木聚糖酶介导的木质纤维素水解与表面修饰及木聚糖荧光标记

论文摘要

木质纤维素生物转化仍存在生产成本高、转化效率低等技术问题。寻找有效途径缓解转化过程难易程度对于促进木质纤维素生物转化的商业化发展进程至关重要。本文借助木聚糖酶辅助催化优势,为当前木质纤维素生物转化所面临包括高效纤维纳米纤化、纤维素基复合材料酶法改性以及高底物浓度木质纤维素催化糖化等技术问题引入相关木聚糖酶辅助介导方式,以期更为高效、精准的实现木质纤维素向能源和高附加值材料的生物转化。同时,本文引入利用碳水化合物结合域（CBM）作为分子探针的构想,特异性量化并追踪纤维表面木聚糖,为今后木质纤维素生物转化提供一种简便、快速的生物诊断方法。论文取得的主要结果有:（1）实验采用木聚糖酶辅助葡聚糖酶催化方法分别预处理来自阔叶材和针叶材的漂白硫酸盐浆,意在进一步促进下游机械分离纤维纤维化效率。结果显示,葡聚糖酶与Biobrite木聚糖酶通过协同作用可有效打开/疏松阔叶材硫酸盐纸浆结构（Simons’染色值从45.5 mg/g纸浆增长到59.2 mg/g纸浆）,同时防止原料损失（木聚糖酶处理仅移除<7%的碳水化合物）,保证后续产物得率。以Biobrite辅助介导的酶法预处理方式极大地改善了下游纤维纤维化的难易程度。为后续制备更为高效复合酶制剂提供基础。（2）基于木聚糖酶可在不影响纤维素结构优势前提下选择性移除木质纤维素表面木聚糖的特点。实验采用木聚糖酶辅助策略评估木聚糖在再生纤维素/木聚糖复合材料中的结构作用,以及酶法选择性修饰复合材料表面技术的潜力。结果表明,木聚糖与纤维素组分在氢键的相互作用下可随机分布于复合膜表面,且这部分木聚糖对木聚糖酶的可及度很高,如采用2 mg/g和5 mg/g木聚糖酶处理后的样品可分别移除26.6%及32.3%的木聚糖。随着木聚糖的移除,复合膜表面产生纳米尺度的蚀刻现象（由SEM和AFM结果可知）,且这种表面粗糙度可通过操纵木聚糖酶负载方便调控。（3）为提高高底物浓度条件下木质纤维素降解速率,本研究引入一种嗜耐热木聚糖酶辅助的温度梯度式两阶段水解介导策略,即首先利用耐热木聚糖酶（Xyn10A）在高温条件下（85 oC）脱除木聚糖衣壳,然后再使用商业纤维素酶进行中温条件糖化。研究表明,高温木聚糖酶处理可显著提高纤维素对纤维素酶的可及性,降低底物粘度,且纤维表面更加趋于光滑。这种木聚糖酶辅助的两阶段水解方式有助于高固体浓度情况下的生物质解构。（4）木质纤维素的理化性质决定后续生物转化的难易程度,特异性定位和可视化其空间分布是至关重要的。本文克隆、表达来源于嗜耐热Xyn10A N端的木聚糖特异性结合域（N1-N2）,并探究其作为一种用于纤维素纤维表面木聚糖检测的热稳定分子探针的潜力。研究结果表明,N1-N2能够高度特异性的同木聚糖结合,而与其它底物无任何相互作用。采用N1-N2探针分别可视化商业漂白阔叶材（BHK,17.2%木聚糖）和针叶材（BSK,8.4%木聚糖）硫酸盐浆,可得到明显不同结合模式的荧光图像。本研究为今后更好理解木质纤维素生物转化过程提供一种新型生物诊断方法。

论文目录

致谢

摘要

abstract

第一章绪论

1.1 生物质的利用与开发现状

1.2 木质纤维素结构屏障

1.3 预处理

1.4 木聚糖酶辅助促进木质纤维素生物转化

1.4.1 木聚糖酶与葡聚糖酶的协同作用

1.4.2 木聚糖酶-GH10与GH11家族

1.4.3 极嗜耐热木聚糖酶

1.5 木质纤维素的酶加工-木聚糖酶辅助介导

1.5.1 生物酶预处理促进纤维纳米纤化程度

1.5.2 纤维素基材料的木聚糖酶法表面修饰

1.5.3 嗜耐热木聚糖酶辅助催化水解高底物浓度木质纤维素

1.5.4 碳水化合物结合域特异性定位木聚糖空间分布

1.6 立题背景及研究内容

第二章木聚糖酶辅助酶法预处理促进纤维纳米纤化程度

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.2.1 材料

2.2.2 商业木聚糖酶活性和酶学性质的测定

2.2.3 水合茚三酮法测蛋白浓度

2.2.4 酶法预处理和超声分离纤维素

2.2.5 预处理后纤维成分分析

2.2.6 保水值测定

2.2.7 Simons'染色法（SS）测定原料可及度

2.2.8 粘度法测量平均聚合度（DP）

2.2.9 X-射线（XRD）测定纤维结晶度

2.2.10 傅里叶变换红外光谱（FTIR）

2.2.11 扫描电子显微镜（SEM）

2.2.12 紫外分光光度计

2.3 结果与讨论

2.3.1 漂白硫酸盐浆化学组成及木聚糖酶酶学性质测定

2.3.2 不同酶法预处理对漂白阔叶材硫酸盐浆纤维化程度影响

2.3.3 不同酶法预处理对漂白针叶材硫酸盐浆纤维化程度影响

2.3.4 超声处理后漂白硫酸盐纸浆悬浮液的形态特征

2.4 结论

第三章木聚糖酶选择性修饰纤维素/木聚糖复合膜

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.2.1 材料

3.2.2 纤维素/木聚糖复合膜制备

3.2.3 纤维素/木聚糖复合膜的酶法和碱法处理

3.2.4 纤维素/木聚糖复合膜化学成分测定

3.2.5 复合膜透过率测试

3.2.6 复合膜机械性能测试

3.2.7 X-射线衍射分析

3.2.8 傅里叶变换红外光谱（FTIR）

3.2.9 复合膜形貌特征观察

3.3 结果与讨论

3.3.1 木聚糖含量对纤维素/木聚糖复合膜理化性能的影响

3.3.2 纤维素/木聚糖复合膜的酶法改性

3.3.3 纤维素与木聚糖成膜过程中可能的相互作用

3.4 结论

第四章嗜耐热木聚糖酶辅助两阶段水解高浓度木质纤维素

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.2.1 材料

4.2.2 重组木聚糖酶Xyn10A纯化

4.2.3 木聚糖酶辅助的酶水解研究

4.2.4 糖和木聚糖酶活性测定

4.2.5 保水值（WRV）

4.2.6 Simons'染色（SS）

4.2.7 扫描电子显微镜（SEM）观察

4.2.8 粘度测定

4.3 结果与讨论

4.3.1 不同生物酶预处理方式对纤维素水解得率的影响

4.3.2 木聚糖酶预处理对底物理化性质的影响

4.3.3 两步法水解10%（w/w）固体浓度商业木质纤维素

4.4 结论

第五章木聚糖酶分子探针对木质纤维表面木聚糖的特异性标记

5.1 前言

5.2 材料与方法

5.2.1 数据库中N端非催化域的筛选及序列比对

5.2.2 材料及表达载体的构建

5.2.3 重组蛋白表达和纯化

5.2.4 重组蛋白对不溶性多糖结合能力的测定

5.2.5 重组蛋白对可溶性多糖结合能力的测定

5.2.6 等温滴定量热法测定目的蛋白对寡糖亲和能力

5.2.7 重组蛋白热稳定性的测量

5.2.8 CBM荧光探针可视化追踪漂白硫酸盐浆上木聚糖

5.2.9 共聚焦拉曼显微镜可视化漂白硫酸盐浆上木聚糖的分布

5.3 结果与讨论

5.3.1 Xyn10A N端序列分析

5.3.2 Xyn10A N端结合域特异性的测定

5.3.3 温度对N1和N1-N2重组蛋白吸附性能的影响

5.3.4 分布在漂白硫酸盐纸浆上的N1-N2探针共聚焦成像

5.4 结论

第六章全文总结

参考文献

攻读学位期间发表学术论文

文章来源

类型: 博士论文

作者: 龙凌凤

导师: 王飞

关键词: 木聚糖酶,木质纤维素生物转化,纤维素基材料,催化糖化,木聚糖荧光探针

来源: 南京林业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,化学,有机化工

单位: 南京林业大学

分类号: Q55;TQ353;O657.3

DOI: 10.27242/d.cnki.gnjlu.2019.000006

总页数: 107

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木聚糖酶介导的木质纤维素水解与表面修饰及木聚糖荧光标记

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