导读:本文包含了脑啡肽论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:阿片,蛋氨酸,受体,细胞,免疫调节,钉螺,额叶。
脑啡肽论文文献综述
张克莹[1]（2019）在《蛋氨酸脑啡肽通过IL-33/ST2通路影响2型糖尿病免疫发病机制的研究》一文中研究指出目的:2型糖尿病(T2DM)的发病率和死亡率居世界前十。免疫系统在T2DM的炎症、胰岛素抵抗和胰岛β细胞损伤过程中起着重要的病理作用。蛋氨酸脑啡肽(MENK)存在于胰腺内分泌细胞中,被认为是免疫系统和神经内分泌系统之间的重要介质。因此它可能在调节胰岛细胞的胰岛素分泌方面发挥作用。本研究的目的是研究MENK对T2DM大鼠和INS-1细胞在体内和体外的血糖和血清胰岛素水平中的作用。方法:建立T2DM大鼠模型,分组予MENK处理及MENK+纳曲酮(NTX)处理,HE染色胰腺组织;IHC染色胰腺组织内阿片受体;诱导大鼠INS-1细胞损伤模型;GSIS实验评估细胞的功能损伤;ELISA法检测细胞因子含量;PCR及Western blot方法检测分子的表达量;结果:MENK显着降低T2DM大鼠的血糖水平,提高血清胰岛素浓度。MENK增加了血清细胞因子IL-5和IL-10的水平,同时降低了TNF-α和IL-2的水平。我们进一步证实MENK通过上调阿片受体表达和调节IL-33/ST2、MyD88-TRAF6-NF-κB p65信号通路达到调节葡萄糖代谢的作用。结论:腹腔注射MENK是治疗T2DM的一种潜在的新方法。(本文来源于《第十二次全国中西医结合内分泌代谢病学术大会暨糖尿病、甲状腺疾病高峰论坛论文资料汇编》期刊2019-09-06）
张克莹[2]（2019）在《蛋氨酸脑啡肽通过IL-33/ST2通路影响2型糖尿病免疫发病机制的研究》一文中研究指出2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)的发病率和死亡率居世界前十,常伴有心脑血管疾病、失明、截肢等并发症而导致残疾,在全球范围内构成了严重的健康和经济挑战~([1])。据中国一项调查资料显示,2013年我国成年人糖尿病标化患病率高达10.9%,其中T2DM比例达到90%以上~([2])。另外一项在全球范围内的研究估计,在2013年中国有0.984亿的成年人患糖尿病,到2035年将达到1.427亿人,中国已成为糖尿病患者人数最多的国家~([3])。因此,迫切需要制定控制疾病发生发展的方法。免疫系统与全身代谢的双向作用多年来已被公认,免疫失衡-代谢负荷在T2DM的胰岛素抵抗(Iusulin resistance,IR)和胰岛β细胞损伤中的作用也逐渐得到重视~([4,5]),免疫代谢是目前癌症、糖尿病和肥胖等多种疾病的一种新的治疗靶点。此外,一项重要的研究明确了炎症信号通路与糖代谢的关系,T2DM作为一种慢性炎症性疾病得到广泛认可~([6])。T2DM是先天免疫系统普遍激活的结果,其中也存在着细胞因子介导的慢性炎症~([7,8])。因此可以看出,免疫系统和炎症机制都参与了T2DM的发生和发展。大量证据表明内源性阿片肽和阿片结合位点在包括人类在内的多种动物的内分泌腺体胰腺中均有表达~([9,10]),内源性阿片肽通过与阿片受体结合来发挥作用,提示这些肽也可能在胰腺的分泌调节中发挥作用,从而影响糖代谢。蛋氨酸脑啡肽(Methionine enkephalin,MENK)是一种由五个氨基酸tyr-ala-ala-pheo-met组成的内源性阿片肽,由前脑啡肽衍生而来。已有研究表明MENK是免疫和神经内分泌系统之间的重要中介,通过与阿片类受体delta(d-,DOR),kappa(k-,KOR)和mu(m-,MOR)结合来调节先天和适应性免疫~([11])。MENK是一种免疫调节因子,可调控树突状细胞、巨噬细胞和CD4~+T淋巴细胞,以及活化和调节上皮细胞及间充质细胞~([12-16])。自身免疫性慢性炎性疾病的发生发展近年来被认为是因为激活了自身反应性CD4~+T辅助细胞(T helper cell,Th)~([17,18])。目前已知幼稚Th0细胞在细胞因子的影响下可以分化为特定的Th细胞亚群,如Th1、Th2、Th17、Th22和Treg等~([19])。Th1细胞可以产生促炎细胞因子,如IFN-γ、TNF-a、IL-2等,支持细胞免疫,促进炎症反应、细胞毒性反应和迟发性超敏反应。Th2细胞可以分泌抗炎细胞因子,如IL-4、IL-5、IL-10和IL-13等,支持体液免疫,下调Th1细胞支持的炎症反应~([20-22]),Th1/Th2细胞比例平衡对维持机体免疫稳态具有重要意义。最近的研究表明胰岛间充质细胞来源的IL-33在胰岛中能够协调免疫与代谢之间的相互作用,当处于糖尿病环境(葡萄糖、IL-1β和棕榈酸刺激)时胰岛间充质细胞产生IL-33明显加强~([23])。II型固有淋巴样细胞(Group II innate lymphoid cells,ILC2s)是连接先天性免疫与适应性免疫应答间的细胞,其作为二者间的桥梁被认为是第一个激活Th2型细胞免疫反应的细胞,能够强化机体免疫反应,延缓适应性免疫应答的启动~([24])。研究还发现IL-33在胰岛内的反应细胞为ILC2s,IL-33可以与ILC2s表面的ST2结合诱导Th2反应、促进胰岛素分泌~([23]),这样就把胰岛细胞中的免疫和代谢协调起来。IL-33/ST2通路可以防止不适当的、特异性的Th1极化反应,并诱导IL-4和IL-13的产生,由此维持Th2细胞的极化状态。而ILC2s除了产生IL-4和IL-13外还可以分泌MENK,体外实验发现IL-33可以刺激ILC2s使MENK分泌增多~([24])。Toll样受体(TLR)信号通路通过髓样分化因子88(MyD88)和TNF受体相关因子(TRAF)起作用,激活核转录因子-κB(NF-κB)p65,促进细胞因子分泌和炎症反应~([25]),而有研究表明ST2可能是Toll样受体(TLR)信号传导的一个强有力的负调控因子,ST2在树突状细胞的表达上调可增加对促炎、刺激诱导成熟的耐受性~([26])。所以MENK可能通过上述途径调节糖代谢,然而到目前为止关于MENK对糖尿病的影响研究很少。目的:研究MENK对T2DM大鼠血糖和胰岛素分泌的影响及高糖高脂诱导损伤的大鼠INS-1细胞胰岛素分泌的作用;进一步探讨MENK的可能作用机制,研究MENK是否通过与阿片受体结合发挥调节免疫作用,并检测MENK对相关免疫学指标Th1和Th2的影响,分析MENK通过影响IL33/ST2通路发挥调节炎症信号通路的作用,从而阐明MENK对T2DM作用的分子机制,为T2DM的治疗提供新的思路和理论依据。本研究分如下叁部分进行:第一部分:2型糖尿病与炎症及免疫异常关系的研究。第二部分:蛋氨酸脑啡肽对2型糖尿病炎症及免疫异常干预效应的研究。第叁部分:IL-33/ST2通路在蛋氨酸脑啡肽调节2型糖尿病炎症及免疫异常中作用的研究。研究方法:1、高糖高脂饮食喂养联合小剂量链脲佐菌素(STZ)腹腔注射法建立T2DM大鼠模型;2、正常大鼠及T2DM大鼠再随机分为对照组,MENK处理组及MENK+纳曲酮(NTX)处理组;3、记录大鼠体重,血糖仪测定大鼠尾静脉血糖;4、苏木素-伊红(HE)染色大鼠胰腺组织研究病理变化;5、免疫组织化学(IHC)染色法研究胰腺组织内叁种阿片受体表达部位及表达含量;6、高糖高脂培养诱导大鼠INS-1细胞的体外β细胞损伤模型,并将细胞分组培养于加入MENK及NTX的培养基中;7、葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)实验评估高糖高脂培养对INS-1细胞的功能损伤;8、酶联免疫吸附实验(ELISA)检测大鼠血清及INS-1细胞培养上清液中胰岛素、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-2、IL-5和IL-10含量;9、实时荧光定量聚合酶链反应(real-time RT-PCR)检测大鼠胰腺组织及INS-1细胞内DOR、MOR和KOR叁种阿片受体、IL33/ST2及TLR通路相关分子-MyD88、TRAF6及NF-κB p65的基因表达量;10、Western blot方法检测大鼠胰腺组织及INS-1细胞内DOR、MOR和KOR叁种阿片受体、IL33/ST2及TLR通路相关分子-MyD88、TRAF6及NF-κB p65的蛋白表达量。结果:1、MENK对大鼠的作用1.1高糖高脂喂养联合小剂量STZ腹腔注射可成功建立T2DM大鼠模型,T2DM大鼠的血糖升高达到模型标准,多尿、多饮、多食及体重下降的典型糖尿病症状明显,血清胰岛素水平较正常组下降;应用不同剂量MENK腹腔注射均能降低T2DM大鼠的血糖水平,增加血清胰岛素水平,同时可改善T2DM引起的体重下降,差异具有统计学意义。1.2 MENK对大鼠胰腺组织形态学的影响:胰腺组织HE染色结果发现,正常大鼠胰腺中可以观察到成团的胰岛β细胞,β细胞的大小一致,核染色质清晰,具有清晰的细胞质边界和清晰的结缔组织。与正常大鼠相比,T2DM大鼠胰岛β细胞分布稀疏且不均匀,数量减少,形态不一,细胞质的界限模糊;MENK处理后的T2DM大鼠的胰岛β细胞数量明显增加,边缘较圆,细胞质稍不均匀,核仁清晰,细胞排列均匀,MENK干预可改善胰腺组织形态,维持其正常功能。1.3阿片受体在大鼠胰腺中的表达:通过IHC染色看出阿片受体DOR、MOR和KOR均在胰腺组织内表达,其中KOR的表达含量很低。结合IHC染色、real-time RT-PCR及Western blot的结果,T2DM大鼠胰腺阿片受体含量较正常大鼠减少,MENK可增加T2DM大鼠阿片受体表达,差异有统计学意义。1.4 T2DM大鼠胰腺内IL-33/ST2通路及TLR通路相关分子-MyD88、TRAF6及NF-κB p65的表达量均较正常大鼠增加;MENK干预减少了T2DM大鼠胰腺内上述分子的表达量。1.5 T2DM大鼠血清中存在明显的Th1/Th2细胞因子平衡紊乱,表现为Th1型细胞因子TNF-a及IL-2升高,而Th2型细胞因子IL-5及IL-10降低;MENK可通过降低血清中TNF-a及IL-2含量及增加IL-5及IL-10的含量来调节Th1/Th2细胞因子的平衡。2、MENK对大鼠INS-1胰岛β细胞瘤细胞的作用2.1高糖高脂培养INS-1细胞后形成明显的糖脂毒性,细胞数量减少,胰岛素分泌量下降;MENK共培养后能够增加细胞数量、改善细胞形态、增加胰岛素分泌量。GSIS实验同样证实MENK可以改善糖脂毒性造成的INS-1细胞胰岛素储备分泌障碍。2.2 MENK可增加高糖高脂培养的INS-1细胞中阿片类受体的表达水平;下调IL-33/ST2通路及TLR通路相关分子-MyD88、TRAF6及NF-κB p65的表达量;MENK可明显调节INS-1细胞分泌的Th1/Th2细胞因子的平衡;以上结果与体内实验结果趋势相符。结论:MENK可通过与阿片类受体结合进而调节免疫反应和抑制炎症反应,达到降低血糖、刺激胰岛分泌胰岛素的作用,MENK可能作为一种治疗T2DM的新方法及辅助其他降糖治疗的手段发挥临床应用潜力。(本文来源于《中国医科大学》期刊2019-03-01）
耿金[3]（2019）在《蛋氨酸脑啡肽对荷瘤小鼠髓样抑制细胞调节作用的研究》一文中研究指出目的:髓样抑制细胞(myeloid derived suppressor cells,MDSCs)是指髓系来源的、未成熟的、对T细胞介导的免疫应答具有抑制作用的一群异质细胞。MDSCs细胞可抑制机体免疫细胞发挥正常固有性免疫和特异性免疫,使免疫细胞处于无应答或者耐受状态而不能及时清除变异的癌前细胞,失去杀伤肿瘤细胞的能力。MDSCs细胞还通过非免疫机制如促进肿瘤新生血管形成、肿瘤细胞侵袭及转移,参与调节肿瘤的生物学行为。MDSCs细胞对于肿瘤及其他疾病的负向调节作用得到了越来越多的重视,调控MDSCs细胞及其免疫抑制功能可能是一种潜在的癌症治疗方法。蛋氨酸脑啡肽(Methionine enkephalin,MENK)是一种由五个氨基酸残基组成的内源性阿片肽,具有自分泌旁分泌特点,广泛存在于神经内分泌系统。MENK具有显着的免疫调节作用及抗肿瘤作用。通过调控阿片受体表达与阿片受体结合,MENK可诱导肿瘤细胞周期阻滞,诱导细胞凋亡,对多种肿瘤如黑色素瘤,脑胶质瘤,肺癌及胃癌等产生抗肿瘤作用。MENK也可以通过对免疫系统细胞产生免疫调节作用,直接增强免疫系统细胞对肿瘤细胞的杀伤作用或改变肿瘤微环境进而发挥抗肿瘤作用。我们前期对MENK的免疫调节作用进行了系统研究,证实了MENK对T细胞,巨噬细胞,NK细胞及DC细胞均有调节作用,但是MENK对于MDSCs细胞的调控作用及机制尚未明确,需进一步论证。我们通过MENK作用于荷瘤小鼠脾脏及骨髓MDSCs细胞体外实验及MENK作用于s180肉瘤荷瘤小鼠体内实验的研究,探讨MENK对MDSCs细胞的免疫调节功能及作用机制,完善MENK免疫调节作用网络。实验方法:本研究分别通过体外实验和体内实验探讨MENK对荷瘤小鼠MDSCs细胞的调控作用。体外实验中采用8-10周雌性C57BL/6J小鼠,通过双侧腋皮下注射腹水瘤细胞建立荷瘤小鼠模型,应用流式细胞术检测荷瘤小鼠与正常小鼠各器官中MDSCs细胞分布情况;免疫磁珠阳性分选荷瘤小鼠脾脏及骨髓的髓样抑制细胞,体外培养并分别给予不同剂量MENK刺激,应用CCK8法检测MDSCs细胞增殖及活性,确定体外实验最佳浓度;分别采用MENK及MENK联合阿片受体阻断剂纳曲酮(Naltrexone,NTX)刺激体外培养的骨髓及脾脏来源的MDSCs细胞进行后续实验研究:应用流式细胞分析技术分别检测各组MDSCs细胞中ROS含量,应用RT-qPCR技术检测MDSCs细胞μ和δ阿片受体mRNA表达水平,应用ELISA法检测MDSCs细胞上清分泌细胞因子IL-1β,IL-4,IL-6,IL-10及TGF-β1水平。体内实验中建立与体外实验相同的荷瘤小鼠模型,经MENK或MENK联合NTX连续腹腔注射治疗14天后,检测荷瘤小鼠肿瘤体积、重量变化;伊红-苏木精染色观察肿瘤组织形态学变化;免疫组织化学法分别检测肿瘤组织中CD11b+细胞及Gr-1+细胞表达情况;ELISA法检测小鼠血清中细胞因子IL-1β,IL-4,IL-6,IL-10及TGF-β1变化;免疫磁珠阳性分选治疗后的荷瘤小鼠MDSCs细胞,应用流式细胞术检测荷瘤小鼠脾脏和骨髓MDSCs细胞及其亚群比例变化;RT-qPCR法检测MDSCs细胞阿片受体MOR和DOR基因表达水平,检测MDSCs细胞免疫抑制功能相关分子Arg-1、iNOS的mRNA表达水平,检测MDSCs细胞中基因Ets-1,sted1b的mRNA表达水平。实验结果:1、与正常小鼠相比,荷瘤小鼠免疫器官中MDSCs细胞含量及比例增加。流式细胞术分析结果显示正常小鼠脾脏和外周血MDSCs细胞含量及比例低于荷瘤小鼠(P<0.01),荷瘤小鼠器官中MDSCs细胞所占比例由高至低依次为:骨髓、外周血、肿瘤组织、脾脏、淋巴结和胸腺。2、经免疫磁珠阳性分选总体MDSCs细胞及其亚群细胞纯度均显着提高,脾脏来源MDSCs细胞纯度>80%,骨髓来源MDSCs细胞纯度>90%。3、MENK对体外培养MDSCs细胞增殖的抑制作用呈剂量依赖性,最佳浓度为1.25mg/ml。4、与对照组相比MENK降低脾脏来源MDSCs细胞中ROS的含量(P<0.05),骨髓来源MDSCs细胞中ROS含量呈下降趋势。5、与对照组相比MENK上调MDSCs细胞MOR和DOR基因表达水平(P<0.01),NTX可阻断此效应。6、MENK促进脾脏来源MDSCs细胞分泌IL-4(P<0.05),促进骨髓来源MDSCs分泌IL-6(P<0.05),其他细胞因子未表现出显着变化。7、经MENK腹腔注射治疗后,荷瘤小鼠肿瘤及体积均显着降低(P<0.05),H-E染色结果显示与对照组相比MENK组在肿瘤组织交界处淋巴细胞侵润明显增加增加;免疫组织化学染色结果显示荷瘤小鼠肿瘤组织中,经MENK治疗后Gr-1阳性细胞与其他两组相比减少,CD11b阳性细胞在叁组间无明显变化。8、ELISA结果显示经MENK治疗后荷瘤小鼠血清中TGF-β1下降,IL-4、IL-6及IL-10含量增加(P<0.05)。9、MENK显着下调荷瘤小鼠脾脏中总体MDSCs细胞比例(P<0.05),降低PMN-MDSCs比例(P<0.01),增加M-MDSCs比例(P<0.05),骨髓中MDSCs细胞及其两个亚群所占比例均呈下降趋势。10、MENK提高MDSCs细胞中Arg-1基因表达水平,下降iNOS基因表达水平(P<0.05);MENK下调MDSCs细胞中setd1b及Ets-1基因表达水平(P<0.01)。11、MENK体内治疗上调MDSCs细胞MOR和DOR基因表达水平(P<0.01),在脾脏中NTX可完全阻断这种作用(P<0.01)。结论:1、肿瘤发生环境中,小鼠各免疫器官中MDSCs细胞增多。2、MENK对荷瘤小鼠MDSCs细胞具有负向调节作用,抑制MDSCs细胞增殖,降低荷瘤小鼠脾脏及骨髓中MDSCs细胞比例,削弱MDSCs细胞的免疫抑制功能同时抑制肿瘤增长。3、MENK对MDSCs细胞两个主要亚群的具有不同调节作用,MENK主要通过降低荷瘤小鼠脾脏中PMN-MDSCs亚群比例,降低总体MDSCs细胞比例。4、MENK可能通过MDSCs细胞中μ和δ阿片受体结合,影响MDSCs细胞中Ets-1及setd1b基因表达,干扰MDSCs细胞的免疫抑制功能。(本文来源于《中国医科大学》期刊2019-03-01）
卫向红,谭苹,万京桦,孙炎斌,乐诗文[4]（2019）在《脑啡肽对湖北钉螺血淋巴细胞的影响》一文中研究指出为观察脑啡肽(MENK)对湖北钉螺血淋巴细胞吞噬力的影响,将湖北钉螺软体组织挤压后获取钉螺血淋巴液,设9个实验组:钉螺血淋巴液对照组(A组)、 MENK溶剂组(B组)、钉螺血淋巴液+1 mg/L MENK组(C组)、钉螺血淋巴液+5 mg/L MENK组(D组)、钉螺血淋巴液+10 mg/L MENK组(E组)、钉螺血淋巴液+醛化绵羊红细胞组(F组)、钉螺血淋巴液+醛化绵羊红细胞+1 mg/L MENK组(G组)、钉螺血淋巴液+醛化绵羊红细胞+5 mg/L MENK组(H组)、钉螺血淋巴液+醛化绵羊红细胞+10 mg/L MENK组(I组)。将各组同时置25℃室温下孵育60 min后制成玻片涂片,经吖啶橙染色,于荧光显微镜下观察并统计各组不同形态类型的钉螺血淋巴细胞数。结果显示:钉螺血淋巴细胞中的伸展细胞可以直接吞噬异物(醛化绵羊红细胞); C、 G组(1 mg/L MENK组)伸展细胞的比率分别上升至48.77%(1 323/2 713)和48.30%(1 337/2 768),明显高于A组的39.99%(1 072/2 681),差异具有统计学意义P <0.01),而D、 H组(5 mg/L MENK组)和E、 I组(10 mg/L MENK组)的伸展细胞比率则分别下降至27.04%(706/2 611)、 26.29%(665/2 529)、 19.23%(422/2 194)和18.3%(414/2 262),与A组相比差异有统计学意义(P <0.01); G组(1 mg/L MENK组)对异物的吞噬率升高至48.77%(652/1 337),而H、 I两组对异物的吞噬率分别下降至7.37%(49/665)和5.8%(24/414),均与F组吞噬率40.09%(352/878)的差异具有统计学意义(P <0.01)。提示不同浓度MENK对钉螺血淋巴细胞的吞噬力有明显地促进或抑制作用。(本文来源于《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》期刊2019年02期）
王晓楠[5]（2019）在《蛋氨酸脑啡肽（MENK）通过阿片受体（OGFr）抑制胃癌恶性生物学行为的作用及机制研究》一文中研究指出目的:胃癌是起源于胃黏膜上皮的恶性消化道肿瘤,是世界上最常见的恶性肿瘤之一,在我国各种恶性肿瘤中发病率居首位,在全球癌症患者死亡率中高居第叁位。现今,外科手术仍然是胃癌的主要治疗手段,但胃癌的总体治疗模式已经发生了显着的改变,从以解剖学为基础的手术治疗慢慢走向以解剖学、肿瘤生物学及免疫学为基础的联合规范化手术和围手术期辅助治疗的综合治疗模式。蛋氨酸脑啡肽(MENK)是阿片类物质受体的内源性配基,是一种由肾上腺产生的前激素和前脑啡肽衍生而来的内源性阿片样物质物质,其结构为酪-甘-甘-苯丙-蛋氨酸五个氨基酸构成的五肽,无药物依赖性和种属特异性。对MENK的早期研究主要集中在作为镇痛剂和神经递质方面的功能。直至八十年代初Wybran证明神经系统与免疫系统的联系后,其免疫调控方面的研究才有了较快发展。阿片受体在免疫系统细胞中均有表达,包括:树突状细胞、单核细胞(巨噬细胞)、T淋巴细胞、自然杀伤细胞、嗜酸性/嗜碱性粒细胞和中性粒细胞。一些肿瘤细胞如:胰腺癌细胞核膜表面和肠癌细胞表面也存在类阿片受体。研究证明,适宜浓度的MENK结合免疫细胞阿片受体后,可以作为内源性免疫系统调节的信使,在免疫系统和中枢神经系统之间起桥梁作用,并具有显着的免疫调节作用。除此之外,一系列的体内和体外研究发现,MENK除具有免疫调节信使的作用外,还可直接作用于癌细胞阿片受体,起到抑制肿瘤生长。我们课题组前期研究证实MENK可以通过诱导细胞凋亡和阻滞细胞周期在G0/G1期来抑制人类黑素瘤癌细胞的体外增殖。MENK这种既能直接抑制肿瘤又能通过调控免疫反应抑制肿瘤生长的独特的作用方式,为其成为新型抗癌药物提供了绝对优势。那么,MENK对胃癌是否同样具有抑制作用?是如何直接抑制肿瘤生长的?其具体作用机制如何?研究方法:1、体外,qRT-PCR法检测各胃癌细胞系(AGS、BGC823、SGC7901、HGC27、MGC803、MKN45)中是否表达OGFr以及表达量的多少,选择表达量相对高的细胞系进行后续的实验检测。体外,用不同浓度的MENK(0、0.5、1、2、5、10、12.5 mg/mL)分别作用于人胃癌细胞HGC27和SGC7901 24,48,72,96 h;同时,用相同浓度的MENK作用于人正常胃粘膜上皮细胞GES-1 24,48 h,采用CCK-8试剂盒检测MENK的抑制效果。选出MENK合适的作用时间和作用剂量进行后续的胃癌细胞功能学实验。2、体外,5 mg/mL MENK作用于HGC27和SGC7901细胞48h后,行以下实验检测:与空白对照组比较,光学显微镜观察胃癌细胞的形态改变;克隆形成实验检测胃癌细胞的增殖能力改变;流式细胞术检测胃癌细胞的周期改变和细胞凋亡情况;Hoechst 33258染色法观察细胞凋亡形态;Transwell和细胞划痕实验检测胃癌细胞迁移和侵袭情况。之后,收集空白组和MENK给药组的两种胃癌细胞,提取mRNA和蛋白,qRT-PCR法检测OGFr、Ki67、Bax、BCL-2、MMP-2、MMP-9的mRNA表达改变,Western blot法检测OGFr、Bax、BCL-2的蛋白表达改变。3、体内,构建人胃癌裸鼠皮下移植瘤模型。裸鼠头颈部皮下接种SGC7901细胞,成瘤后,将裸鼠随机分成两组:MENK给药组(5 mg、8 mg、10 mg/2d)和阴性对照组(NS)。每日观察裸鼠生命体征,动态监测裸鼠体重和皮下瘤体积变化。22天后颈椎脱臼处死裸鼠,剥离皮下肿瘤称重。制备皮下移植瘤石蜡切片,做以下检测:HE检测组织病理,免疫组化检测组织内OGFr和Ki67表达,TUNEL法检测组织凋亡改变。同时,免疫组化检测皮下瘤组织中肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)表面标志F4/80、CD64、CD206和分泌性细胞因子TNF-α、IL-10的表达水平。另外,构建人胃癌裸鼠尾静脉转移模型,将裸鼠随机分成两组:MENK给药组(8 mg/mL,次/2d)和阴性对照组(NS)。治疗2个月后颈椎脱臼处死裸鼠,解剖取肺和肝脏,观察表面肿瘤转移灶个数。4、信号通路研究:进一步将OGFr沉默,观察MENK对胃癌的抑制作用是否减弱或消失,探讨MENK是否通过OGFr抑制胃癌。利用siRNA脂质体瞬转法,qRT-PCR检测沉默效果,筛选出有效序列。将OGFr-siRNA有效序列包成慢病毒,构建OGFr稳定沉默的人胃癌细胞株。之后,将细胞分成叁组,包括si-NC组、si-NC+MENK组、si-OGFr+MENK组,常规检测MENK对胃癌细胞克隆形成和凋亡的影响。qRT-PCR检测Bax、BCL-2、Caspase-3、PARP、Ki67、Cyclin D1、c-myc、survivin、MMP-2、MMP-9的mRNA水平;Western Blot检测Bax、BCL-2、Caspase-3、PARP、PI3K、AKT、p-AKT、mTOR蛋白表达水平。结果:1、体外,大多数胃癌细胞系普遍存在OGFr的表达,选取表达相对较高的HGC27和SGC7901细胞开展后续实验。体外,MENK可显着抑制HGC27和SGC7901细胞的增殖,具有浓度依赖性和时间依赖性,并且对人正常胃粘膜上皮细胞GES-1无明显抑制作用。MENK作用后,HGC27和SGC7901细胞形态由多角鹅卵石形变成条梭状,粘附力变低,细胞数量减少,伴有细胞克隆数量减少;阻滞细胞周期在G0/G1期;诱导胃癌细胞发生凋亡;抑制胃癌细胞的迁移和侵袭。MENK可上调HGC27和SGC7901细胞中OGFr的表达。MENK作用后,mRNA水平,Ki67表达下调,Bax上调,BCL-2下调,MMP-9下调,MMP-2改变不显着;同时,MENK上调Bax蛋白表达,下调BCL-2蛋白表达。2、MENK可抑制人胃癌裸鼠皮下移植瘤的生长。MENK治疗后,胃癌皮下瘤体积明显减小,瘤重明显减轻,裸鼠体重无明显变化。病理组织学检测发现,MENK治疗组移植瘤中央区域出现大面积坏死,伴有凋亡,核浓染固缩;相对地,空白组移植瘤中细胞形态整齐,排列紧密,有小量分散的坏死区域。表明MENK可通过诱导移植瘤细胞凋亡来减慢裸鼠SGC7901移植瘤的生长,TUNEL分析法进一步证实这一结论。另外,MENK对尾静脉模型中胃癌肝转移有较为明显的抑制作用;对肺转移的影响还需要增大样本量,进一步重复实验来最终确定。免疫组化检测结果显示,移植瘤胃癌组织中有OGFr的表达,并且MENK可上调OGFr表达水平。MENK下调Ki67的表达水平,这与体外实验结果保持一致。3、体内,MENK通过诱导TAMs由M2向M1极化发挥抑制胃癌作用。在MENK治疗组的移植瘤组织中,TAMs表达CD64的比例显着增加,CD206阳性细胞比例降低。同时,MENK治疗组,M1型相关细胞因子TNF-α的表达增加,M2型相关细胞因子IL-10的表达减少。数据表明,在MENK治疗组肿瘤中TAMs的浸润程度较高,MENK可能通过诱导TAMs由M2向M1表型转化,增强TAMs的抗肿瘤活性,发挥抑制胃癌的作用。4、OGFr沉默后,MENK对人胃癌细胞HGC27和SGC7901增殖的抑制作用明显减弱,MENK诱导人胃癌细胞凋亡的作用被逆转。MENK可降低胃癌细胞中周期相关基因Ki67、cyclin D1、c-myc的mRNA表达水平,OGFr沉默后此作用明显减弱。MENK可下调凋亡相关基因BCL-2的mRNA和蛋白水平,同时可上调Bax和Caspase-3的mRNA和蛋白水平和PARP的蛋白表达。MENK作用显着降低survivin的mRNA水平。另外,MENK可下调PI3K/AKT/mTOR通路中PI3K、p-AKT、mTOR蛋白表达。OGFr沉默后以上作用均明显减弱。结论:1、体内外实验均证实,MENK在合适的作用剂量下具有显着抑制胃癌的作用。2、MENK可通过阻滞细胞周期,诱导细胞凋亡,抑制细胞迁移和侵袭,以及可能通过诱导TAMs由M2向M1表型转化,增强TAMs的抗肿瘤活性,发挥抑制胃癌作用。3、多数人胃癌细胞系中存在阿片受体OGFr的不同表达。MENK可显着上调胃癌细胞中OGFr的表达水平。MENK通过结合OGFr后触发抗肿瘤机制。4、MENK可通过下调cyclin D1、c-myc的mRNA表达来诱导人胃癌细胞细胞周期阻滞在G0/G1期。5、MENK可通过调控BCL-2/Bax/caspase-3/PARP信号通路诱导凋亡发生,发挥抑制胃癌作用。6、MENK可通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路发挥抑制胃癌作用。(本文来源于《中国医科大学》期刊2019-02-01）
焦雪[6]（2019）在《蛋氨酸脑啡肽通过阿片受体调节CD8~+ T细胞活性机理的研究》一文中研究指出目的:体外实验主要研究MENK通过调控阿片受体亚基对CD8~+ T细胞功能的影响。体内实验主要研究MENK对C57BL/6荷瘤小鼠脾中CD8~+ T细胞转录组的影响,以及对lncRNA及mRNA的差异基因表达的影响,并对差异表达基因进行富集分析,找出MENK调控CD8~+ T细胞的信号通路。研究方法:1.体外实验采用阴性富集法分离纯化C57BL/6小鼠脾脏CD8~+ T细胞,在RNA和蛋白水平分别采用real-time PCR和western blot检测MENK对CD8~+ T细胞的MOR和DOR表达的影响。在MENK的作用剂量上我们选择了0、10~-77 M、10~-88 M、10~-99 M、10~-1010 M、10~-1111 M。为了阻断μ受体的表达,我们选择了μ受体选择性阻断剂CTAP进行后续实验,分别采用0、4.5μM、450 nM、45 nM、4.5 nM对活化的CD8~+ T细胞加药培养48 h,之后分别采用real-time PCR和western blot对MOR和DOR的RNA和蛋白表达水平进行检测。为了阻断δ受体的表达,我们采用δ受体选择性阻断剂NTI进行后续实验,分别采用0、10μM、1μM、100 nM、10 nM对活化的CD8~+ T细胞加药培养48 h,之后分别采用real-time PCR和western blot对MOR和DOR的RNA和蛋白表达水平进行检测。为了同时阻断μ和δ受体,我们选择了非选择性阿片受体拮抗剂NTX体外阻断CD8~+ T细胞的阿片受体表达,分别采用0、13μM、1.3μM、130 nM、13 nM对活化的CD8~+ T细胞加药培养48 h,之后分别采用real-time PCR和western blot对MOR和DOR的RNA和蛋白表达水平进行检测。为了研究不同阿片受体对CD8~+ T细胞表型和功能的影响,我们采用流式细胞术对CD8~+ T细胞表面的CD28、PD-1、CTLA-4、FasL和胞内的GrzB、Prf进行了检测。为了研究MENK对CD8~+ T细胞增殖的影响,我们采用阴性富集法对细胞进行分离纯化,进行CFSE染色后加入CD3、CD28抗体激活刺激,药物分组为对照组、MENK组、CTAP+MENK组、NTI+MENK组、NTX+MENK组,各组均加药培养3天,然后采用流式细胞术检测细胞的增殖。2.采用C57BL/6 S180肉瘤荷瘤小鼠模型研究MENK体内对S180肉瘤的抗肿瘤作用及脾中CD8~+ T细胞转录组的影响。采用磁珠分选法阴性富集MENK治疗组及对照组小鼠脾中的CD8~+ T细胞,采用高通量RNA转录组测序分析MENK对纯化后各组中CD8~+ T细胞lncRNA及mRNA的影响。采用Cuffdiff软件对拼接后的转录本进行差异表达分析,使用基于负二项分布的模型,筛选条件为P-adjust<0.05。采用GOseq R包对差异表达基因的mRNA和lncRNA靶基因进行GO(基因本体)富集分析,筛选条件为校正后的P value小于0.05具有统计学差异,GO显着富集。采用KOBAS软件对本次测序中预测的差异表达mRNA和lncRNA进行KEGG信号通路富集。为了进一步验证差异表达基因,我们选择KEGG中富集的具有显着性差异的信号通路进行real-time PCR实验验证,主要验证的靶基因为cell cycle(P=0.005)通路中的CCnd3、Cdc7、Anapc4、Smc3、Atm;P53 pathway(P=0.007)中的Pten、Atr、Casp8、Ccnd3、Atm;Ras pathway(P=0.028)中的Rasgrp2、Pak2、Bad、Ets-1、Rap1b、Rala、Tbk1、Rasa3;Neurotrophin signaling pathway(P=0.005)中的Kidins220、Rap1b、Matk、Prkcd、Camk2b、Bad、Rps6ka3;经典阿片受体MOR、DOR。主要验证的差异表达lncRNA为GM27008、Snhg6、Tug1和Pvt1。结果:1.MENK在体外可以促进CD8~+ T细胞中阿片受体的表达,在RNA水平上,MENK可以促进MOR和DOR的表达,最佳的作用浓度是10~-1010 M,在此作用浓度相对于对照组MOR的表达量为2.03±0.21,DOR的相对表达量为1.89±0.45,差异有统计学意义(P<0.05)。CTAP处理后能够显着下调MOR的RNA和蛋白表达水平,各实验浓度的相对蛋白表达量依次为1.13±0.02、0.62±0.01、0.85±0.01、0.62±0.05、0.63±0.01,差异有统计学意义(P<0.05)。在RNA水平NTI能够显着抑制DOR的表达,同时上调MOR的表达(P<0.01)。在1μM作用下,DOR的相对表达显着下调,其对应的相对表达量为0.75±0.04,而MOR的相对表达出现上调,其对应的相对表达量为2.88±0.37,差异有统计学意义(P<0.01)。蛋白的实验结果与RNA水平相互验证,在1μM作用下,DOR的蛋白表达显着下调,蛋白条带相对于内参的相对表达量为0.56±0.02,MOR的蛋白条带相对于内参的表达量为1.09±0.05。在RNA水平NTX能够同时显着抑制MOR和DOR的表达,在1.3μM浓度作用时,MOR相对于β-actin的表达量为0.28±0.01,DOR相对于β-actin的表达量为0.35±0.03(P<0.01)。在蛋白水平表达结果与RNA水平趋势一致,在1.3μM浓度作用时,MOR相对于β-actin的表达量为0.44±0.02,DOR相对于β-actin的表达量为0.51±0.03(P<0.01)。MENK处理组CD8~+ T细胞表面的CD28、PD-1、CTLA-4、FasL和胞内的GrzB表达显着上升(P<0.01),选择性阻断MOR(CTAP+MENK)或DOR(NTI+MENK)后上述指标表达水平显着下降,而同时阻断MOR和DOR(NTX+MENK)后CD28、PD-1、CTLA-4、Fas L和GrzB的表达水平进一步下降。MENK处理组可显着增强CD8~+ T细胞的增殖(P<0.01);单纯阻断MOR(CTAP+MENK)或DOR(NTI+MENK)后不能阻断MENK对CD8~+ T细胞的增殖作用,同时阻断MOR和DOR后,MENK对CD8~+ T细胞的增殖作用消失。2.MENK治疗对S180肉瘤具有显着的抗肿瘤作用。对实验组和对照组脾中CD8~+ T细胞进行转录组测序后,基于转录组拼接结果,经过严格筛选,共预测得到845个不具有编码潜能的lncRNA。我们对差异表达的lncRNA、TUCP及mRNA进行了后续的聚类分析和GO及KEGG富集分析。MENK组相对于对照组差异表达的lncRNA有8个上调基因,5个下调基因;差异表达的TUCP有3个上调基因,7个下调基因;差异表达的mRNA有301个上调基因,240个下调基因。差异lncRNA靶基因GO富集分析结果主要为GO:0005251(delayed rectifier potassium channel activity),GO:0008076(voltage-gated potassium channel complex),GO:0034705(potassium channel complex),GO:0005249(voltage-gated potassium channel activity),GO:0034702(ion channel complex),GO:0043269(regulation of ion transport);差异mRNA GO富集分析结果主要为GO:0005634(nucleus),GO:0044260(Cellular macromolecule metabolic process),GO:0044428(nuclear part),GO:0005622(intracellular),GO:0031981(nuclear lumen),GO:0044237(Cellular metabolic process)。差异表达lncRNA靶基因KEGG富集分析结果主要为Thyroid cancer(Mmu05216),Cholinergic synapse(Mmu04725),Bladder cancer(Mmu05219),Fox O signaling pathway(Mmu04068),Endometrial cancer(Mmu05213),Acute myeloid leukemia(Mmu05221);差异表达mRNA靶基因KEGG富集分析结果为Ribosome(Mmu03010),Viral carcinogenesis(Mmu05203),Amphetamine addiction(Mmu05031),P53 signaling pathway(Mmu04115),Neurotrophin signaling pathway(Mmu04722),Alzheimer’s disease(Mmu05010)。通过Real-time PCR对预测的差异表达基因进行实验验证,证实具有统计学意义的差异表达mRNA为bcl-2、Bax、Rap1b、Pak2、Rasa3、Bad、Pten、Rasgrp2、MOR、DOR,其中表达上调的mRNA为:bcl-2、Pak2、MOR、DOR,表达下调的mRNA为:Bax、Rap1b、Rasa3、Bad、Pten、Rasgrp2;差异表达的lncRNA为GM27008和Pvt1,并且经过实验验证GM27008和Pvt1的RNA相对表达均为显着上调,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.MENK通过上调μ和δ阿片受体调控CD8~+ T细胞的增殖和功能表型;MENK对CD8~+ T细胞的调控作用可以在μ或δ单独或同时被阻断时消失;MNEK可能通过调控阿片受体的联合亚基发挥重要的免疫调节功能。2.MENK对S180肉瘤具有显着的抗肿瘤效果;MENK治疗可提高荷瘤鼠脾和淋巴结中CD8~+ T细胞的比例。MENK治疗能够显着影响荷瘤鼠脾中CD8~+ T细胞转录组中mRNA及lncRNA的表达。(本文来源于《中国医科大学》期刊2019-02-01）
张海鹰,高原[7]（2018）在《研究帕金森病患者血清和脑脊液脑啡肽水平变化及其临床意义》一文中研究指出目的研究帕金森病患者血清和脑脊液脑啡肽水平变化以及疾病分期对脑啡肽水平的影响。方法选取200例帕金森患者作为实验组,另选取60例健康志愿者作为对照组。收集两组的血清和脑脊液标本,测定比较两组β-内啡肽(β-EP)以及亮脑啡肽(LEK)水平,同时分析Hoehn-Yahr评分与患者β-内啡肽以及亮脑啡肽水平的相关性。结果实验组脑脊液β-内啡肽和亮脑啡肽水平分别为(87.92±3.58)、(82.44±5.32)ng/ml,明显高于对照组的(68.52±4.33)、(65.42±3.51)ng/ml,差异具有统计学意义(P<0.01)。实验组血清中β-内啡肽和亮脑啡肽水平分别为(6.74±2.53)、(6.42±2.32)ng/ml,明显低于对照组的(12.33±0.46)、(11.62±0.68)ng/ml,差异具有统计学意义(P<0.05)。早期组、中期组和晚期组帕金森病患者脑脊液中β-内啡肽水平分别为(86.93±3.58)、(88.44±4.22)、(87.68±3.42)ng/ml,比较差异无统计学意义(P>0.05);早期组、中期组和晚期组帕金森病患者脑脊液中亮脑啡肽水平分别为(81.48±5.64)、(83.42±5.73)、(82.63±5.82)ng/ml,比较差异无统计学意义(P>0.05)。早期组、中期组和晚期组帕金森病患者血清中β-内啡肽水平分别为(8.74±0.82)、(6.74±0.73)、(4.74±0.48) ng/ml,比较差异具有统计学意义(P<0.05),血清中β-内啡肽水平与疾病分期具有相关性(r=-0.632, P<0.05);早期组、中期组和晚期组帕金森病患者血清中亮脑啡肽水平分别为(9.14±1.32)、(6.35±0.58)、(3.62±0.44)ng/ml,比较差异具有统计学意义(P<0.05);血清中亮脑啡肽水平与疾病分期具有相关性(r=-0.742, P<0.05)。结论帕金森病患者脑脊液中两种脑啡肽水平明显升高而血清中脑啡肽水平显着降低,且血清脑啡肽水平与疾病分期具有相关性,检测血清中脑啡肽水平对于帕金森病的早期诊断具有一定帮助。(本文来源于《中国实用医药》期刊2018年28期）
唐佳运[8]（2018）在《蛋氨酸脑啡肽对人胃癌细胞BGC823和MGC803增殖及凋亡作用的影响》一文中研究指出目的:在恶性肿瘤中,胃癌是一种较为常见的疾病,化疗方法的治疗效果还有待提高。因此关于新型抗肿瘤药物的探索研究,对于提升现阶段胃癌治疗的手段是十分必要。目前,免疫疗法在肿瘤治疗上的运用越来越广泛,以刺激免疫系统的应答反应,提升肿瘤微环境及抗肿瘤能力,实现肿瘤细胞消亡为目标。近年来,人们发现MENK不但具有调节神经内分泌活性的作用,同时还是一类重要的免疫调控因子。因此MENK作为一种联系免疫系统与神经内分泌系统的内源性神经肽受到广泛关注。本研究通过不同浓度不同时间下的蛋氨酸脑啡肽(methionine enkephalin,MENK)体外作用于人胃癌细胞BGC823和MGC803后,探讨其对细胞的增殖影响及凋亡变化。方法:体外培养人胃癌细胞株BGC823和MGC803,用不同浓度(1,2,3,4 mg/ml)的MENK体外作用于BGC823和MGC803细胞24h、48h、72h、96h后,MTS检测MENK对细胞株增殖的影响;流式细胞术和AnnexinV-FITC/PI双染法检测4mg/ml MENK体外处理48h对BGC823和MGC803细胞凋亡的影响;通过琼脂糖凝胶电泳及细胞免疫荧光法检测阿片受体OGFr的表达;实时定量PCR及Western Blot检测MENK作用后,BGC823和MGC803细胞内阿片受体表达的变化。结果:1.MENK对于BGC823和MGC803细胞的增殖具有抑制作用,作用剂量越高且时间越久,这种作用效果越明显(P<0.05)。2.流式细胞术检测4mg/ml MENK 48h处理组与对照组相比,BGC823和MGC803细胞的早期和晚期凋亡率明显增加P<0.05)。3.琼脂糖凝胶电泳结果显示,人胃癌BGC823和MGC803细胞在132bp处有一条明显的条带,有阿片受体OGFr的表达。同样应用细胞免疫荧光法检测胃癌细胞BGC823和MGC803,发现在其细胞核膜及胞质中有大量OGFr的表达。4.实时定量PCR及Western Blot检测4mg/ml MENK 48h处理组与对照组相比,细胞OGFr的表达呈现增强的趋势(P<0.05)。结论:本实验条件下,MENK可抑制人胃癌细胞BGC823和MGC803细胞增殖,具有显着的剂量依赖性和时间依赖性;MENK可通过作用于阿片受体诱导细胞凋亡,从而抑制人胃癌细胞BGC823和MGC803的增殖;胃癌细胞BGC823和MGC803中存在阿片受体OGFr的表达,且MENK作用后细胞中OGFr的表达呈现增强的趋势。(本文来源于《中国医科大学》期刊2018-09-01）
曹振杰[9]（2018）在《多柔比星联合蛋氨酸脑啡肽对神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的生长抑制及Tau蛋白磷酸化的调节作用》一文中研究指出目的探讨多柔比星联合蛋氨酸脑啡肽(Met-ENK)对神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的生长抑制及Tau蛋白磷酸化的调节作用。方法阳性对照组SH-SY5Y细胞以1. 25 mg·L~(-1)的多柔比星处理,低、中、高剂量实验组SH-SY5Y细胞分别以1. 25 mg·L~(-1)的多柔比星+10-7、10-5、10-3mol·mL~(-1)Met-ENK处理,阴性对照组细胞以等量生理盐水处理。MTT法检测各组SH-SY5Y细胞存活率,流式细胞术和Hoeschest 33258细胞核染色检测各组SH-SY5Y细胞凋亡情况,Western Blot法检测各组SH-SY5Y细胞p-Tau蛋白表达情况。结果与阴性对照组比较,干预24、48、72 h后,阳性对照组和各实验组细胞存活率降低,且实验组低于阳性对照组,实验组细胞存活率随着Met-ENK浓度的增大逐渐降低(P <0. 05)。与阴性对照组比较,阳性对照组和各实验组细胞凋亡率、G0/G1期细胞比例显着升高,中、高剂量实验组高于阳性对照组(P <0. 05);阳性对照组和各实验组S期细胞比例显着降低,中、高剂量实验组低于阳性对照组(P <0. 05)。与阴性对照组比较,阳性对照组和各实验组细胞p-Tau蛋白相对表达量明显升高,中、高剂量实验组高于阳性对照组(P <0. 05)。结论多柔比星联合Met-ENK可抑制神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞生长,并促进其凋亡,这可能与上调Tau蛋白磷酸化水平有关。(本文来源于《肿瘤基础与临床》期刊2018年04期）
李伟卓[10]（2018）在《额叶脑啡肽/强啡肽及其受体在抑郁症中的改变及MOR受体在慢性应激早期阶段的作用》一文中研究指出背景:抑郁症是一类严重危害人类心身健康的常见精神疾病,据2017年世界卫生组织统计,抑郁症已经成为全球致残率最高的疾病之一,目前全球约3.5亿人患有抑郁症。内源性阿片肽是哺乳动物脑中天然生成的具有阿片样活性的物质,经典的前体物质包括前阿黑皮素(proopiomelanocortin,POMC),前脑啡肽原(proenkephalin,PENK)和前强啡肽原(prodynorphin,PDYN),这些前体蛋白生成之后经一系列剪切衍生为几种短肽发挥其生物学效应。中枢神经系统内主要的阿片受体亚型包括:μ(MOR)、δ(DOR)和κ(KOR)。已有较多研究报道内源性阿片肽与抑郁症关系密切。目前多数研究主要集中在脑内和情绪密切相关的脑区,如杏仁核、伏隔核及海马内脑啡肽/强啡肽及DOR/KOR受体的变化与作用。对大脑高级中枢——额叶皮层的研究却少有报道。此外,对于阿片肽另一个主要受体MOR的研究目前存在着一些矛盾的实验结果,即MOR激动剂与MOR基因敲除动物都表现出减轻的抑郁样行为,这提示MOR在抑郁症中的作用仍需要实验进一步明确。为了阐明这两个问题,我们首选观察了前脑啡肽/前强啡肽及3个主要阿片肽受体在不可预见性慢性应激(unpredictable chronic mild stress,UCMS)大鼠模型(应激3周和6周)额叶中的变化。在确认存在变化之后,我们与荷兰人脑库联系获得抑郁症患者与病情最为密切的额叶两个亚脑区前扣带皮层(Anterior cingulate cortex,ACC)和背外侧前额叶皮层(Dorsal Lateral Prefrontal Cortex,DLPFC)的样本,同样检测上述阿片肽指标。为明确MOR在抑郁样行为相对早期阶段的作用,我们应用MOR激动剂Methadone/拮抗剂Naloxone干预UCMS模型(应激3周)形成过程,观察动物抑郁样行为和下丘脑-垂体-肾上腺轴(Hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA轴)始动基因促肾上腺皮质激素释放激素(Corticotropin-Releasing Hormone,CRH)和血管加压素(Arginine Vasopressin,AVP)的变化。方法:1.动物模型制备:选择体重250-320g雄性Wistar大鼠40只。建立UCMS模型,每只动物单笼饲养,将5个日相、6个夜相和2个全天刺激随机安排到一周内,连续刺激3/6周,每周各种刺激顺序随机重新组合。对照组每6只大鼠合笼饲养,整个实验过程中不接受任何刺激。2.抑郁样行为及额叶内qPCR的检测:动物分为3周和6周两个时间点,每个时间点设有各自的对照组。于每周刺激结束的次日进行行为学检测(体重、糖水偏爱实验、高架十字迷宫),行为检测后的次日分离各组动物额叶皮层,-80℃保存,qPCR法检测前脑啡肽(proenkaphin,PENK)/前强啡肽(prodynorphine,PDYN)及MOR、DOR和KOR受体的表达。3.抑郁症病人的选择及额叶ACC与DLPFC亚脑区qPCR检测:选取12个抑郁症病人(双向情感障碍抑郁病人7人,重型抑郁障碍病人5人)的ACC亚脑区及12个条件匹配的对照病人;14个抑郁症病人(双向情感障碍抑郁病人9人,重型抑郁障碍病人5人)的DLPFC亚脑区及14个条件匹配的对照病人。所有组织均-80℃保存,同上qPCR法检测阿片肽相关指标。4.MOR激动剂Methadone/拮抗剂Naloxone对UCMS3周动物行为学与脑内CRH/AVP的影响:40只动物随机分为对照组,UCMS组和UCMS+给药组。UCMS模型制备同前,药物干预组动物Methadone(0.5mg/kg)/Naloxone(2.5 mg/kg)日一次,皮下注射,连续3周。同前进行行为学检测和样本的分离与保存,qPCR法检测前额叶皮层、纹状体、海马及下丘脑内MOR和下丘脑内CRH/AVP的表达。结果:1.UCMS3周和6周大鼠行为学和qPCR结果:与对照组相比,3周和6周UCMS组大鼠每周的行为学检测表现出逐渐加重的抑郁样行为,动物体重、糖水摄取量,和高架十字迷宫开臂内的停留时间均明显低于对照组(P<0.01)。UCMS3周大鼠额叶内qRCR检测结果显示;与对照组相比,MOR在额叶皮层明显升高(P<0.01),而PENK、PDYN、DOR、KOR则均无显着变化(P>0.05)。与3周不同,UCMS6周大鼠额叶内qRCR检测结果显示MOR受体非但没有增高,反而较对照组明显降低(P<0.01)。此外,PENK和PDYN分别表现出显着降低和显着增高(P<0.001)的变化趋势,而DOR,KOR则无明显变化。2.抑郁症病人额叶ACC和DLPFC的qPCR检测:与对照病人相比,抑郁症病人ACC内仅MOR mRNA明显降低,为对照组的74%(P<0.01),而其他指标无明显差异。其中,重型抑郁障碍病人MOR和KOR表达均降低,MOR表达较对照病人降低约30%(P<0.01),KOR较对照病人降低约40%(P<0.01);双向情感障碍抑郁病人所检测指标均无显着差异。DLPFC内则未发现任何与对照病人具有显着差异的变化(P>0.05)。MOR和KOR mRNA的表达与病人信息(年龄,死亡后解剖时间、脑固定时间、脑重)的相关性检测未发现任何显着性相关。3.Methadone/Naloxone对3周UCMS大鼠行为和下丘脑CRH/AVP表达的影响:我们首先观察到UCMS 3周大鼠除额叶外,海马、纹状体和下丘脑亦出现MOR表达的显着上调(P<0.01)。行为学检测显示Methadone和Naloxone均不同程度改善了动物的抑郁样行为,动物体重、糖水摄取量和高架十字迷宫开臂内探索时间,在部分时间点显着高于UCMS组(P<0.01),而强迫游泳实验静止不动时间则低于UCMS组(P<0.001)。qPCR实验显示:与对照组相比,UCMS 3周组下丘脑内CRH和AVP的表达呈增加趋势,但无显着变化(P>0.05);与UCMS组相比,Methadone增加大鼠下丘脑内CRH和AVP的表达,CRH较UCMS组增加62%(P<0.05),AVP较UCMS组增加21%(P﹥0.05)。Naloxone则降低大鼠下丘脑内CRH和AVP的表达,CRH较UCMS组降低46%(P﹥0.05),AVP较UCMS组降低80%(P﹤0.01)。结论:1.慢性应激3周和6周动物额叶内阿片肽MOR表达先升后降,及6周PENK表达显着降低和PDNY表达显着增加的变化,提示额叶作为重要的脑区介入了阿片肽相关的抑郁症发病机制。2.抑郁症病人实验中,重型抑郁障碍病人额叶亚脑区ACC内MOR表达的显着降低与动物实验6周结果一致,提示ACC是MOR介导的额叶内阿片肽相关的抑郁症发病机制的重要切入点,以ACC为靶脑区的研究将有助于揭示MOR在抑郁症中的作用机制。3.MOR在慢性应激3周和6周先升后降的变化,提示MOR在抑郁症疾病进程的早、晚期各有其临床意义。MOR在疾病不同阶段存在表达上的变化很可能是目前MOR作用不确定的原因。4.MOR受体拮抗剂Naloxone对慢性应激3周动物抑郁样行为的改善和下丘脑AVP表达的降低,提示MOR拮抗剂在慢性应激早期阶段可能具有改善病情的作用。MOR激动剂Methadone亦呈现改善动物抑郁样行为的作用,但却增加下丘脑内CRH的表达,这种脑内与行为的不一致尚需进一步实验阐明其背后机制。(本文来源于《大连医科大学》期刊2018-05-01）
脑啡肽论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)的发病率和死亡率居世界前十,常伴有心脑血管疾病、失明、截肢等并发症而导致残疾,在全球范围内构成了严重的健康和经济挑战~([1])。据中国一项调查资料显示,2013年我国成年人糖尿病标化患病率高达10.9%,其中T2DM比例达到90%以上~([2])。另外一项在全球范围内的研究估计,在2013年中国有0.984亿的成年人患糖尿病,到2035年将达到1.427亿人,中国已成为糖尿病患者人数最多的国家~([3])。因此,迫切需要制定控制疾病发生发展的方法。免疫系统与全身代谢的双向作用多年来已被公认,免疫失衡-代谢负荷在T2DM的胰岛素抵抗(Iusulin resistance,IR)和胰岛β细胞损伤中的作用也逐渐得到重视~([4,5]),免疫代谢是目前癌症、糖尿病和肥胖等多种疾病的一种新的治疗靶点。此外,一项重要的研究明确了炎症信号通路与糖代谢的关系,T2DM作为一种慢性炎症性疾病得到广泛认可~([6])。T2DM是先天免疫系统普遍激活的结果,其中也存在着细胞因子介导的慢性炎症~([7,8])。因此可以看出,免疫系统和炎症机制都参与了T2DM的发生和发展。大量证据表明内源性阿片肽和阿片结合位点在包括人类在内的多种动物的内分泌腺体胰腺中均有表达~([9,10]),内源性阿片肽通过与阿片受体结合来发挥作用,提示这些肽也可能在胰腺的分泌调节中发挥作用,从而影响糖代谢。蛋氨酸脑啡肽(Methionine enkephalin,MENK)是一种由五个氨基酸tyr-ala-ala-pheo-met组成的内源性阿片肽,由前脑啡肽衍生而来。已有研究表明MENK是免疫和神经内分泌系统之间的重要中介,通过与阿片类受体delta(d-,DOR),kappa(k-,KOR)和mu(m-,MOR)结合来调节先天和适应性免疫~([11])。MENK是一种免疫调节因子,可调控树突状细胞、巨噬细胞和CD4~+T淋巴细胞,以及活化和调节上皮细胞及间充质细胞~([12-16])。自身免疫性慢性炎性疾病的发生发展近年来被认为是因为激活了自身反应性CD4~+T辅助细胞(T helper cell,Th)~([17,18])。目前已知幼稚Th0细胞在细胞因子的影响下可以分化为特定的Th细胞亚群,如Th1、Th2、Th17、Th22和Treg等~([19])。Th1细胞可以产生促炎细胞因子,如IFN-γ、TNF-a、IL-2等,支持细胞免疫,促进炎症反应、细胞毒性反应和迟发性超敏反应。Th2细胞可以分泌抗炎细胞因子,如IL-4、IL-5、IL-10和IL-13等,支持体液免疫,下调Th1细胞支持的炎症反应~([20-22]),Th1/Th2细胞比例平衡对维持机体免疫稳态具有重要意义。最近的研究表明胰岛间充质细胞来源的IL-33在胰岛中能够协调免疫与代谢之间的相互作用,当处于糖尿病环境(葡萄糖、IL-1β和棕榈酸刺激)时胰岛间充质细胞产生IL-33明显加强~([23])。II型固有淋巴样细胞(Group II innate lymphoid cells,ILC2s)是连接先天性免疫与适应性免疫应答间的细胞,其作为二者间的桥梁被认为是第一个激活Th2型细胞免疫反应的细胞,能够强化机体免疫反应,延缓适应性免疫应答的启动~([24])。研究还发现IL-33在胰岛内的反应细胞为ILC2s,IL-33可以与ILC2s表面的ST2结合诱导Th2反应、促进胰岛素分泌~([23]),这样就把胰岛细胞中的免疫和代谢协调起来。IL-33/ST2通路可以防止不适当的、特异性的Th1极化反应,并诱导IL-4和IL-13的产生,由此维持Th2细胞的极化状态。而ILC2s除了产生IL-4和IL-13外还可以分泌MENK,体外实验发现IL-33可以刺激ILC2s使MENK分泌增多~([24])。Toll样受体(TLR)信号通路通过髓样分化因子88(MyD88)和TNF受体相关因子(TRAF)起作用,激活核转录因子-κB(NF-κB)p65,促进细胞因子分泌和炎症反应~([25]),而有研究表明ST2可能是Toll样受体(TLR)信号传导的一个强有力的负调控因子,ST2在树突状细胞的表达上调可增加对促炎、刺激诱导成熟的耐受性~([26])。所以MENK可能通过上述途径调节糖代谢,然而到目前为止关于MENK对糖尿病的影响研究很少。目的:研究MENK对T2DM大鼠血糖和胰岛素分泌的影响及高糖高脂诱导损伤的大鼠INS-1细胞胰岛素分泌的作用;进一步探讨MENK的可能作用机制,研究MENK是否通过与阿片受体结合发挥调节免疫作用,并检测MENK对相关免疫学指标Th1和Th2的影响,分析MENK通过影响IL33/ST2通路发挥调节炎症信号通路的作用,从而阐明MENK对T2DM作用的分子机制,为T2DM的治疗提供新的思路和理论依据。本研究分如下叁部分进行:第一部分:2型糖尿病与炎症及免疫异常关系的研究。第二部分:蛋氨酸脑啡肽对2型糖尿病炎症及免疫异常干预效应的研究。第叁部分:IL-33/ST2通路在蛋氨酸脑啡肽调节2型糖尿病炎症及免疫异常中作用的研究。研究方法:1、高糖高脂饮食喂养联合小剂量链脲佐菌素(STZ)腹腔注射法建立T2DM大鼠模型;2、正常大鼠及T2DM大鼠再随机分为对照组,MENK处理组及MENK+纳曲酮(NTX)处理组;3、记录大鼠体重,血糖仪测定大鼠尾静脉血糖;4、苏木素-伊红(HE)染色大鼠胰腺组织研究病理变化;5、免疫组织化学(IHC)染色法研究胰腺组织内叁种阿片受体表达部位及表达含量;6、高糖高脂培养诱导大鼠INS-1细胞的体外β细胞损伤模型,并将细胞分组培养于加入MENK及NTX的培养基中;7、葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)实验评估高糖高脂培养对INS-1细胞的功能损伤;8、酶联免疫吸附实验(ELISA)检测大鼠血清及INS-1细胞培养上清液中胰岛素、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-2、IL-5和IL-10含量;9、实时荧光定量聚合酶链反应(real-time RT-PCR)检测大鼠胰腺组织及INS-1细胞内DOR、MOR和KOR叁种阿片受体、IL33/ST2及TLR通路相关分子-MyD88、TRAF6及NF-κB p65的基因表达量;10、Western blot方法检测大鼠胰腺组织及INS-1细胞内DOR、MOR和KOR叁种阿片受体、IL33/ST2及TLR通路相关分子-MyD88、TRAF6及NF-κB p65的蛋白表达量。结果:1、MENK对大鼠的作用1.1高糖高脂喂养联合小剂量STZ腹腔注射可成功建立T2DM大鼠模型,T2DM大鼠的血糖升高达到模型标准,多尿、多饮、多食及体重下降的典型糖尿病症状明显,血清胰岛素水平较正常组下降;应用不同剂量MENK腹腔注射均能降低T2DM大鼠的血糖水平,增加血清胰岛素水平,同时可改善T2DM引起的体重下降,差异具有统计学意义。1.2 MENK对大鼠胰腺组织形态学的影响:胰腺组织HE染色结果发现,正常大鼠胰腺中可以观察到成团的胰岛β细胞,β细胞的大小一致,核染色质清晰,具有清晰的细胞质边界和清晰的结缔组织。与正常大鼠相比,T2DM大鼠胰岛β细胞分布稀疏且不均匀,数量减少,形态不一,细胞质的界限模糊;MENK处理后的T2DM大鼠的胰岛β细胞数量明显增加,边缘较圆,细胞质稍不均匀,核仁清晰,细胞排列均匀,MENK干预可改善胰腺组织形态,维持其正常功能。1.3阿片受体在大鼠胰腺中的表达:通过IHC染色看出阿片受体DOR、MOR和KOR均在胰腺组织内表达,其中KOR的表达含量很低。结合IHC染色、real-time RT-PCR及Western blot的结果,T2DM大鼠胰腺阿片受体含量较正常大鼠减少,MENK可增加T2DM大鼠阿片受体表达,差异有统计学意义。1.4 T2DM大鼠胰腺内IL-33/ST2通路及TLR通路相关分子-MyD88、TRAF6及NF-κB p65的表达量均较正常大鼠增加;MENK干预减少了T2DM大鼠胰腺内上述分子的表达量。1.5 T2DM大鼠血清中存在明显的Th1/Th2细胞因子平衡紊乱,表现为Th1型细胞因子TNF-a及IL-2升高,而Th2型细胞因子IL-5及IL-10降低;MENK可通过降低血清中TNF-a及IL-2含量及增加IL-5及IL-10的含量来调节Th1/Th2细胞因子的平衡。2、MENK对大鼠INS-1胰岛β细胞瘤细胞的作用2.1高糖高脂培养INS-1细胞后形成明显的糖脂毒性,细胞数量减少,胰岛素分泌量下降;MENK共培养后能够增加细胞数量、改善细胞形态、增加胰岛素分泌量。GSIS实验同样证实MENK可以改善糖脂毒性造成的INS-1细胞胰岛素储备分泌障碍。2.2 MENK可增加高糖高脂培养的INS-1细胞中阿片类受体的表达水平;下调IL-33/ST2通路及TLR通路相关分子-MyD88、TRAF6及NF-κB p65的表达量;MENK可明显调节INS-1细胞分泌的Th1/Th2细胞因子的平衡;以上结果与体内实验结果趋势相符。结论:MENK可通过与阿片类受体结合进而调节免疫反应和抑制炎症反应,达到降低血糖、刺激胰岛分泌胰岛素的作用,MENK可能作为一种治疗T2DM的新方法及辅助其他降糖治疗的手段发挥临床应用潜力。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
脑啡肽论文参考文献
[1].张克莹.蛋氨酸脑啡肽通过IL-33/ST2通路影响2型糖尿病免疫发病机制的研究[C].第十二次全国中西医结合内分泌代谢病学术大会暨糖尿病、甲状腺疾病高峰论坛论文资料汇编.2019
[2].张克莹.蛋氨酸脑啡肽通过IL-33/ST2通路影响2型糖尿病免疫发病机制的研究[D].中国医科大学.2019
[3].耿金.蛋氨酸脑啡肽对荷瘤小鼠髓样抑制细胞调节作用的研究[D].中国医科大学.2019
[4].卫向红,谭苹,万京桦,孙炎斌,乐诗文.脑啡肽对湖北钉螺血淋巴细胞的影响[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志.2019
[5].王晓楠.蛋氨酸脑啡肽（MENK）通过阿片受体（OGFr）抑制胃癌恶性生物学行为的作用及机制研究[D].中国医科大学.2019
[6].焦雪.蛋氨酸脑啡肽通过阿片受体调节CD8~+T细胞活性机理的研究[D].中国医科大学.2019
[7].张海鹰,高原.研究帕金森病患者血清和脑脊液脑啡肽水平变化及其临床意义[J].中国实用医药.2018
[8].唐佳运.蛋氨酸脑啡肽对人胃癌细胞BGC823和MGC803增殖及凋亡作用的影响[D].中国医科大学.2018
[9].曹振杰.多柔比星联合蛋氨酸脑啡肽对神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的生长抑制及Tau蛋白磷酸化的调节作用[J].肿瘤基础与临床.2018
[10].李伟卓.额叶脑啡肽/强啡肽及其受体在抑郁症中的改变及MOR受体在慢性应激早期阶段的作用[D].大连医科大学.2018
论文知识图
