（岳阳爱康医院湖南省岳阳市414000）
摘要：目的探讨免疫磁珠负性富集结合免疫荧光抗体技术检测卵巢癌患者外周血CTCsDE的临床意义。方法健康志愿者6例、良性卵巢病变4例纳入常规组，卵巢癌患者32例纳入研究组。开展卵巢癌SKOV-3细胞体外培养，以一定配比加入到常规组外周血中，通过免疫磁珠负性富集、免疫荧光抗体技术检测循环肿瘤细胞。结果CTCs检测回收率介于65%-80%，r2=0.998，Y=0.782X-1.408。常规组CTCs阳性检出率为0，研究组CTCs阳性检出率为53.13%，有统计学意义（p<0.05）。卵巢癌远处转移与CTCs阳性率呈正相关。结论对卵巢癌患者外周血CTCs进行免疫磁珠负性富集结合免疫荧光抗体技术检测的价值较高。
关键词：卵巢癌；免疫荧光抗体技术；负性富集；CTCs
卵巢癌是一种恶性肿瘤，具有高死亡率特点，由于该病初期的特征并不典型，大部分患者确诊时，疾病已经步入晚期了，虽然术后化疗、肿瘤细胞减灭术的效果尚可，但是也容易复发，预后质量较低，5年存活率低于25%[1]。在1896年，循环肿瘤细胞概念由Ashworth所提出，被称之为实时肿瘤活检。此次研究，以现阶段的医疗技术为基础，通过免疫磁珠负性富集结合免疫荧光抗体技术，通过外周血，构建一种简单方便又快速的CTCs检测方法，并分析其临床价值。
1.一般资料与方法
1.1一般资料
于2016年11月--2017年11月，选择我院收治的32例首发卵巢癌患者，作为研究对象，并纳入研究组，未接受过放化疗治疗，术后病理检查确定为卵巢癌，其中有11例黏液性腺癌、21例浆液性腺癌，年龄最大70岁，年龄最小44岁，平均（54.5±2.3）岁。选取同一时间段的健康志愿者6例、良性卵巢病变者4例，作为常规组，年龄最大70岁，年龄最小46岁，平均（54.6±2.5）岁。
1.2方法
体外培养卵巢癌细胞SKOV-3：将RMPI1640培养液（包含1g/d1链霉素与青霉素、10ml/d1胎牛血清）添加至SKOV-3卵巢癌细胞株中，置于CO2培养箱（5%，38℃）中进行培养。准备对数生长期细胞，通过胰酶进行消化后吹打形成一个个的细胞，并在培养液中悬浮并形成单个细胞悬液计数。
制作标本：卵巢癌细胞SKOV-3浓度调整至制备所需，以0、10、50、100、500个的梯度，加入到健康自愿者外周血2ml当中。穿刺对照者、卵巢癌患者之后，将前2ml摒弃，在EDTA抗凝试管中保留7.5ml。
肿瘤细胞富集：通过Ficoll淋巴细胞分离液（上海朗顿生物科技有限公司），进行单个核细胞的提取工作，将单个核细胞之中的包含的些许红细胞利用红细胞裂解液予以清除，并将得到的细胞，混合于CD45免疫磁珠中，而后将LD柱湿润并加入，通过强磁场的作用，采集含有CTCs且并未附着的CD45-细胞组分。
卵巢癌细胞检测：在载波片上，涂上富集的一个个核细胞悬液，利用多聚甲醛进行稳固，保证细胞膜通透性良好，密闭血清，掺入鼠抗人角蛋白8/18（一抗）、静置，掺入山羊抗鼠IgG-FITC（二抗）、静置，将DAPI添加至细胞区、核染。封片后在荧光显微镜下进行计数观察，反复3次。
1.3观察指标
回收率=富集所得到的并可以进行卵巢癌细胞检测的数量/掺入外周血2ml的卵巢癌细胞数*100%。
CTCs：细胞核、核浆以及体积大，多核，核分裂呈病理性、不断增加，DAPI颜色较亮；细胞边缘、状态清除，鼠抗人角蛋白8/18（+）；绿色与蓝色位置重合良好。
1.4统计学分析
将所得数据录入SPSS21.0软件，予以统计分析。率（%）为计数资料，用卡方比较组间差异；±s为计量资料，用t比较组间差异。以P＜0.05表示有统计学意义。
图一SKOV-3回归方程
2.结果
2.1CTCs检测回收率
在6例健康者的外周血2ml周掺入数量不同的SKOV-3，提示CTCs检测回收率介于65%-80%。掺入细胞量与回收细胞之间的相关性较为明显。如图1。
2.2免疫荧光法检测结果
常规组CTCs阳性检出率为0，研究组CTCs阳性检出率为53.13%，有统计学意义（p<0.05）。见表1。
3.讨论
免疫磁珠负性富集结合免疫荧光染色技术，通过红细胞裂解、密度梯度离心，将外周血当中的一个个核细胞提取出来，而后通过负性富集将核细胞当中的大量白细胞予以去除，然后利用免疫荧光方法定量检测CTCs，获得细胞形态信息，便于确认，进而通过光镜为病理学结果提供支持[2]。CK为细胞结构蛋白，其特征比较独特[3]。本次研究中，CTCs标记物以鼠抗人角蛋白8／18为主，经光镜下发现肿瘤细胞胞浆荧光颜色呈绿色，掺入DAPI进行细胞核染色，光镜下呈蓝色，便于杂质区分，避免假阳性。CTCs细胞比较完整，故DAPI与鼠抗人角蛋白8／18都显色，DAPI-为杂质，而DAPI（+）、鼠抗人角蛋白8／18与CTCs特点相符。此次研究中，CTCs检测回收率良好，高达65%-80%；CTCs阳性检测率53.13%，与抗原表达能力减低、肿瘤细胞脱落入血期间凋亡、EMT相关；卵巢癌远处转移与CTCs阳性之间呈正相关，表明卵巢癌患者远处转移病灶形成中，CTCs作用重大，有利于疾病进展的监测。
总之，对卵巢癌患者外周血CTCs进行免疫磁珠负性富集结合免疫荧光抗体技术检测的价值较高，同时具有较强的检测特异性，值得临床应用。
参考文献
[1]王凤卿，李晓芳，尹克春.卵巢癌患者外周血循环肿瘤细胞水平与临床病理参数及预后的关系[J].中国妇幼保健，2017，32（05）：1052-1054.
[2]郭柏棠，刘新城，黄毓，区活辉，李湘竑，杨定华.肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞阳性提示预后不良[J].南方医科大学学报，2016，36（08）：1134-1139.
[3]邵素芳，于春美.卵巢癌患者外周血Th17/Treg细胞的检测及其临床意义[J].中国免疫学杂志，2015，31（04）：537-540.