赵毅[1]2004年在《正常及脂肪变小体积肝移植缺血再灌注损伤的治疗策略》文中研究说明目的 因为肝脏容量小造成的小肝综合症在某种程度上限制了活体肝移植及劈裂式肝移植的应用。如何找到新的药物治疗策略以解决这种边缘性供体的再灌注损伤将具有重要的临床意义。 鉴于目前关于Akt细胞生存通路的研究提示Akt的活化具有重要的生理学意义，其不仅可以通过抑制凋亡促进细胞生存，而且可以通过促进eNOS的活性，扩张血管。小肝综合症的发生机制不仅与小肝容积过小造成的短暂的门脉压力引起肝窦收缩有关，而且与调节细胞凋亡基因的增加有关。因此通过在损伤早期采用促进Akt活化的药物治疗策略，有可能减轻小肝移植后的缺血再灌注损伤，对扩大供体肝脏的应用有着重要的临床意义。 本实验采用大鼠原位小肝移植模型，探讨FTY720对小肝移植肝移植冷缺血再灌注损伤是否具有保护作用，并在此基础上研究FTY720对小肝移植冷缺血再灌注损伤保护作用的机制，为临床用药提供实验依据。 方法 为建立大鼠原位小肝移植冷缺血再灌注损伤模型，本实验在采用改良Kamada法的基础上，就建立稳定的大鼠原位正常小肝及脂肪变小肝移植冷缺血再灌注损伤模型的具体方法进行探讨。 雄性纯种Lewis大鼠分别作为供体及受体，将实验动物随机分为两组，对照组22只，FTY720治疗组18只。建立无静脉-静脉旁路的原位大鼠小肝移植模型，供体肝脏切取肝叶，使供体肝重量约占受体肝脏重量的36-45％，平均39％。对FTY720治疗组，1mg／kg体重的FTY溶于1ml生理盐水内，分叁次分别在供体肝脏取出前20min，受体肝脏取出前及灌注开始后各给予1祖。在同样的时间点给对照组注射相同数量的生理盐水。 采用生化分析对肝功能进行定量，HE及电镜检查细胞形态学改变，TUNEL法检测细胞凋亡情况，Westem一hlot检测细胞内Akt细胞生存通路，CasPases调往通路及MAPK炎症反应通路。免疫组织化学法检测细胞内phospho一Akt，AZo，eNOS及iNOS的表达情况。结果 月叮720对大鼠原位小肝移植冷缺血再灌注损伤的保护作用:为探讨们叮720对大鼠原位小肝移植肝脏冷缺血再灌注损伤的保护作用，本实验分别检测移植术后6、24小时血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)含量，并观察移植术后一周存活率。与对照组比较，治疗组术后肝功能及一周存活率明显改善，肝细胞损伤明显减轻。因此，FTY720对大鼠原位小肝移植肝脏冷缺血再灌注损伤具有保护作用。 们叮720减少细胞凋亡，保护肝细胞结构:光镜检查:灌注后6及24小时标本HE染色显示们万720较好的保护肝细胞的显微结构，肝小叶结构基本正常，肝细胞轻度空泡变性，汇管区炎性细胞浸润少，肝窦扩张，肝窦内皮细胞扁平，基本完整。相反对照组灌注后6小时标本HE染色显示肝小叶结构紊乱，肝细胞肿胀，空泡变性，肝窦内皮细胞受损肿胀，内皮细胞脱落，可伴有斑片状坏死。 电镜检查:电镜下肝细胞超微结构显示与对照组相比们刃720治疗组灌注后6小时及24小时肝脏结构基本正常，对照组灌注后6小时肝细胞结构破坏。 肝组织TUNEL检测:灌注后6及24小时月万720治疗组凋亡的肝细胞及肝窦内皮细胞明显减少，其Al均值显着降低;而对照组再灌注后6小时及24小时可见显着增多散在的肝实质细胞及肝窦内皮细胞凋亡。 曰刃720通过Akt磷酸化激活细胞生存通路:我们采用westem印迹法检测磷酸化Akt细胞生存通路的蛋白表达情况。本实验发现们万720对Akt有磷酸活化作用。在移植灌注后24小时，PrY72O显着上调磷酸化Akt表达，其Akt的磷酸化主要在473位点。伴随着Akt473的活化，Akt的叁个下游底物Bad，GSK及FKHR也相应的被磷酸化而失活，灌注后24小时我们检测到磷酸化Bad，GSK及FKHR蛋白表达显着上调。应用免疫组织化学检测，发现在灌注后6及24小时，与对照组相比，n，Y 720显着上调细胞内磷酸化Aki的表达，并且磷酸化Aki的表达主要在肝细胞及肝窦内皮细胞。 们万720上调抗凋亡基因，下调促凋亡基因的表达协20是一种锌指蛋白，A20的过度表达可以抑制多种因素介导的凋亡。本试验Westem印迹法发现与对照组相比灌注后24小时们万720显着上调AZO的蛋白表达水平。免疫组织化学检测也同样显示们万720可以显着上调细胞内A20基因的蛋白表达，AZO的表达主要表现在肝细胞及肝窦内皮细胞。而在对照组中，则检测到较低水平的AZO表达。另一方面，Westem印迹法检测发现门万720显着下调分裂形式的Caspases3，7及9的蛋白表达水平。与Akt磷酸化表达抑制细胞凋亡的趋势相一致，deaved CasPases3，7及9的蛋白表达水平在移植后24小时的时间点上显着低于对照组。 们万720下调MAPK通路:MAPKs通路对肝脏缺血再灌注急性期炎症损伤有重要作用。本实验中应用Weste。印迹法检测到，与对照组相比再灌注后6及24小时们T720显着下调MAPKs通路中磷酸化raf，MEK及Erk的蛋白表达水平。伴随着炎症通路的下调，相应的免疫组织化学检测显示与对照组相比月万720可以显着降低灌注后6及24小时组织炎症细胞因子iNOS的细胞内表达水平。 叮Y72O上调细胞内eN
张维晨[2]2018年在《异甘草酸镁减轻肝移植术后缺血灌再注损伤的研究》文中研究说明第一部分 异甘草酸镁在FK506保护肝移植肝脏缺血再灌注损伤中的作用及机制研究研究背景:肝移植后缺血再灌注损伤,增加术后并发症发生风险,影响肝移植患者长期预后。异甘草酸镁是临床常用的护肝药,广泛应用于临床各种肝病的治疗中。本研究旨在探索异甘草酸镁是否能减轻大鼠肝移植后肝脏缺血再灌注损伤,是否能增加Fk506的肝脏保护作用,以及背后的分子生物学机制。方法:将完成肝移植造模的大鼠随机分为5组,分别给予不同剂量的Fk506和异甘草酸镁。移植后48小时、72小时及1周分别取血样本测量AST、ALT、白蛋白水平。通过建立缺血再灌注损伤体外模型进一步探索Fk506和异甘草酸镁肝脏保护作用的分子生物学机制。结果:单用异甘草酸镁对大鼠肝移植并无明显肝脏保护作用,但是与小剂量Fk506联用相比单用小剂量Fk506,在术后48h,72h,1周均有明显的肝脏保护作用。在机制方面,Fk506能介导细胞自噬,从而显着减少肝细胞凋亡,维持肝脏增殖活性。但是与此同时Fk506能促使HMGB1从细胞核中释放,激活p38磷酸化及下游炎症通路,导致炎症因子释放。异甘草酸镁则能抑制HMGB1,以及下游的炎症信号通路。结论:异甘草酸镁在大鼠肝移植模型中能够抑制Fk506释放的HMGB1,从而减轻移植物缺血再灌注损伤;异甘草酸镁联用Fk506在临床肝移植术后减轻缺血再灌注损伤中有良好的应用前景第二部分 异甘草酸镁减少肝移植术后胆道并发症发生几率:一个回顾性队列分析研究背景:肝移植术后的缺血再灌注损伤,容易导致移植物失功,血管、胆管并发症的发生,最终导致移植失败。甘草根的提取物制剂是临床中常用的护肝药的组成成分之一,被广泛应用于各种肝脏损伤的疾病防治之中。本研究旨在探索两种不同的甘草酸衍生物异甘草酸镁和复方甘草酸苷之间,对临床肝移植术后肝脏保护及并发症防治作用的差异。方法:本研究回顾了我中心2015年1月至2015年12月间接受肝移植的患者资料,根据术后护肝药物使用方案的不同,分为异甘草酸镁组和复方甘草酸苷组。对两组患者的临床资料和生存信息进行统计,分析两组患者间术后肝功能、总体生存率、Fk506血药浓度及血管、胆管并发症发生风险的差异。结果:在本研究纳入的所有患者中,异甘草酸苷和复方甘草酸苷组之间术后一年总体生存率并没有显着差异。术后1月内死亡的病例比率在两组之间也没有显着性差异。两组患者1年内血管并发症的发生几率大致相似,但在胆道并发症的发生中,异甘草酸镁组显着低于复方甘草酸苷组(15%vs 29%,p<0.05)。异甘草酸镁组术后14天Fk506的谷浓度为12.1±18.1,高于复方甘草酸苷组的6.7±2.8(p<0.1)。结论:异甘草酸镁相比复方甘草酸苷显着降低肝移植患者术后胆道并发症发生几率。后续研究还需要设计含有空白对照的前瞻性研究进一步说明这个现象。
张静[3]2012年在《间充质干细胞移植保护大鼠小肠缺血—再灌注损伤的研究》文中研究说明目的1.探讨大鼠骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, BM MSCs)的体外分离、培养、纯化方法及其表型的鉴定。2.探讨BM MSCs移植对大鼠小肠缺血-再灌注损伤的保护作用及其发挥这一作用的可能机制。方法1.取4～5周龄,体重100～120g的健康、雄性Wistar大鼠,采用密度梯度离心联合贴壁筛选法分离、培养、纯化其BM MSCs,观察原代及传代细胞的形态结构及生长状况,并用流式细胞仪鉴定第3代细胞的表型。2.建立大鼠小肠-缺血-再灌注损伤模型：取6～8周龄,体重180～200g的健康、雄性Wistar大鼠,所有动物术前禁食12h,可自由饮水,手术在无菌条件下进行,分离大鼠的肠系膜前动脉,用无损伤动脉夹夹闭其起始部30min后松开血管夹,关腹,造成大鼠小肠缺血-再灌注损伤模型。3.收集传代培养的第3代BM MSCs细胞,用生理盐水充分重悬,制成5×106/ml单细胞悬液。将大鼠小肠缺血-再灌注损伤模型,采用随机数字表法随机分为实验组(1ml BM MSCs细胞悬液经肠黏膜下植入)和对照组(等量生理盐水经肠黏膜下注射),每组36只大鼠,共72只。于术后2、6、24、72和120h几个不同时间点处死大鼠,留取动物血清和小肠组织标本备用。4.采用底物荧光素示踪法观察肠黏膜下移植的细胞在肠道的定植情况及生存力；酶联免疫法(Enzyme linked immunosorbent assay, ELIS A)检测血清中的二胺氧化酶(Diamine Oxidase, DAO)、D-乳酸和肿瘤坏死因子a (Tumor necrosis factor-α, TNF-a)的水平；光镜下观察小肠组织的病理变化,透射电镜观察肠道紧密连接的变化；免疫组织化学及蛋白印迹杂交(Western blot)检测肠上皮细胞间连接蛋白ZO-1含量的变化。结果1.体外成功分离、培养、扩增、纯化BM MSCs,培养的第3代贴壁细胞大部分表达CD29、CD90及RT1A而不表达CD34、CD45及RT1B。2.成功建立大鼠小肠缺血-再灌注损伤模型；底物荧光素示踪法示经肠黏膜下植入的细胞定植在肠道,并可以长期存活。3.ELIS A检测DAO、D-乳酸和TNF-a水平,其中实验组DAO水平6h为11.36±1.89IU/ml、24h为5.04±1.04IU/ml,D-乳酸水平6h为0.157±0.025mmol/L、24h为0.109±0.013mmol/L,TNF-a水平6h为266.09±8.84pg/ml、24h为190.39±4.24pg/ml;对照组DAO水平6h为14.27±2.09IU/ml、24h为7.35±1.46IU/ml,D-乳酸水平6h为0.193±0.019mmol/L、24h为0.141±0.007mmol/L,TNF-a水平6h为286.81±11.54pg/ml、24h为218.49±15.51pg/ml,6h和24h时实验组DAO、D-乳酸和TNF-α水平低于对照组,两组相比差异有统计学意义(P<0.05)。4.形态学方面：实验组小肠组织HE染色显示：小肠绒毛水肿、肠上皮细胞坏死、肠道间质充血及炎症细胞浸润程度与对照组相比明显减轻；电镜下显示：实验组小肠绒毛破坏程度减轻,肠道紧密连接完整,细胞器恢复正常形态。5.免疫组化及Western blot结果均显示ZO-1蛋白的表达在实验组明显高于对照组,提示BM MSCs可以促进ZO-1蛋白的生成。结论1.用密度梯度离心联合贴壁法可分离、纯化大鼠BM MSCs,方法简单,费用低廉,易应用；且BM MSCs在体外可以大量扩增,传代培养的细胞纯度较高。2.在小肠缺血-再灌注损伤的大鼠肠黏膜下移植BM MSCs可以修复小肠黏膜上皮结构、促进肠上皮细胞间ZO-1蛋白的表达,从而阻止小肠缺血-再灌注损伤导致的小肠通透性的升高,证实BM MSCs对大鼠小肠缺血-再灌注损伤具有保护作用。
张巍[4]2005年在《肝移植病理诊断及肝肾急性排斥反应机制研究》文中提出研究背景：随着器官保存及外科手术技术的提高，免疫抑制药物的有效利用，肝脏移植病人及移植物存活明显提高，肝移植可作为终末期肝脏有效的治疗方法。但是肝移植后影响移植物长期存活的因素很多，包括缺血再灌注损伤、排斥反应、机会性感染、药物毒性反应以及原发疾病的复发。活检是诊断上述并发症的有效方法，虽然有关于这方面的报道，但是对某些并发症的描述并不一致，并且某些并发症的鉴别诊断模糊，值得进一步探讨。免疫耐受的诱导是移植物长期存活的有效途径。然而，研究了解排斥反应的机制是诱导免疫耐受的基础，因此对于急性排斥反应的发生机制一直是研究的热点。 目的：研究肝移植后病理学改变的特征以及肝肾移植急性排斥反应发生机制。 方法：收集法国贝桑松医院1996～2005年接受肝移植的病例，共122例，272张切片，复习所有的切片，分析其并发症病理特点：分析69例小叶中央改变的病理临床意义；比较微脓肿综合症与巨细胞病毒(CMV)感染微脓肿每高倍视野下微脓肿的数量及中性粒细胞构成以及二者发生年龄和时间，同时分析导致微脓肿综合症的可能原因。运用用免疫组织化学方法检测112例次移植肝急性排斥反应标本中Bcl-2、Bax、Fas和FasL基因蛋白的表达。运用Meta-分析的方法综合评价细胞因子基因多态性与同种异体肝脏肾脏移植急性排斥反应发生风险的关系。 结果：急性细胞性排斥、慢性排斥反应、CMV肝炎、C型肝炎复发、B型肝炎复发、PBC复发、药物性肝脏损害、小叶性肝炎，难以
王峥[5]2010年在《缺血型胆道损伤对大鼠肝移植胆道超微结构及微循环的影响及生长激素的保护作用》文中研究指明缺血型胆道损伤的防护对于改善移植肝胆道血供,提高肝移植后的成功率具有重要意义。缺血型胆道损伤是一个由多因素参与的复杂的病理过程,移植肝胆道的血供主要来自肝动脉,最终肝动脉的狭窄或闭塞发挥着重要作用。重组人生长激素对组织缺血性损伤具有保护作用,有增加机体蛋白合成能力、改善机体免疫功能、降低应激反应,及刺激胰岛素样生长因子Ⅰ生成增加等诸多功能。本课题利用简便实用的大鼠自体原位肝移植模型,并造成缺血型胆道损伤,应用重组人生长激素进行术后干预,术后观察肝内胆道超微结构及微循环的变化和胆管上皮细胞凋亡、增生及相关调控因子的表达情况,研究探讨重组人生长激素对肝移植缺血型胆道损伤的防护作用及相关机制,为生长激素应用于肝移植后的胆道保护提供理论研究和实验基础。国内国外,此方面的工作尚无文献报道及有关记载。第一部分缺血型胆道损伤对肝移植胆道超微结构的影响及生长激素的保护作用目的：应用重组人生长激素,对大鼠自体原位肝移植术后缺血型胆道损伤进行术后干预,观察胆道超微结构改变,探讨生长激素对肝移植缺血型胆道损伤的保护作用与机制。材料与方法：1.动物分组与模型制备选用wistar系雄性大鼠18只,体重200±20g,随机分为3组：对照组(CON组)、缺血型胆道损伤组(ITBL组)和rhGH处理组(rhGH组),每组6只。CON组仅进行自体原位肝移植；rhGH组于术后3h结扎肝动脉,并且皮下注射rhGH 0.3IU/kg/天共一周；ITBL组于术后3h结扎肝动脉,并且皮下注射等量生理盐水一周。2.标本的采集与处理术后7天再次开腹,快速获取左肝外叶胆道组织,部分置于10%多聚甲醛溶液以备光镜检查,部分置于2.5%戊二醛固定液中以备透射电镜分析。3.检测指标(1)胆道组织病理检测取上述10%多聚甲醛所固定组织,稍加修整,制成组织蜡块、切片,常规HE染色。高倍镜视野下,观察胆管上皮水肿、炎细胞浸润、上皮坏死脱落等情况。(2)胆道透射电镜观察及图像分析取上述2.5%戊二醛所固定组织,制成电镜标本,电镜观察各组胆管上皮微观结构改变,并用图像分析系统对其损伤程度进行定量分析。4.统计分析：全部数据均由SPSS13.0软件进行统计学处理。多组间比较用方差分析(ANOVA),随后用合适的方法作多重比较。数据结果采用均数±标准差表示,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.胆管组织学变化HE染色显示,CON组以胆管上皮水肿、炎细胞浸润等可逆性损伤为主；ITBL组以上皮大部分坏死脱落等不可逆损伤为主；而rhGH组,胆道上皮坏死脱落明显减少,以胆管上皮水肿、炎细胞浸润为主。2.透射电镜观察术后1周CON组可见胆管的粘膜皱褶饱满,起伏自然,无上皮层破损,胆管上皮细胞呈圆形或椭圆形,形态规则,大小均一,排列整齐,表面微绒毛较丰富；ITBL组可见胆管上皮细胞呈蜂窝状坏死,基层胶原纤维裸露,残余上皮细胞欠规则,间距较大,表面微绒毛稀疏；rhGH组可见细胞数量增多,形态基本正常,细胞间距基本正常,表面微绒毛丰富但形态欠均匀。3.胆管上皮透射电镜图像分析ITBL组的胆管上皮细胞面积密度、数密度和微绒毛面积密度等平面计量学参数均显着小于CON组和rhGH组(P<0.05)；rhGH组的胆管上皮细胞平面计量学参数较ITBL组有明显改善(P<0.05),但仍较CON组低(P<0.05)。第二部分缺血型胆道损伤对肝移植胆道微循环的影响及生长激素的保护作用目的：应用重组人生长激素,对大鼠自体原位肝移植术后缺血型胆道损伤进行术后干预,观察肝内胆道微循环变化,探讨生长激素对肝移植缺血型胆道损伤的保护作用与机制。材料与方法：1.动物分组与模型制备选用wistar系雄性大鼠18只,体重200±20g,随机分为3组：对照组(CON组)、缺血型胆道损伤组(ITBL组)和rhGH处理组(rhGH组),每组6只。CON组仅进行自体原位肝移植；rhGH组于术后3h结扎肝动脉,并且皮下注射rhGH 0.3IU/kg/天共一周；ITBL组于术后3h结扎肝动脉,并且皮下注射等量生理盐水一周。2.标本的采集与处理术后7天再次开腹,快速获取左肝外叶胆道组织,置于10%多聚甲醛溶液以备石蜡切片。3.检测指标(1)病理学检查：石蜡标本2.5μm切片,常规HE染色。观察汇管区炎症细胞浸润及胆管结构破坏程度。(2)石蜡标本2.5μm连续切片,用兔抗CD34多克隆抗体标记血管。计数汇管区胆管数、血管数、伴有血管的胆管数、不伴有血管的胆管数及孤立的血管数。4.统计分析：全部数据均由SPSS13.0软件进行统计学处理。多组间比较用方差分析(ANOVA),随后用合适的方法作多重比较。数据结果采用均数±标准差表示,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.胆管病理形态观察ITBL组胆管上皮细胞排列明显缺失,管壁无增厚,汇管区也无明显炎症细胞浸润。CON组、rhGH组胆管上皮细胞呈慢性增生性炎症改变,管壁明显增厚,汇管区炎性细胞增多,胆管上皮细胞增生2.汇管区胆管及血管的变化胆道缺血性损伤后,汇管区胆管受损,ITBL组较CON组汇管区胆管数明显减少(P<0.05); rhGH处理后,汇管区胆管增生,rhGH组较ITBL组汇管区胆管数明显增加(P<0.05)。缺血型胆道损伤后,伴有血管的胆管数量较CON组明显减少,而不伴有血管的胆管数却明显增加(P<0.05); rhGH处理后,伴有血管的胆管数量较ITBL组明显增多,而不伴有血管的胆管数却明显减少(P<0.05)。第叁部分生长激素对肝移植缺血型胆道损伤的保护作用及其机制目的：探讨外源性生长激素对大鼠肝移植缺血型胆道损伤的保护作用及其机制。材料与方法1.动物分组与模型制备选用wistar系雄性大鼠18只,体重200±20g,随机分为3组：对照组(CON组)、缺血型胆道损伤组(ITBL组)和rhGH处理组(rhGH组),每组6只。CON组仅进行自体原位肝移植；rhGH组于术后3h结扎肝动脉,并且皮下注射rhGH 0.3IU/kg/天共一周；ITBL组于术后3h结扎肝动脉,并且皮下注射等量生理盐水一周。2.标本的采集与处理术后7天再次开腹,快速采取下腔静脉血液离心取上清液,取左外叶肝组织置于10%多聚甲醛溶液保存。3.检测指标(1)血清ALT和ALP检测。(2)免疫组化法检测胆管上皮细胞VEGF、VEGFR2、VEGFR3、IGF-1R和GHR表达。封片后用Olympus U-25ND6 T2显微镜观察显微结构,用IAS图像分析系统(Delta Sistemi)分析图像,估算免疫组化染色的强度和分布。(3)胆管上皮细胞的PCNA标记用半定量法测定。在20个随机的高倍视野(-400)计数500个胆管细胞,计算PCNA阳性细胞百分数,由此估算PCNA标记指数。只有表达核免疫染色强阳性的细胞才‘被列入阳性计数。(4)采用TUNEL法按细胞凋亡检测试剂盒操作说明进行检测,光镜下观察各组大鼠肝内胆管上皮细胞凋亡情况。在高倍视野(×400)下盲法检测每个组织样本中凋亡细胞数。用凋亡指数进行定量,即30个随机显微高倍视野的阳性细胞数来算出TUNEL阳性胆管上皮细胞百分数。4.统计分析：全部数据均由SPSS13.0软件进行统计学处理。多组间比较用方差分析(ANOVA),随后用合适的方法作多重比较。数据结果采用均数±标准差表示,P<0.05为差异有统计学意义。结果1. ITBL组的ALT和ALP显着高于对照组(P<0.05); rhGH组ALT和ALP较ITBL组明显降低(P<0.05),然而仍高于CON组(P<0.05)。2.免疫组化检测显示,ITBL组肝脏表达VEGF、VEGFR2、VEGFR3、GHR和IGF-1R阳性胆管上皮细胞数较CON组减少(P<0.05); rhGH组阳性表达较ITBL组明显提高(P<0.05),但仍较CON组低(P<0.05)。3. TUNEL分析显示,CON组大鼠表达少量凋亡细胞,ITBL组大鼠胆管上皮细胞凋亡较CON组增加(P<0.05), rhGH处理抑制ITBL所致的胆管上皮细胞凋亡(P<0.05)。4. ITBL组PCNA阳性胆管上皮细胞数较对照组减少(P<0.05), rhGH处理解除ITBL对PCNA阳性胆管上皮细胞数的抑制(P<0.05)。结论：1.缺血型胆道损伤直接损害胆管上皮细胞,使胆道超微结构破坏,外源性生长激素处理明显减轻肝移植缺血型胆道损伤,对胆道具有保护作用。2.缺血型胆道损伤使肝内胆道微循环受损,而外源性生长激素促进肝内胆道微循环的恢复从而对胆道有保护作用。3. rhGH处理明显减轻肝移植肝内缺血型胆道损伤,这可能与rhGH通过提高肝内胆管上皮细胞VEGF、VEGFR-2、VEGFR-3、GHR和IGF1-R表达,从而抑制凋亡、促进增生有关。
马根顺[6]2009年在《胃饲红景天水煎剂拮抗大鼠肝脏原位热缺血再灌注损伤的实验研究》文中认为目的:肝脏缺血再灌注损伤(Hepatic Ischemia Reperfusion Injury,HIRI)是临床常见的病理生理过程,常见于肝切除术、出血性休克、肝移植等,为手术失败和导致患者死亡的原因之一。红景天为景天科红景天属(RhodiolaL.),在我国广泛分布于东北、西北、西南等地,大部分生长于海拔3500-5000 m的石灰岩、花岗岩、山地、冰川等极其恶劣而多变的自然环境中。近年来学者们对红景天做了多方面研究,陆续发现红景天具有抗缺氧、抗衰老、抗辐射及双向免疫调节等多种作用。本课题通过研究红景天对大鼠肝脏原位热缺血再灌注损伤的拮抗作用,对其可能的作用机制进行初步探讨。方法:选用成年Sprague-Dawley大鼠72只,随机分为:(1)生理盐水对照组(A组,n=24):生理盐水2ml连续灌胃5天,末次灌胃2h后经第一肝门阻断入肝血流30min而后松开无创动脉夹,恢复入肝血流,分别于缺血30min及再灌注后1、6、及24h各时相点活杀动物取材,每时相点观察6只动物:(2)红景天预处理组(B组,n=24):红景天水煎剂2ml灌胃5天,末次灌胃2h后经第一肝门阻断入肝血流30min而后松开无创动脉夹,恢复入肝血流,分别于缺血30min及再灌注后1、6、及24h各时相点活杀动物取材,每时相点观察6只动物:(3)己酮可可碱对照组(C组,n=24):己酮可可碱溶液2ml连续灌胃5天,末次灌胃2h后经第一肝门阻断入肝血流30min而后松开无创动脉夹,恢复入肝血流,分别于缺血30min及再灌注后1、6、及24h各时相点活杀动物取材,每时相点观察6只动物。心脏采血,AU400全自动生化分析仪测定丙氨酸氨基转移酶(ATL)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)变化。肝组织匀浆分别采用硫代巴比妥酸法比色法测定MDA及黄嘌呤氧化酶法测定SOD。肝组织行HE染色观察组织病理变化,采用末端脱氧核昔酸转移酶介导的生物素脱氧嘧啶核苷酸缺口末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡,免疫组织化学方法检测Bcl-2蛋白表达。数据采用spss11.5软件处理,计量资料用均数±标准差表示,多组间比较用单因素方差分析,组间两两比较用q检验,P＜0.05认为差异有统计学意义。结果:①血清学检查:缺血30min,A、B、C组ALT、AST数值两两比较差异无统计学意义(P＞0.05);再灌注1h、6h、24h,A组ALT、AST同缺血30min相比明显升高,再灌注6h达到最高点,再灌注24h稍有下降但仍比再灌注1h;B组、C组再灌注后各时相点ALT、AST分别与A组相比均明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05);B组与C组各时相点相比差异无统计学意义(P＞0.05);②肝组织匀浆检查:再灌注1h、6h、24h,A组MDA同缺血30min相比明显升高,SOD明显降低,再灌注6h分别达到最高点和最低点,再灌注24h MDA有所下降但仍比再灌注1h高,而SOD则有所上升;B组、C组MDA各时相点分别同A组相比均明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05),B组与C组SOD各时相点分别同A组相比则明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05);B组与C组各时相点相比差异无统计学意义(P＞0.05);③免疫组化:再灌注1h、6h、24h,A组凋亡指数(AI)同缺血30min相比明显升高,Bcl-2阳性指数(BI)则明显降低,再灌注6h AI和BI分别达到最高点和最低点,再灌注24h凋亡指数有所下降但仍比再灌注1h高,Bcl-2阳性指数则有所上升;B组、C组凋亡指数各时相点分别同A组相比均明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05);B组与C组各时相点Bcl-2阳性指数分别同A组相比则明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05);B组与C组各时相点Bcl-2阳性指数相比差异无统计学意义(P＞0.05)。结论:①肝脏缺血再灌注损伤可以引起明显的肝脏损伤,同时伴有脂质过氧化损伤及肝细胞凋亡的增加。②肝脏缺血再灌注前给予红景天水煎剂可以显着减少MDA的含量,增强SOD,保护肝脏功能。③红景天具有很强的抗缺血缺氧能力,可能通过提高组织Bcl-2蛋白的表达,拮抗肝脏缺血再灌注损伤,减少细胞凋亡达到保护肝脏的目的。
赵丽苹[7]2016年在《新型融合蛋白uPAg-KPI对卵巢癌的抑制作用及器官功能保护的实验研究》文中指出卵巢癌死亡率居妇科恶性肿瘤首位。临床上卵巢癌治疗手段以肿瘤细胞减灭术为主,辅助化学治疗。尽管卵巢癌治疗方案明确,手术设备也日臻完善,化疗药物层出不穷,但晚期卵巢癌的五年生存率仍然仅有20%-30%。导致低存活率主要有两点原因:(1)卵巢癌发现时期别已较晚,多伴有其它部位转移,难以实施理想的肿瘤细胞减灭术;(2)化疗产生严重毒、副作用,如骨髓抑制,肝、肾功能损伤等,导致患者难以按规定的疗程和剂量完成化疗。因此,寻找到一种有效抑制卵巢癌,同时还能对脏器功能有保护作用的药物,成为科研人员研究的重点。尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)是一种丝氨酸蛋白酶,uPA通过其生长因子结构域(GFD区)与细胞表面的尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)高效结合后,激活纤溶系统,降解细胞外基质及基底膜,促进肿瘤血管生成,激活MAPK,Src,FAK,PI3K-AKT等信号通路,在肿瘤的增殖、转移中起重要作用。uPA与uPAR在包括卵巢癌在内的多种实体肿瘤中高表达,且其表达水平与患者的预后密切相关。Kunitz型蛋白酶抑制剂(KPI)是一类对丝氨酸蛋白酶有抑制作用的酶。其对uPA/uPAR系统中uPA功能可产生抑制作用,进而能够抑制uPA/uPAR系统在肿瘤生长和转移中的作用。另一方面,Kunitz型蛋白酶抑制剂能抑制炎性介质的释放,抑制白细胞过度激活;抑制超氧阴离子自由基产生,降低脂质过氧化损伤;稳定溶酶体膜,抑制溶酶体的降解作用;抑制Ca2+激活的K+离子通道,延迟细胞凋亡和死亡。KPI在抗肿瘤转移和器官保护方面的研究日渐增多。基于上述KPI和uPA/uPAR系统的关联以及各自的功能作用。本研究团队前期以uPA的GFD区连接一种从人β-淀粉样肽中获得的KPI结构域,重组制备了新型人源Kunitz融合蛋白uPAg-KPI。拟在本研究中探索uPAg-KPI在抗卵巢癌和器官保护中的作用。目的:验证uPAg-KPI在体内和体外实验中对卵巢癌增殖和转移的抑制作用,以及其对增殖、转移相关通路的影响;验证uPAg-KPI在肝、肾损伤模型中对肝、肾功能的保护作用,以及其对氧化平衡系统的影响。方法:(1)通过MTT,克隆形成试验,流式细胞术,Transwell试验,划痕试验,探讨uPAg-KPI对SKOV3的生长和转移的抑制作用。通过Western Blot初步探讨其作用机制。(2)通过构建人卵巢癌SKOV3细胞的裸鼠移植瘤模型,对比裸鼠移植瘤大小和重量,比较抑瘤率,探讨uPAg-KPI在体内对卵巢癌的抑制作用及在联合应用中的辅助作用。通过免疫组化法检测P-ERK、P-AKT、PCNA、VEGF这些与生长转移有关蛋白,初步探讨机制。(3)构建顺铂致小鼠急性肾损伤模型,通过对比小鼠生长状态,肾BUN、CRE水平,行肾脏组织病理学检查的方法,探讨uPAg-KPI在急性肾损伤中的保护作用;通过检测肾脏匀浆组织中MDA、SOD、GSH-PX、CAT含量,初步探讨作用机制。(4)构建CCl4致小鼠急性肝损伤模型,通过对比小鼠生长状态,肝ALT、AST水平,行肝组织病理学检查的方法,探讨uPAg-KPI在急性肝损伤中的保护作用;通过检测肝脏匀浆组织中MDA、SOD、GSH-PX、CAT含量,初步探讨作用机制。结果:(1)uPAg-KPI抗卵巢癌作用的体外实验,(1)uPAg-KPI对SKOV3的抑制作用呈现时间和浓度依赖性,在uPAg-KPI浓度为0.5μg/μl,药物作用48h时可抑制率可达50%。(2)uPAg-KPI组(0.5μg/μl)克隆形成数目为12%±0.76%,与对照组18%±2.18%比较,显着降低。(3)流式细胞术检测uPAg-KPI用药后细胞周期的分布,加药组G1期细胞增加,S和G2/M期细胞百分比下降,细胞周期阻滞于分裂期之前。(4)划痕实验中uPAg-KPI组划痕区域细胞数量较对照组明显降低。(5)Transwell迁移实验中,uPAg-KPI组穿膜细胞数12.5±5.06,较对照组37.7±6.34显着降低;Transwell侵袭实验中,uPAg-KPI组穿膜细胞数5.5±2.46,较对照组为24.4±3.20显着降低。(6)Western blot检测uPAg-KPI与SKOV3细胞作用12、24、48小时后,ERK1/2,P-ERK1/2和AKT和P-AKT水平,总ERK1/2和总AKT蛋白的表达无明显变化,p-ERK1/2和p-AKT表达水平下调。(2)uPAg-KPI抗卵巢癌作用的体内实验中:(1)uPAg-KPI组裸鼠移植瘤的大小和重量均小于对照组。(2)比较叁组用药组抑瘤率,联合用药组高于顺铂组高于uPAg-KPI组(71.69%>45.14%>33.32%)。(3)在裸鼠终体重和生长状态观察对比中,顺铂组、顺铂联合uPAg-KPI组与对照组比,体重下降明显,以顺铂组为着;裸鼠生长状态观察中,顺铂及顺铂联合uPAg-KPI组裸鼠生长状态较差,uPAg-KPI组裸鼠一般状态未受影响。(4)uPAg-KPI组与对照组的免疫组化结果比较,uPAg-KPI组P-ERK、P-AKT、PCNA、VEGF蛋白表达降低。(3)uPAg-KPI对顺铂所致小鼠急性肾损伤的保护作用:(1)顺铂致小鼠急性肾损伤模型中,模型组与对照组比较,血清CRE、BUN显着升高,肾功能受损,造模成功。(2)在叁组不同剂量的uPAg-KPI用药组中,血清CRE与模型组均数明显降低,但并无统计学意义。大剂量uPAg-KPI组血清BUN较模型组明显降低,差异有统计学意义。(3)小鼠肾组织匀浆检测MDA、SOD、CAT、GSH-PX水平,uPAg-KPI各剂量组MDA含量均较模型组降低;SOD检测中,大剂量uPAg-KPI组中SOD含量较模型组升高;CAT检测中,各剂量组uPAg-KPI组中CAT含量较模型组升高;GSH-PX含量检测中,中剂量和大剂量uPAg-KPI组中GSH-PX含量较模型组升高。上述差异均有统计学意义。(4)肾脏组织HE染色后观察,uPAg-KPI可降低造模后肾脏炎症反应,管型减少,肾小管上皮细胞脱落、肿胀减轻。(4)uPAg-KPI对CCl4所致小鼠急性肝损伤的保护作用:(1)CCl4致小鼠急性肝损伤模型中,模型组与对照组比较,血清ALT,AST显着升高,肝功能受损,造模成功。(2)在叁组不同剂量的uPAg-KPI用药组中,大剂量uPAg-KPI组ALT与模型组比较,明显降低;AST结果中,中剂量和大剂量组较模型组AST降低,差异均有统计学意义。(3)小鼠肝组织匀浆检测MDA、SOD、CAT、GSH-PX水平,uPAg-KPI各剂量组MDA含量均较模型组降低;在SOD检测中,中剂量和大剂量uPAg-KPI组中SOD含量较模型组升高;CAT检测中,中剂量和大剂量uPAg-KPI组中CAT含量较模型组升高;GSH-PX含量检测中,中剂量和大剂量uPAg-KPI组中GSH-PX含量较模型组升高。上述差异均有统计学意义。(4)肝脏HE染色后观察,uPAg-KPI可降低造模后肝脏炎症反应,空泡变性和脂肪变减少,肝小叶结构变清晰、规则。结论:(1)uPAg-KPI对卵巢癌SKOV3细胞的增殖、侵袭、转移有抑制作用,该作用可能与阻滞细胞周期,干扰P-ERK、P-AKT相关信号通路有关。(2)uPAg-KPI对卵巢癌的体内实验有抑制作用,在与顺铂联合使用时,抑制作用增强。uPAg-KPI的抑制作用可能与下调P-ERK、P-AKT、PCNA、VEGF蛋白表达有关。uPAg-KPI与顺铂联合应用时,可能会改善顺铂毒、副作用。(3)uPAg-KPI能够改善顺铂所致的急性肾功能损伤,降低顺铂引起的肾小管扩张,蛋白管型的形成,炎细胞浸润和上皮细胞变性坏死。该保护功能与抗自由基损伤,降低脂质过氧化产物形成有关。(4)uPAg-KPI能够改善CCl4所致的急性肝功能损伤,降低CCl4引起的肝脏炎细胞浸润,肝细胞的变性、坏死。该保护功能与抗自由基损伤,降低脂质过氧化产物形成有关。
刘羿[8]2017年在《异丙酚通过SIRT1信号通路减轻肝脏缺血再灌注损伤》文中进行了进一步梳理背景与目的:异丙酚在多种器官中具有保护作用,包括肝脏。Sirt1是一种NAD+依赖的去乙酰化酶,具有抗炎和抗氧化作用,本研究的目的在于探讨异丙酚的肝保护作用是否与Sirt1蛋白有关。方法:小鼠应用异丙酚预处理后构建肝脏缺血再灌注损伤模型,通过评估肝功能、氧化应激水平、抗氧化能力、细胞因子表达量和细胞凋亡标志蛋白探讨异丙酚对肝脏缺血再灌注损伤的影响。并通过免疫组化和蛋白免疫印迹实验评估Sirt1表达量,通过蛋白免疫印迹实验评估NF-κb/p65、IκBα、Bcl-2和Bax的表达含量。结果:小鼠经过肝脏70%缺血再灌注手术后,给予异丙酚预处理能够减轻肝损伤、提升抗炎和抗氧化应激能力,以及减少肝细胞凋亡水平。另外,本研究还表明异丙酚通过介导Sirt1蛋白过表达和抑制NF-κB蛋白表达减轻肝脏缺血再灌注损伤。结论:本研究是首次证实异丙酚预处理能够通过调控Sirt1蛋白表达,增加抗炎和抗氧化应激能力,减轻肝脏缺血再灌注损伤。本研究表明异丙酚可能是减轻肝胆外科手术中肝缺血再灌注损伤的有效治疗策略。
侯嘉杰[9]2015年在《受体O型蛋白酪氨酸磷酸酶在肝细胞肝癌炎症/免疫微环境中的抑癌作用及机制研究》文中进行了进一步梳理1.雌激素效应性PTPRO的表达可通过制约STAT3通路抑制HCC进展受体O型蛋白酪氨酸磷酸酶(Protein tyrosine phosphatase receptor type O,PTPRO)是一种受体型的蛋白酪氨酸磷酸酶(phosphotyrosine phosphatases,PTP),最近在多种肿瘤中被报道具有抑癌蛋白的潜能,然而其具体抑癌效应及相关机制却仍属未知。值得我们关注的是,肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的发生及进展表现出显着的性别差异与炎性特征。在第一部分研究中,我们旨在探索并阐明PTPRO在HCC实质中的肿瘤生物学功能及相关机制。首先,我们检测了180例HCC临床标本(男性120例/女性60例),发现PTPRO在肿瘤组织中的表达水平显着低于癌旁组织,并且,在男性病例癌旁组织中的表达显着低于女性病例。我们发现雌激素受体α(estrogen receptor alpha,ERα)能够以转录因子的形式上调PTPRO的表达。接下来,通过使用HCC细胞系检测发现PTPRO过表达可明显抑制细胞增殖而促进细胞凋亡。在炎症相关性小鼠HCC模型中,我们发现PTPRO表达缺失可明显增加HCC的肿瘤数量与体积。进一步,我们发现PTPRO可通过抑制STAT3(signal transducer and activator of transcription 3)的活性来抑制HCC的发生及进展,而该关键信号的调控主要依赖于PTPRO对JAK2(Janus kinase 2)及PI3K(phosphoinositide 3-kinase)的去磷酸化作用。有意思的是,PTPRO也可通过去磷酸化同时造成c-Src通路的活化。由此可知,PTPRO的抑癌功能可归因于其对STAT3活性的制约,从而有效地阻断了炎症介导HCC发生及进展的信号转导。2.ptpro可通过对nf-κb的反馈性活化在肝脏iri过程中发挥双重作用当发现ptpro可抑制hcc进展之后,我们转而开始关注其在良性肝脏组织中的角色——如果ptpro同时抑制正常肝细胞的生存,则意味着它可能将促进肝切除术后急性肝脏衰竭的发生。肝部分切除是治疗早期肝脏恶性肿瘤最有效的手段之一。手术过程中,肝脏缺血再灌注损伤(ischemiareperfusioninjury,iri)是一项难以避免的临床事件。核因子-κb(nuclearfactor-κb,nf-κb)因其在肝细胞及巨噬细胞两种不同类型细胞中的表达及功能,在肝脏iri过程中起着“双刃剑”式的作用。同时,nf-κb在炎症介导肿瘤发生过程中亦扮演着不可或缺的角色。我们近期发现ptpro可有效活化c-src,而后者被认为是激活nf-κb的重要旁路。在第二部分研究中,我们旨在阐明肝脏iri过程中ptpro的表达变化、功能作用及分子机制。本研究招募了五例施行肝部分切除术的良性肝脏疾病患者作为志愿者,在术中获取其肝脏组织,检测ptpro的表达及活性变化。同时,使用野生型(wildtype,wt)及ptpro-/-c57bl/6小鼠构建肝脏ir模型,分析其肝脏功能及损伤的情况。相对应地,分离上述小鼠原代肝细胞及巨噬细胞,在体外予以过氧化氢或肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor,tnf-α)刺激,以探讨iri信号机制。在人及小鼠肝脏iri过程中,ptpro的表达水平于早期降低,而在后期升高或恢复正常。体外实验表明nf-κb可在此过程中调控ptpro的转录。通过ptpro-/-c57bl/6小鼠及其原代细胞,发现ptpro表达缺失可致肝脏iri损伤加重,而其炎症因子的表达却反常性地降低。ptpro缺失可同时造成肝细胞及巨噬细胞中nf-κb活性的减低,而这一点与其对c-src的去磷酸化活化作用有关。因此,ptpro在肝细胞中的表达起到了保护肝脏的效果,在巨噬细胞中的表达却促进了炎症反应。因而,ptpro可以正性反馈的形式在肝脏iri过程中调控nf-κb的活性,且扮演着双面性的角色。3.ptprot可在hcc微环境中维持t细胞介导的抗肿瘤免疫肿瘤浸润性t细胞对于肿瘤免疫而言具有极为关键的意义,尤其效应性t细胞(teffectorcells,teff)与调节性t细胞(regulatorytcells,treg)之间的平衡可直接影响肿瘤病人的预后。然而,在肿瘤微环境的潜移默化之下,t细胞很难履行其正常的抗肿瘤免疫职责。在第叁部分研究中,我们旨在探讨截短型PTPRO(truncated isoform of PTPRO,PTPROt)在T细胞介导肿瘤免疫中的重要角色。我们募集了70例HCC患者及30例健康志愿者进行临床分析,同时利用ptpro-/-C57BL/6小鼠及NOD/SCID小鼠构建皮下荷HCC模型探讨T细胞肿瘤免疫,并通过一系列体内外实验,分析了PTPROt介导T细胞增殖、活化与分化的机理。我们发现,在缺氧性HCC微环境的作用下,ptpro基因可受到缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)的抑制,从而在瘤内T细胞中显着表达下调;此外,PTPROt的表达水平与肿瘤浸润性Teff/Treg比率及临床病理表型呈高度相关。不仅如此,PTPROt缺失可削弱T细胞介导的肿瘤免疫,并显着地促进小鼠HCC的生长及进展。从机制上讲,PTPROt缺失可通过对Lck(lymphocyte specific tyrosine kinase)的去磷酸化作用降低Teff细胞的数量和功能,并可通过抑制STAT5(signal transducer and activator of transcription 5)活性而阻断Treg细胞的分化。PTPROt因其对Teff/Treg细胞稳态的支持作用,可在HCC微环境中有效地增强T细胞介导的抗肿瘤免疫。结论:经研究鉴定,我们发现PTPRO对于HCC而言是一个多效性的抑癌蛋白。它不仅可在肿瘤细胞及免疫微环境中发挥“双管齐下”的抑癌效应,亦可在炎性刺激或应激状态下保护正常肝脏组织的功能。
参考文献：
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[6]. 胃饲红景天水煎剂拮抗大鼠肝脏原位热缺血再灌注损伤的实验研究[D]. 马根顺. 昆明医学院. 2009
[7]. 新型融合蛋白uPAg-KPI对卵巢癌的抑制作用及器官功能保护的实验研究[D]. 赵丽苹. 吉林大学. 2016
[8]. 异丙酚通过SIRT1信号通路减轻肝脏缺血再灌注损伤[D]. 刘羿. 南昌大学. 2017
[9]. 受体O型蛋白酪氨酸磷酸酶在肝细胞肝癌炎症/免疫微环境中的抑癌作用及机制研究[D]. 侯嘉杰. 南京医科大学. 2015