。6.联合应用5-aza-dC和TSA处理牛供体细胞和重构胚,研究两种试剂联合处理对重构胚发育的影响,以及对重构胚甲基化水平和乙酰化水平的影响。结果表明,5-aza-dC(20nM, 72h)联合TSA(50nM, 12h)处理供体细胞和重构胚可以更明显的提高克隆胚胎的体外发育能力,联合处理不但显着降低了2-细胞和8-细胞阶段DNA甲基化水平,而且显着增加了组蛋白的乙酰化水平,从而使克隆胚附植前各发育阶段的表观遗传状态更接近与体外受精胚胎。说明异常的DNA甲基化和组蛋白乙酰化模式不利于克隆胚的体外发育,消除这种异常可以提高克隆胚的体外发育能力。进一步的实验表明,5-aza-dC和TSA对核移植胚胎体外发育的影响没有供体细胞特异性。
金仁桃[2]2004年在《影响克隆胚体外发育及移植的因素研究》文中指出本试验以波尔山羊耳成纤维细胞为供体，分别以牛、羊、兔的卵母细胞为受体进行体细胞核移植，构建了山羊-兔、山羊-牛和山羊-山羊叁种重构胚。研究了不同的胞质环境对重构胚体外发育的影响与核移植中的胞质效应，并对异种克隆胚胎采用了去透明带移植和配种后再移植的方法，探讨移植方法和妊娠因子对异种克隆胚胎在受体动物体内发育的影响，旨在为解决异种克隆胚移植不易着床发育的难题和为提高动物克隆效率提供理论依据。试验获得了如下结果：1．以山羊耳成纤维细胞为供体，以牛、羊、兔卵母细胞做为胞质受体构建重构胚，并经体外培养，发现不同的胞质受体均能支持重构胚的早期发育，但受体胞质对重构卵的重构胚早期发育速度和卵裂率均有显着影响。其中山羊-牛和山羊-兔重构卵的融合率分别为59.91%和74.10%，重构胚的卵裂率分别为57.48%和72.57%，囊胚率分别为9.59%和18.06%；山羊-兔和山羊-山羊重构卵的融合率分别是60.01%和74.10%，重构胚的卵裂率分别是56.68%和72.57%，囊胚率分别是11.76%和 18.06%。各组数据间差异显着（p<0.05）。2.山羊-兔和山羊-牛两种异种克隆胚的体外早期发育速度与山羊-山羊同种克隆胚及山羊的超排胚胎相比，以山羊-兔异种克隆胚的发育速度最快，牛的最慢，山羊-山羊同种克隆胚及山羊超排胚胎的次之。此外，山羊-兔异种克隆胚、山羊-山羊同种克隆胚和正常受精胚的囊胚期卵裂球数目也存在显着差异（86±4.09 vs 105±3.26 vs120±4.05，p<0.05）。3．经对超排获得的山羊受精胚、山羊同种克隆胚和羊-兔异种克隆胚的囊胚期胚胎染色体分析表明，叁种来源的胚胎其染色体数目均为60条，且所有常染色体均为端部着丝点染色体，X染色体为第二大的端部着丝点染色体，说明山羊同种克隆胚和山羊-兔异种克隆胚均为山羊的核型，是供体细胞核在不同胞质中的重新编程的结果。4.不同融合操作及培养密度对于羊-兔重构胚的早期发育速度及卵裂率均有影响。其中再融合卵（RFO）与融合激活卵（FAO）共培养与分滴培养其融合率分别为74.88和60.44%，重构胚的卵裂率分别为72.04%和56.79%，囊胚率分别为20.69%和8.70%，各组数据间差异显着（P<0.05）。而且共培养重构胚的发育速度也要明显快于分滴培养。而不同的培养密度（15枚/100μl和5枚/100μl）对于重构胚的卵裂率没有显着影响。其融合率分别为75.00%和74.04%，卵裂率分别为72.22%和71.43%，囊胚率分别为20.00%和18.18%，各组数据间差异不显着（P>0.05）。但密度大组重构
胡广卫[3]2009年在《5-Aza-dC对牛体细胞核移植胚早期发育及其甲基化水平的影响》文中研究表明自1996年体细胞克隆绵羊“多莉”成功诞生以来,多种哺乳动物都成功的得到体细胞克隆后代。但体细胞核移植的效率却一直没有显着的提高,主要原因是供体细胞核在受体卵胞质中不能完全被重编程。DNA甲基化是哺乳动物主要的表观遗传修饰形式,是调节基因组功能的重要手段。在体细胞核移植胚胎早期发育中,8-细胞前DNA甲基化程度普遍高于正常受精胚胎。这种甲基化水平的异常可能是导致体细胞克隆发育异常的一个重要原因。本论文系统研究了牛体细胞克隆胚早期发育过程中DNA甲基化模式,同时研究了用DNA甲基化酶抑制剂(5-Aza-dC)处理供体细胞和(或)早期克隆胚,降低DNA甲基化水平对克隆胚发育及其甲基化水平的影响。1.检测了牛SCNT胚胎附植前各个发育阶段的DNA甲基化水平,对比了克隆胚胎在DNA甲基化水平上与IVF胚胎的差异。结果显示,克隆胚胎各个发育阶段DNA甲基化水平均高于体外受精胚胎,其中2-细胞到桑椹胚阶段甲基化水平显着高于IVF胚胎(P<0.05)。体外受精胚胎甲基化水平随着胚胎发育逐渐降低,到8-细胞阶段降到最低水平,从头甲基化发生在8-细胞到桑椹胚之间。而克隆胚胎单细胞核甲基化水平降低到4-细胞阶段,从头甲基化发生在4-细胞到8-细胞阶段。2.优化了5-Aza-dC处理方法,研究了DNA甲基化水平变化与克隆胚胎体外发育之间的关系。结果表明,低浓度的5-Aza-dC (20nM,72h)单独处理供体细胞或者重构胚不能显着提高克隆胚胎的体外发育率,对克隆胚的DNA甲基化水平没有明显影响;而供体细胞和重构胚均用低浓度5-Aza-dC (20nM,72h)处理可以显着提高囊胚发育率,2-细胞阶段DNA甲基化水平降低,8-细胞阶段的DNA甲基化水平显着降低且与IVF胚胎相比差异不再显着,说明克隆胚胎DNA甲基化水平影响其体外发育,降低2-细胞和8-细胞阶段的DNA甲基化水平可以提高克隆胚胎的体外发育能力。3.亚硫酸氢盐测序法研究5-Aza-dC (20nM,72h)同时处理供体细胞和重构胚后的8-细胞阶段克隆胚的Dnmt3a基因DNA甲基化水平。结果显示,5-Aza-dC处理过的克隆胚的Dnmt3a甲基化程度(38.9%)更接近于体外受精胚(43.3%),而未处理的克隆胚的Dnmt3a甲基化程度较低(25.6%)。
王勇胜[4]2009年在《优化核移植技术并生产转人溶菌酶和β-防御素-3克隆牛的研究》文中研究说明体细胞核移植技术为生产转基因动物核心技术之一,该技术的优化和成熟,对于成功生产转基因动物至关重要。本研究针对生产转基因牛中核移植技术的关键环节进行了系统研究,同时利用实验室已经构建好的人溶菌酶基因(human lysozyme, hLYZ)乳腺特异性表达载体pEBH和人β-防御素-3基因(humanβ-defension-3, hBD3)乳腺特异性表达载体pEBB分别转染牛成纤维细胞,经G418筛选4周后得到了纯化的转基因阳性细胞并用于核移植,经阳性胚胎筛选后进行胚胎移植,得到了20头2~8个月妊娠阶段受体母牛。主要研究内容如下:1.用组织块法成功分离了3头荷斯坦新生牛皮肤成纤维细胞和1头荷斯坦40 d胎儿的成纤维细胞。并对不同个体来源的新生牛成纤维细胞原代培养和传代培养细胞增殖和生长特性等进行比较,表明不同个体来源的新生牛成纤维细胞体外培养生长速度和核型方面没有显着性差异。同时比较了新生牛皮肤成纤维细胞和胎儿成纤维细胞生长特性及核型,胎儿成纤维细胞在原代培养时,4 d后铺满皿底,新生牛皮肤成纤维细胞8 d后才铺满皿底。表明胎儿成纤维细胞原代培养生长速度高于新生牛皮肤成纤维细胞。但经过传代培养后生长速度差异不明显。并且发现不同个体来源的新生牛皮肤成纤维细胞和胎儿成纤维细胞支持克隆胚胎的体外发育能力无显着性差异。2.比较了卵巢运输过程中在15℃、20℃、25℃、30℃温度下,对卵母细胞的回收、成熟及支持克隆胚的发育的影响,表明卵巢在保存温度为20℃和25℃时,A、B级卵母细胞的回收率分别为60.2%和64.0%,显着高于15℃和30℃时A、B级COCs的回收率(48.4%、40.1%)(P<0.05),卵巢保存在15℃、20℃、25℃,体细胞克隆胚的卵裂率分别为76.0%、75.0%、74.5%,囊胚发育率分别为29.2%、20.2%、22.4%,各组之间没有显着性差异,但分别显着高于30℃组(卵裂率和囊胚发育率分别为43.8%和8.3%)。3.在成熟培养液中添加1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL的瘦素(leptin),卵母细胞的体外成熟率分别为68.0%、81.0%、77.0%,克隆胚的囊胚发育率分别为18.4%、30.4%、24.4%。结果表明成熟培养液中添加10 ng/mL的leptin能显着提高克隆胚的囊胚发育率(P<0.05)(30.4% vs 17.3%)。4.比较了两种培养液mSOF和G1.1/G1.2对牛体细胞克隆胚发育的影响。结果发现两种培养液对体细胞克隆胚胎的发育速度、外观形态有显着的影响。G1.1/G1.2培养液培养的胚胎在8-细胞以后发育速度明显快于mSOF液培养的胚胎,在mSOF液中培养的胚胎桑葚胚致密化及囊胚扩张更明显;两种培养液对体细胞克隆胚的卵裂及囊胚发育率没有显着影响,但mSOF液培养的囊胚孵化率显着高于G1.1/G1.2培养液培养的囊胚(31.5% vs 21.3%, P<0.05);G1.1/G1.2培养液培养的囊胚内细胞凋亡率显着低于mSOF液培养的囊胚(8.5±1.2% vs 16.8±1.5%, P<0.05);两种培养液对囊胚内内细胞团细胞和滋养层细胞的比例没有显着影响;两培养液组得到的胚胎在移植后40 d的妊娠率差异不显着,但60 d以后,G1.1/G1.2培养组的妊娠率显着高于mSOF液培养组(23.3% vs 46.1%,P<0.05)。5.研究发现用秋水仙碱处理MII期卵母细胞,能使89.3%的卵母细胞在核区形成胞突,去核成功率能达到98.5%,显着高于常用的盲吸去核法(P<0.05)。6.挑选直径为15～20μm的细胞做核移植供核细胞时,重构胚的囊胚发育率显着高于直径为10μm或25μm的细胞组(P<0.05)。7.与传统的槽式融合法相比,微电极融合法能显着提高重组体的融合率(85.6% vs 66.7%,P<0.05),但这两种融合方法对体细胞克隆胚的早期发育没有显着影响。8.血清饥饿、接触抑制及生长期细胞对体细胞克隆胚的发育没有显着的影(P>0.05)。9.分别用本实验室构建好的hLYZ基因乳腺特异性表达载体pEBH和hBD3乳腺特异性表达载体pEBB转染牛成纤维细胞,经G418筛选4周后得到了纯化的转基因阳性细胞。用优化的卵母细胞成熟方法、核移植程序及克隆胚的培养方法生产得到了转基因克隆胚。10.研究发现,细胞转染外源基因后,支持克隆的囊胚发育率为20.6%,显着低于非转染的细胞(36.3%)(P<0.05)。11. 2头新生犊牛的成纤维细胞经转染后作为供体细胞,支持转基因克隆胚的体外发育率分别为18.4%和19.4%,个体之间差异不显着,经转染后胎儿成纤维细胞支持囊胚发育率为34.0%,显着高于两新生牛皮肤成纤维细胞囊胚发育率(P<0.05)。转基因克隆胚胎移植后60 d孕检,新生牛不同个体之间以及胎儿成纤维细胞和新生牛成纤维细胞构建的转基因克隆胚胎移植妊娠率无统计学差异。12.转基因克隆胚从4-细胞开始有7.8%(4/51)能观察到绿色荧光,到囊胚阶段有40.9%(18/44)能观察到绿色荧光。13.用转hLYZ基因的克隆胚共移植受体牛133头次,2个月后共有11头受体牛维持妊娠,妊娠率为8.3%;移植转hBD3基因阳性胚胎受给152头次受体牛,3个月后检测有9头维持妊娠,妊娠率为5.9%。
彭辉[5]2008年在《黄牛孤雌胚胎体外培养体系的优化及体细胞核移植胚构建初探》文中研究指明本试验通过在成熟基础液中添加不同浓度的HMG(人尿促性素)和ITS(胰岛素-转铁蛋白-硒酸钠)以观察对黄牛卵母细胞体外成熟率的影响,分析了卵巢运输过程中保存温度和时间及卵巢所处性周期阶段与黄牛卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎体外发育的关系;探讨了培养过程中培养微滴大小、每次换液量、添加血清是否灭活及血清添加时间和添加浓度对黄牛孤雌胚胎体外发育潜力的影响,并比较了4种培养液的培养效果;研究了有无颗粒细胞单层、不同类型及种属的颗粒细胞单层、颗粒细胞单层体外培养时间及在不同时间更换培养单层对黄牛孤雌胚胎体外发育的影响,旨在优化黄牛孤雌胚胎体外培养体系;对以黄牛颗粒细胞为核供体,去核卵母细胞为核受体构建核移植胚胎进行了初步探讨。结果如下:1.在成熟基础液中添加0.05IU/mL和0.1IU/mL的HMG卵母细胞成熟率极显着高于0.025 IU/mL组(71.26%,74.30%/31.52%;P<0.01);而添加10μL/mL ITS则对卵母细胞体外成熟率和卵裂率影响不大(71.52%/69.47%;84.96%/ 82.42%),但可以提高卵母细胞孤雌激活后的囊胚发育率(41.67%/32.0%);就卵母细胞成熟率和囊胚率而言,卵巢置于20～29℃保存(61.11%/33.33%)与10～19℃(41.18%/17.65%)和30～39℃保存(71.34%/41.84%)无显着差异(P>0.05),但后两组之间差异显着(P<0.05);30～39℃中保存1～3h抽出的卵母细胞较保存8～10h抽出的卵母细胞有较高的成熟率、卵裂率和囊胚发育率(68.57%/32.29%,86.11%/25.81%,40.32%/0;P<0.05);黄体期无黄体组与有黄体组均低于卵泡期卵母细胞的体外成熟率、卵裂率和囊胚发育率,但差异不显着(P>0.05)。2.与50μL组和200μL组相比,黄牛孤雌胚胎体外培养在100μL微滴中可以获得较高的囊胚率,3组之间无显着差异(43.20%/31.34%/38.82%) (P>0.05);每次更换培养液体积的1/2组比每次更换1/4组和3/4组更有利于黄牛孤雌胚胎的体外发育,就囊胚率而言有显着差异(41.84%/26.39%/25.71%)(P<0.05);添加的血清是否进行灭活对牛孤雌胚胎体外发育的影响不大,未灭活组的囊胚率和孵出囊胚率(40.23%/57.14%)略优于灭活组(38.95%/51.35%)。在黄牛卵母细胞孤雌激活后的第3d添加血清可得到较高的囊胚率和孵出囊胚率(46.55%/53.70%),而以孤雌激活后的第3d添加10%FBS囊胚发育率最高(45.97%);综合卵裂率和囊胚发育率,对4种培养液比较后认为黄牛孤雌胚胎的体外培养液应首选SOFaa。3 .孤雌胚胎体外培养时有颗粒细胞单层组的卵裂率、囊胚率和孵出囊胚率(85.10%/41.81%/52.70%)较对照组(66.13%/7.32%/0%)均差异显着(P<0.05);壁颗粒细胞和丘颗粒细胞单层均能较好地支持黄牛孤雌胚胎的体外发育,其卵裂率、囊胚率和孵出囊胚率分别为86.11%/ 83.72%、40.32% /41.67%、52. 0% /53.33%,无显着差异(P>0.05);来自黄牛、猪和小鼠的颗粒细胞单层在支持黄牛孤雌胚胎体外发育方面无种属特异性,其卵裂率、囊胚率和孵出囊胚率分别为83.42% / 85.16% / 82.58%、42.17% / 41.67% / 39.45%、54.29% / 52.73% / 48.84%,3组之间无显着差异(P>0.05);将培养2d和4d后的颗粒细胞单层分别用于胚胎的体外共培养,其卵裂率和囊胚发育率与对照组相比差异不显着(P>0.05),但4d组与对照组之间差异显着(P<0.05),3组在孵出囊胚率方面均无显着差异(P>0.05);就囊胚发育率而言,共培养的第3/6d两次更换单层与共培养的第4d更换单层和始终不更换单层的对照组相比无显着差异(P>0.05),但第4d更换单层与对照组相比差异显着(P<0.05),3组在孵出囊胚率方面差异不显着(P>0.05)。4.将卵母细胞在体外成熟培养17～19h、19～21h和21～23h后分别进行去核并构建核移植胚胎,3组的卵裂率和囊胚率无显着差异(P>0.05),17～19h组和19～21h组的去核率高于21～23h组且差异显着(P<0.05),而19～21h组的囊胚发育率优于其它两组;卵母细胞体外成熟培养19～21h后去核并构建核移植胚胎,经体外培养1～3h、3～5h和5～7h后再进行激活,结果表明核移植胚胎在体外培养3～5h进行化学激活可以得到较高的卵裂率(75.0%)和囊胚发育率(11.46%)。
赛务加甫[6]2007年在《提高绵羊体细胞核移植效率的研究》文中指出本研究对绵羊卵母细胞体外成熟、卵母细胞冷冻保存、卵母细胞孤雌激活、绵羊同种和异种体细胞核移植及重构胚胎体外培养等关键技术进行了试验分析,以期提高绵羊体细胞核移植的效率,建立完善的核移植技术体系,为进一步获得体细胞克隆绵羊和异种克隆个体提供技术支撑。本研究内容包括以下几个方面:(1)在绵羊卵母细胞成熟培养液中添加孕酮等某些影响体外成熟的成份,确定绵羊卵母细胞的最佳成熟方案。(2)并通过对比不同冷冻保护剂对卵母细胞的冷冻保存效果,为核移植操作批量提供成熟的卵母细胞。(3)采用胞质注射法,建立精子提取物激活卵母细胞的方法,并且与离子霉素结合6-DMAP激活法和电激活法进行了比较,筛选出适宜激活方法。(4)体外分离培养得到道赛特绵羊和莎能奶山羊的耳皮肤成纤维样细胞,对绵羊皮肤成纤维细胞的生物学特性和不同细胞因子对其生长增殖的影响进行了研究,并对绵羊成纤维细胞和山羊成纤维细胞分别进行体外传代及冻存,为绵羊体细胞核移植和绵羊-山羊种间核移植试验提供了供体细胞。(5)绵羊孤雌激活胚、绵羊重构胚和绵羊-山羊种间重构胚分别置于不同的培养系统中培养,优化绵羊胚胎体外体系,增加胚胎的体外发育潜力。主要研究结果如下:1.绵羊卵母细胞体外成熟基础液中分别添加5μg/mL FSH+1.0 IU/mL LH+10%发情牛血清(OCS)、5μg/mL FSH+1.0 IU/mL LH+10%胎牛血清(FBS)、0.075 IU/mL HMG+OCS和0.075 IU/mL HMG+10% FBS,结果表明成熟液中添加OCS更有利于卵母细胞的成熟;添加5%～10%的BFF能够提高卵母细胞的成熟率,但20%BFF卵母细胞的体外成熟率下降;培养液中分别添加0.1μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL和2.0μg/mL孕酮,结果表明孕酮的最适添加剂量为0.5μg/mL。结果表明绵羊卵母细胞的体外成熟培养液组成为M199+10 mmol/L Hepes+0.38 mmol/L丙酮酸钠+ 25 mmol/L谷氨酰胺+1μg/mL 17β雌二醇(17β-E2)+5μg/mL FSH+1.0 IU/mL LH+10%OCS+0.5μg/mL孕酮时其体外成熟培养效果最好。2.采用程序冷冻法对处于不同发育时期的绵羊卵母细胞进行冷冻保存,冷冻液Ⅰ～冷冻液Ⅳ对同一时期卵母细胞冷冻解冻后的形态正常率、卵裂率和桑囊胚发育率均无显着影响,而冷冻液Ⅳ体外成熟24 h冷冻解冻后的卵母细胞发育率显着高于GV期和体外成熟10 h的卵母细胞,说明用乙二醇(EG)作为冷冻保护剂,添加0.1 mol/L海藻糖较合适对成熟培养24 h的绵羊卵母细胞进行冷冻保存;-6.5℃植冰时冷冻卵母细胞囊胚发育率显着高于其他组。采用玻璃化冷冻方法对绵羊GV期到体外成熟培养24 h卵母细胞进行冷冻保存试验证实,以玻璃化冷冻液Ⅱ作为冷冻剂,体外成熟培养24 h卵母细胞的卵裂率和囊胚发育率最好,不经过成熟培养的卵母细胞玻璃化冷冻效果最差,认为添加0.1 mol/ L海藻糖来进行卵母细胞的玻璃化冷冻可以起到保护作用,卵母细胞冷冻解冻后可以用作受体胞质进行核移植,重构胚的发育能力受冷冻处理的影响不显着。3.对绵羊卵母细胞以连续3次120 v/mm的直流脉冲进行电激活获得最佳激活效果,囊胚发育率显着高于脉冲1次和2次(P<0.05);用分别注射不同剂量的精子提取物,对绵羊卵母细胞进行孤雌激活,结果表明最佳注射剂量为向每个卵母细胞注入精子提取物3 pL;分别用电激活法,离子霉素联合6-DMAP法和精子提取物胞质内注射法对绵羊卵母细胞进行激活,结果表明电脉冲的激活效果显着低于后二者的效果,且差异显着,精子提取物和离子霉素联合6-DMAP法的囊胚率差异不显着,均可以用于绵羊卵母细胞的激活。4.高糖DMEM较适宜于绵羊皮肤成纤维细胞的原代培养和继代培养。以DMEM+50% NCS(new - born calf serum),添加10% DMSO为冻存保护剂,进行冷冻保存的无角道赛特绵羊皮肤成纤维细胞,解冻细胞经体外5~6次传代培养,细胞形态维持在初始状况,保持了良好的遗传特性;添加EGF和胰岛素对绵羊皮肤成纤维细胞的生长均有促生长作用。5.卵母细胞体外成熟培养时间分别为15~17 h、19~21 h与23~25 h时,随着培养时间的增加成熟率也增加,卵母细胞去核成功率随着成熟时间的延长而下降,试验认为卵母细胞体外成熟19~21 h,既可以保证高的去核成功率,又可以保证卵母细胞较高的成功率,有利于提供充足的卵源;不经血清饥饿处理的供体细胞采用胞质注射法构建克隆胚,其胚胎发育率略高于血清饥饿处理组,但差异不显着。试验认为体外成熟培养19~21 h的卵母细胞可以作为核移植受体细胞,未经血清饥饿处理的成纤维细胞作为供体细胞进行核移植,可以获得较高的重构胚胎发育率。6.采用胞质内注射法构建绵羊皮肤纤维细胞重组胚,胚胎经离子霉素联合6-DMAP激活后,其细胞融合率、卵裂率和囊胚发育率均高于电融合法,同时结果表明重构胚用离子霉素联合6-DMAP或精子提取物激活后,卵裂率和囊胚发育率相近,其中精子提取物的激活效果优于离子霉素激活法;激活间隔时间研究结果证实,卵母细胞注核后经体外培养3～4 h后再激活,可以获得较高的激活率。7.用冷冻的山羊成纤维细胞可以成功构建山羊-绵羊异种体细胞核移植胚,种间体细胞核移植胚能够进行正常的早期发育,种间重构胚经离子霉素联合6-DMAP或者胞质注射精子提取物激活后,卵裂率和囊胚发育率差异不显着(P>0.05);用电脉冲融合法构建异种核移植胚胎时,其融合率、卵裂率和囊胚发育率均低于胞质注射法;不同山羊供体细胞进行山羊-绵羊异种核移植胚胎构建时,血清饥饿处理与否对种间核移植囊胚率无显着影响,表明山羊皮肤成纤维细胞可以不经过血清饥饿处理直接进行核移植。8.联合使用培养液能改善绵羊同种和异种重构胚的发育。即使用CR1aa+BSA培养重构胚3 d,再用SOFaa+5%FBS继续培养,获得的重构胚囊胚发育率较高。在胚胎培养液中添加孕酮可在一定程度上提高重构胚的卵裂率和囊胚率。其中以2.0和4.0μg/mL孕酮组的囊胚率最高,与对照组和其他孕酮浓度组差异显着。发现共培养体系对绵羊同种核移植重构胚的发育有显着的影响,而且在3 d更换1次新的饲养细胞单层对重构胚的发育有明显的促进作用。
赵晓娥[7]2005年在《转人t-PA指形区缺失突变体基因山羊体细胞核移植研究》文中研究表明本研究的目的是通过山羊体细胞核移植、胚胎细胞继代核移植技术生产转人t-PA 指形区缺失突变体基因山羊胚胎,通过荧光和PCR 检测,以期实现在胚胎植入前对外源基因整合表达检测;优化胚胎培养体系,提高转基因核移植胚的囊胚发育率。1. 比较了不同生长因子、季节和OM 液的pH 值对卵母细胞成熟的影响。(1)OM中分别添加10 ng/mL 的EGF,IGF 及EGF+IGF, IGF 组和EGF+IGF 组卵母细胞的成熟率(80.0%和82.4%)高于EGF 组(73.8%),极显着高于对照组(67.3%)。表明EGF 和IGF对山羊卵母细胞的体外成熟有促进作用。(2)比较了季节对卵母细胞体外成熟的影响,结果发现,12 月到次年1 月采集的卵母细胞体外成熟率最高(81.0%);11 月采集的卵母细胞体外成熟率较高(74.1%);3～5 月和9～10 月采集的卵母细胞体外成熟率接近(66.0%和69.6%);6～7 月初采集的卵母细胞体外成熟率最差(55.1%)。(3)当OM 的pH 值为7.2 和6.8～7.0 时,卵母细胞成熟率为66.2%和61.0%,显着高于pH≥7.5 时的成熟率(50.9%)(p<0.05)。表明pH 值为7.2 时卵母细胞体外成熟率最高。2.比较了不同的激活方法对卵母细胞孤雌激活的影响,以及培养液(CR1aa或SOFaa)中添加不同类型的血清对孤雌激活胚体外发育的影响。(1)采用Eth + 6-DMAP 、A23187+6-DMAP和Ion+6-DMAP叁种方法激活山羊卵母细胞,Eth + 6-DMAP组孤雌激活胚的卵裂率和囊胚率(35.2%和4.8%)显着低于A23187+6-DMAP组(68.9%和24.1%)和Ion+6-DMAP组(88.1%和48.0%),表明以Ion+ 6-DMAP激活最为理想。(2)在培养液(CR1aa或SOFaa)与颗粒细胞共培养条件下,分别添加10%的发情牛血清(OCS)、胎牛血清(FBS)和新生牛血清(NCS)。CR1aa组分别添加OCS 和FBS后,孤雌胚囊胚率分别为48.1%和45.0%,显着高于添加NCS组(26.0%)。SOFaa液分别添加OCS 和FBS后,孤雌胚囊胚发育率分别为50.5%和48.7%,显着高于添加NCS组(29.3%)。表明CR1aa和SOFaa两种培养液都适宜于山羊孤雌胚的体外培养,添加10%的OCS和FBS可显着提高孤雌胚的囊胚发育率。3.改造牛BLG 基因的5′调控序列并克隆在质粒载体pMD-18T,标记为pBLG。利用Xho I 和EcoR I 双酶切pBLG和真核表达载体pEGFP-C1,回收目的片断并连接,得到的质粒标记为pEB,然后用SalI 和BamH I 双酶切质粒pEB 和ptPA,回收目的片断并连接,构建表达载体pBT。4.利用脂质体转染法导入外源基因,转染细胞48 h 后,在荧光显微镜下观察报告基因GFP 表达,发现表达良好。利用G418 进行抗性细胞克隆筛选33 d,细胞经PCR 检
马利兵[8]2007年在《同异种间体细胞克隆胚的体外培养及线粒体、表面抗原检测》文中研究表明异种间体细胞核移植技术可利用家畜的卵母细胞为核受体、以珍惜濒危动物或人类的体细胞为核供体构建异种间体细胞克隆胚,通过体内或体外培养获取胚胎干细胞或异种间克隆动物。这项技术为保护和拯救珍稀濒危动物、人类器官移植开辟了一条崭新的途径。但极低的成功率限制了这项技术在实践中的应用,这可能归因于体细胞核在异种卵母细胞中未能完全再程序化。此外,异种间克隆胚及克隆后代中存在广泛的线粒体杂合现象,即来源于供受体细胞的两套线粒体共存。影响异种间克隆胚及克隆后代中线粒体杂合性的因素还不清楚。合子型基因激活(ZGA)是胚胎早期发育过程中的关键性事件。ZGA发生后,合子型基因编码的大量糖蛋白抗原可能分泌于胚胎细胞表面。因此,胚胎细胞表面抗原的检测可用于研究克隆胚中ZGA发生的时间及供核的再程序化状况。本实验以体外培养成熟的绵羊卵母细胞为核受体,分别以绵羊胎儿成纤维细胞(SFFs)、山羊胎儿成纤维细胞(GFFs)为核供体构建同异种间体细胞克隆胚,通过体外培养观察两者在发育能力及发育速度方面的差异。此外,在早期发育的不同阶段(1-、2-、4-、8-、16-细胞、桑椹胚、囊胚),分别采用real-time PCR及real-time反转录-PCR(real-time RT-PCR)的方法检测了异种间克隆胚中供受体来源的线粒体DNA(mtDNA)及线粒体RNA(mtRNA)的含量和比例。最后,采用免疫细胞化学法分别检测了同异种间克隆胚在不同发育阶段(2-、4-、8-细胞、桑椹胚)细胞表面山羊、绵羊种属特异性抗原的分布。采用OM液体外培养屠宰场卵巢来源的绵羊卵母细胞,22～24 h后的成熟结果表明, 72.8%的卵母细胞可获得成熟(可见明显第一极体),70.3%的卵母细胞胞质形态较好,可用于核移植。同异种间克隆胚的体外发育结果表明,同种间克隆胚的体外囊胚发育率(16.0%)高于异种间克隆胚的体外囊胚发育率(7.4%),且这种差异主要是由异种间克隆胚在8-细胞到16-细胞及16-细胞到桑椹胚期间的发育能力显着低于同种间克隆胚(p<0.05)造成的。同异种间克隆胚的体外发育速度表明,两者在从2-细胞到8-细胞发育期间的发育速度基本相同,但异种克隆胚在从8-细胞到囊胚发育期间的发育速度明显低于同种克隆胚12～24 h。对不同发育阶段异种间克隆胚中供受体来源的mtDNA检测结果表明,供受体来源的mtDNA可共存于异种间克隆胚体外发育的所有阶段中;在异种间克隆胚从1-细胞到桑椹胚的发育期间,供受体来源的mtDNA拷贝数是相对稳定的;在从桑椹胚到囊胚的发育期间,核供体来源的mtDNA拷贝数明显的由5.6×103±0.8×103下降到6.1×102±1.5×102 ( p<0.01 ),然而,核受体来源的mtDNA拷贝数却明显的由3.2×105±1.3×105增加到5.4×106±0.4×106(p<0.01),这种供受体来源的mtDNA拷贝数相反方向的变化导致两者的比例由2.0%±1.0%下降到0.012%±0.004%,且彼此之间差异极显着(p<0.01)。对不同发育阶段异种间克隆胚中供受体来源的ND-1 mRNA检测结果表明,在异种间克隆胚由1-细胞到2-细胞的发育过程中,山羊特异性ND-1 mRNA的拷贝数由2.0×103±0.4×103下降到4.8×102±1.2×102,在由4-细胞到囊胚的发育过程中已检测不到山羊特异性ND-1 mRNA的存在;然而,在异种间克隆胚由1-细胞到8-细胞的发育过程中,绵羊特异性ND-1 mRNA的拷贝数是相对稳定的(1-细胞阶段为6.9×103±0.6×103,8-细胞阶段为7.6×103±0.9×103),在16-细胞阶段有所增加(2.8×104±0.7×104),在桑椹胚及囊胚阶段得到了迅速的增加(桑椹胚阶段为2.4×105±0.4×105,囊胚阶段为8.5×106±1.4×106);这种动态的变化导致了异种间克隆胚在发育过程中山羊特异性ND-1 mRNA拷贝数相对于绵羊特异性ND-1 mRNA拷贝数比例的下降。据此,我们提出了一种核供体来源的线粒体选择性降解的机制,即由于核供体来源的线粒体生物学功能受到抑制,从而导致其退化并被选择性地降解。对处于不同发育阶段同异种间克隆胚细胞表面抗原的检测结果表明,同种间克隆胚在2-、4-、8-细胞阶段只有微量的绵羊特异性抗原分布于细胞表面,到桑椹胚阶段绵羊特异性抗原的数量明显增加,从而表明了绵羊-绵羊同种间克隆胚ZGA发生的时间为8-细胞到桑椹胚期间;异种间克隆胚在2-、4-细胞阶段有微量的绵羊特异性抗原分布于细胞表面,但几乎检测不到山羊特异性抗原的存在,在异种间克隆胚的8-细胞及桑椹胚阶段,几乎已检测不到绵羊特异性抗原的存在,然而,山羊特异性抗原的数量却明显增加,从而表明了山羊-绵羊异种间克隆胚ZGA发生的时间同样为8-细胞到桑椹胚期间,同时说明了绵羊卵母细胞具有再程序化GFFs的能力。
曹鸿国[9]2005年在《小鼠体细胞克隆胚的ES细胞研究》文中研究指明体细胞核移植同ES 细胞研究与组织工程相结合,诞生治疗性克隆的新疗法,修复人体病变的组织或器官,不仅可以解决移植物与受体间的免疫排斥反应问题,还可以解决移植物的来源问题。本次研究通过对体细胞核移植克隆胚适宜构建条件、激活方法、不同供体细胞在体细胞核移植中的应用、ES 细胞的适宜分离方法、克隆胚ES 细胞的分离培养、诱导分化等进行系列研究,为人类治疗性克隆的临床应用积累知识和经验。1、小鼠卵母细胞经乙醇和氯化锶激活同小鼠输卵管上皮细胞饲养层共培养,胚胎发育较为一致,卵裂均匀;小鼠孤雌胚的激活率乙醇加饲养层组最高97.15 %;小鼠孤雌胚的2-细胞率乙醇加饲养层组最高93.14 %;小鼠孤雌胚的桑椹胚率乙醇加饲养层组最高80.38 %;小鼠孤雌胚的囊胚率氯化锶加饲养层组最高76.21 %;孤雌胚的ICM 孵出率氯化锶加饲养层组最高75.28 %;孤雌胚ES 细胞孵出率氯化锶加饲养层组最高29.21 %,同乙醇加饲养层组、氯化锶组之间差异极显着(p<0.01)。表明氯化锶激活的昆明小鼠孤雌胚体外具有较强的发育能力。2、LIF 和大鼠心肌条件培养基在小鼠ES 细胞分离培养过程中,昆明小鼠ICM 孵出率心肌条件培养基为76.30 %,LIF 条件液为59.35 %,两者差异极显着(p<0.01); LIF条件液比心肌条件培养基能较早地分离出小鼠ICM,平均时间差为11.2 h;ES 细胞集落培养48 h时周边出现分化现象的集落所占比例在心肌条件培养基中为51.55 %, LIF条件液中为31.69 %, 两者差异极显着(p<0.01);第5 代小鼠ES 细胞核型正常率在心肌细胞条件培养基中为78.60 %,稍高于LIF 条件液中的76.00 %。表明大鼠心肌条件培养基较LIF 条件液更能成功分离培养昆明小鼠ES 细胞。3、小鼠在注射hCG 后14～16 h 间进行去核,去核成功率最高80.09 %;注射hCG后的20～22 h 间去核的卵母细胞,重构胚激活率最高85.14 %;注射hCG 后14～16 h去核重构胚囊胚率最高13.94 %,同16～18 h 间的差异显着(p< 0.05),同18～20 h、20～22 h 间的差异极显着(p< 0.01)。表明小鼠卵母细胞适宜在注射hCG 后14～16 h 间进行去核。4、小鼠卵丘细胞核移植重构胚氯化锶加饲养层组325 枚,195 枚发育到2-细胞阶段,71 枚发育到桑椹胚阶段,38 枚发育到囊胚阶段,9 枚重构囊胚分离出ES 细胞,5枚囊胚分离的ES 细胞集落可稳定传代;分离出ES 细胞集落呈鸟巢状突起,生长旺盛的ES 细胞集落周围可见到分化的上皮样或梭形细胞;ES 细胞碱性磷酸酶染色强阳性;体外形成类胚体。核移植重构胚氯化锶组289 枚,162 枚重构胚发育到2-细胞阶段,10
徐小明[10]2006年在《胎猪骨髓间充质干细胞核移植及核移植胚胎干细胞的分离》文中研究说明本研究以猪不同类型的细胞为供核细胞,体外成熟去核卵母细胞为受体胞质在体外构建胚胎,建立了体外生产体细胞核移植胚胎的技术体系,为体细胞克隆猪及核移植源胚胎干细胞(ntESCs)系的分离提供良好的平台。论文主要从以下5个方面进行了研究:1.供核细胞的准备共从4例胎儿肌肉组织中分离得到4个猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts, pFF)株,从1例新生猪耳组织中用组织块培养法分离得到一个耳部皮肤成纤维细胞(porcine ear skin fibroblasts, pESF)株,从3例胎猪骨髓中分离得到3个胎猪骨髓间充质干细胞(porcine fetal mesenchymal stem cells, pFMSCs)株。将1~5代的pFF、pESF及pFMSCs分别进行冷冻保存,解冻复苏后形态及活力没有明显变化。pFMSCs形态为成纤维样,呈长梭形,连续传13代后形态没有明显改变。传代培养的pFMSCs生长潜伏期为1~2 d ,之后进入对数增殖期,接种后的第6天进入平台期。透射电镜分析表明,pFMSCs细胞核质比高,胞浆中细胞器少。核型分析表明,pFMSCs具有正常的核型(2n=38,XY)。流式细胞仪检测显示,pFMSCs表达细胞表面抗原CD44,CD166,CD105,CD117,不表达CD45,CD90,CD11a,CD14。在β-巯基乙醇作用下,pFMSCs可诱导分化为神经样细胞,Nestin染色阳性。经血清饥饿和接触抑制处理的pFMSCs,流式细胞仪检测G0/G1期的细胞分别为86.72%和88.44%。以上细胞的分离培养为猪体细胞核移植相关研究打下了基础。2.猪卵母细胞体外成熟培养体系的建立从屠宰场采集猪卵巢,选择颗粒细胞层数2层以上、胞质均一的COCs进行体外成熟培养,对培养液组份进行了比较发现:①mM199组猪卵母细胞成熟率显着高于M199组(71.7% vs 59.7%)(p<0.05),mM199组和M199组较NCSU-23组(43.6%)均能显着提高卵母细胞的成熟率(p<0.01)。②PMSG+hCG+FSH组卵母细胞成熟率略高于FSH+LH组,二组卵母细胞成熟率显着高于hMG组(p<0.01)。③分别添加FBS和PFF与对照组(分别不添加FBS和PFF)成熟率无统计学上的差异,但电激活后,均能显着提高卵裂率(p<0.05),桑囊率二者无显着差异(p>0.05)。④单独添加EGF和联合添加EGF和ITS卵母细胞成熟率较不添加组稍有提高。电激活后,均能显着提高桑囊率(p<0.05)。⑤选择颗粒细胞层数3层以上的COCs可以显着提高卵母细胞体外成熟率
参考文献：
[1]. 牛体细胞核移植胚胎表观遗传修饰研究[D]. 丁向彬. 西北农林科技大学. 2008
[2]. 影响克隆胚体外发育及移植的因素研究[D]. 金仁桃. 安徽农业大学. 2004
[3]. 5-Aza-dC对牛体细胞核移植胚早期发育及其甲基化水平的影响[D]. 胡广卫. 西北农林科技大学. 2009
[4]. 优化核移植技术并生产转人溶菌酶和β-防御素-3克隆牛的研究[D]. 王勇胜. 西北农林科技大学. 2009
[5]. 黄牛孤雌胚胎体外培养体系的优化及体细胞核移植胚构建初探[D]. 彭辉. 西北农林科技大学. 2008
[6]. 提高绵羊体细胞核移植效率的研究[D]. 赛务加甫. 西北农林科技大学. 2007
[7]. 转人t-PA指形区缺失突变体基因山羊体细胞核移植研究[D]. 赵晓娥. 西北农林科技大学. 2005
[8]. 同异种间体细胞克隆胚的体外培养及线粒体、表面抗原检测[D]. 马利兵. 西北农林科技大学. 2007
[9]. 小鼠体细胞克隆胚的ES细胞研究[D]. 曹鸿国. 西北农林科技大学. 2005
[10]. 胎猪骨髓间充质干细胞核移植及核移植胚胎干细胞的分离[D]. 徐小明. 西北农林科技大学. 2006