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猪札幌病毒的分子特征分析及其感染猪肾上皮细胞特性的研究

2020-12-02阅读(261)

猪札幌病毒的分子特征分析及其感染猪肾上皮细胞特性的研究

论文摘要

札幌病毒（Sapovirus,SaV）,属于杯状病毒科、札幌病毒属,是单股正链RNA病毒。SaV经粪口传播能引起不同年龄的人和猪发生急性胃肠炎,近年来国外流行病学调查发现在黑猩猩、猪、鼠、海狮等多种哺乳动物体内检测到与人SaV表现为很近遗传进化关系的SaV毒株,此外,在生活用水及贝类中检测到与人SaV相似的毒株,这些都表明SaV感染是重要的公共卫生安全问题。尽管SaV发现已近50年,但由于SaV很难分离纯化和细胞培养,至今没有获得其疫苗或抗病毒药物。因此,一方面,获得SaV的全基因组序列并进行SaV基因多样性分析,包括SaV高变异毒株的发现和重组毒株的报道,同时进行SaV的分类,特别是动物SaV的基因分型,是SaV分子流行病学分析的重要依据。另一方面,在细胞水平上分析SaV与宿主的互作机制,包括阐明SaV是通过什么方式进入宿主细胞的及在SaV感染宿主细胞早期胆汁酸是如何调控宿主的信号传递的,是探索SaV的细胞培养和预防控制的重要基础。为了认识我国SaV的基因多样性,本论文运用病毒宏基因组学分析上海地区的仔猪腹泻粪样,发现了一株猪SaV GVII毒株SH1703,这是GVII在中国的第一次报道,该毒株的全基因组序列与已报道的两株GVII毒株RV0042和K7的同源性分别为63.6%和64.1%。重组是SaV进化和产生基因多样性的一种重要机制,对其致病力和宿主嗜性有重要的意义,多个国家有SaV重组现象的报道,本研究是我们第一次在中国发现SaVGIII基因群内重组现象,通过RDP和Simplot两种软件在全基因组序列的基础上分析发现其亲本毒株可能是JJ259和CH430,在RdRp-VP1结合区发生了重组,动物回归感染实验推测SaV阳性样品可以引起仔猪腹泻和小肠炎症。GenB ank数据库中公布了越来越多的SaV序列,进行SaV的分类,特别是基因分型是非常有必要的,本论文以137株SaV毒株的VP1核苷酸全长序列计算两两遗传距离值,将SaV的19个基因群分为51个基因型。本实验室从美国Ohio州立大学Linda院士实验室引进了全球唯一一株可细胞培养SaV Cowden毒株,前期研究发现SaV的摄入不依赖胆汁酸,本论文通过特异性化学抑制剂预处理LLC-PK1细胞,推测SaV可能依赖网格蛋白和胆固醇介导的内吞途径,入胞过程可能依赖GTP激酶dynamin和骨架蛋白的重排,其脱衣壳依赖酸性环境。胆汁酸在SaV复制早期发挥关键作用,通过转录组学分析发现添加胆汁酸能显著增强PI3K-Akt在内的47条信号通路和相关的25个关键基因表达水平。综上所述,本论文率先在中国发现SaV GVII和重组毒株并在GenBank数据库公布了两个代表毒株的全基因组序列,将SaV 19个基因群分为51个基因型,丰富了对中国猪SaV的认识,增加了 GenBank数据库SaV序列信息,为SaV的分类和分子特征分析提供了数据和参考。本研究初步探索了 SaV的入胞方式及胆汁酸对其感染宿主早期的调控,为最终阐明SaV与宿主的互作机制提供了重要线索。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 绪论
  •   1 札幌病毒（SaV）概述
  •     1.1 SaV的发现及命名
  •     1.2 SaV理化特性和稳定性
  •     1.3 SaV基因组结构
  •     1.4 SaV流行病学
  •     1.5 SaV的检测方法
  •   2 SaV分子特征
  •     2.1 SaV基因群和基因型
  •     2.2 重组SaV毒株
  •   3 胆汁酸与SaV的细胞培养
  •     3.1 SaV细胞培养体系的探索
  •     3.2 胆汁酸与SaV感染细胞
  •     3.3 转录组学与病毒感染的分子机制
  •   4 研究内容
  •   5 研究目的与意义
  • 第二章 中国SaV代表毒株分子特征分析
  •   第一节 病毒宏基因组学分析仔猪粪样病毒群体及SaV GVII代表毒株序列分析
  •     1 实验材料
  •       1.1 样品信息
  •       1.2 实验试剂
  •       1.3 实验仪器与耗材
  •     2 病毒宏基因组学文库的构建
  •       2.1 样品处理
  •       2.2 病毒核酸的提取
  •       2.3 反转录和双链cDNA的合成
  •       2.4 高通量测序文库的构建和扩增
  •       2.5 文库的优化及DNA片段长度的筛选
  •       2.6 文库质量检测和Miseq测序
  •       2.7 深度测序结果的生物信息学分析
  •     3 全基因组序列扩增
  •       3.1 引物设计
  •       3.2 全基因组扩增
  •     4 基于VP1和全基因组序列的遗传进化分析
  •     5 实验结果
  •       5.1 仔猪腹泻粪样的病毒宏基因组学结果分析
  •       5.2 仔猪腹泻粪样中SaV感染率
  •       5.3 SH1703毒株序列分析和遗传进化分析
  •     6 讨论
  •     7 小结
  •   第二节 SaV重组毒株序列分析
  •     1 实验材料
  •       1.1 样品信息
  •       1.2 试剂与仪器
  •       1.3 实验动物
  •     2 p2毒株的鉴定及全基因组序列的扩增
  •       2.1 p2毒株的鉴定
  •       2.2 p2全基因组序列的扩增
  •     3 p2毒株的序列分析与重组分析
  •     4 动物感染实验
  •       4.1 SaV感染动物实验
  •       4.2 病理切片
  •     5 实验结果
  •       5.1 病毒感染情况检测结果
  •       5.2 p2毒株的序列分析和重组分析
  •       5.3 动物回归实验
  •     6 讨论
  •     7 小结
  •   第三节 SaV基因分型
  •     1 实验材料
  •     2 基于VP1的遗传进化分析
  •     3 实验结果
  •       3.1 SaV毒株的基因型
  •     4 讨论
  •     5 小结
  • 第三章 Sav感染猪肾上皮细胞特性的研究
  •   第一节 Cowden毒株进入LLC-PK1细胞途径的探索
  •     1 实验材料
  •       1.1 病毒和细胞
  •       1.2 主要试剂与耗材
  •       1.3 主要仪器
  •     2 实验方法
  •       2.1 细胞培养
  •       2.2 SaV毒株感染细胞实验
  • 50测定'>      2.3 TCID50测定
  •       2.4 药物细胞毒性的检测
  •       2.5 药物抑制实验
  •       2.6 细胞样品的收集和总RNA提取
  •       2.7 反转录合成cDNA
  •       2.8 Quantitative real-time PCR
  •       2.9 Cowden毒株的鉴定
  •       2.10 统计学方法
  •     3 实验结果
  •       3.1 SaV感染细胞的检测
  •       3.2 SaV感染LLC-PK1细胞的入胞途径
  •     4 讨论
  •     5 小结
  •   第二节 胆汁酸在SaV感染细胞早期的转录组学分析
  •     1 实验材料
  •       1.1 病毒与细胞
  •       1.2 实验试剂与仪器
  •     2 实验方法
  •       2.1 样品处理及分组
  •       2.2 样品收集与准备
  •       2.3 数据分析
  •       2.4 Quantitative real-time PCR
  •     3 实验结果
  •       3.1 Cowden毒株感染LLC-PK1细胞的转录组测序数据整理
  •       3.2 基因表达定量
  •       3.3 差异表达基因分析
  •       3.4 差异表达基因的验证
  •     4 讨论
  •     5 小结
  • 第四章 总结与展望
  •   1 主要结论
  •   2 创新点
  •   3 研究展望
  • 参考文献
  • 附录Ⅰ 英文缩略表
  • 附录Ⅱ 本论文中涉及的SaV的GenBank序列号及序列信息
  • 附录Ⅲ 25个差异表达基因ID及在染色体中的位置
  • 致谢
  • 攻读博士学位期间发表的论文
  • 攻读博士学位期间参加的科研项目
  • 在校期间所获荣誉

    • 文章来源

    类型: 博士论文

    作者: 李晶娇

    导师: 吴际,华修国

    关键词: 札幌病毒,全基因组,基因型,基因重组,转录组学

    来源: 上海交通大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 上海交通大学

    分类号: S852.65

    DOI: 10.27307/d.cnki.gsjtu.2019.000737

    总页数: 155

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