新布尼亚病毒非结构蛋白（NSs）纯化及其多克隆抗体制备

论文摘要

目的制备新布尼亚病毒（severe fever thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV）非结构蛋白（NSs）多克隆抗体,进一步发现NSs基因的结构和功能,为深入探究SFTSV的致病机理奠定基础。方法1.PGEX-6P-SFTSV NSs重组蛋白的表达与纯化:以提取的RNA反转录合成的cDNA为模板,扩增SFTSV-NSs片段,分别连接到PGEX-6P-1载体和PFLAG-CMV-3载体上构建重组质粒。构建成功的重组质粒PGEX-6P-SFTSV NSs转化到大肠杆菌DH5α中进行克隆,将鉴定正确的重组质粒转到大肠杆菌BL21中,表达重组蛋白。经过诱导条件优化,选择最适条件,大量诱导重组蛋白,经GST亲和柱层析过滤以获得高纯度的PGEX-6P-SFTSV NSs重组蛋白。2.PGEX-6P-SFTSV NSs多克隆抗体的制备:将纯化后的PGEX-6P-SFTSV NSs重组蛋白与完全佐剂混合,制备抗原,免疫新西兰大白兔,改用不完全佐剂后再免疫四次,得到的抗体经Western Blotting及ELISA检测抗体的特异性及效价。3.多克隆抗体的应用:对感染SFTSV病毒的VERO细胞及转染SFTSV NSs-Flag质粒的293细胞分别进行Western Blotting及间接免疫荧光（IFA）检测,验证SFTSV在细胞中的表达及其表达部位;SFTSV病毒感染VERO细胞利用制备的抗体检测SFTSV病毒滴度。结果1.PGEX-6P-SFTSV NSs重组蛋白的表达与纯化:成功构建PGEX-6P-SFTSV NSs及SFTSV NSs-Flag重组质粒。PGEX-6P-SFTSV NSs重组蛋白在大肠杆菌BL21中得以表达,经过一系列条件摸索,最佳诱导条件为28℃,加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG,诱导12h时蛋白表达量最多,且主要以包涵体形式存在于沉淀中。大量收集重组蛋白后经GST亲和柱层析得到较高纯度的PGEX-6P-SFTSV NSs重组蛋白。2.PGEX-6P-SFTSV NSs多克隆抗体的制备:成功免疫新西兰大白兔,制备出兔抗SFTSV NSs多克隆抗体。得到的兔抗血清经Western Blotting检测,其特异性良好,经ELISA检测,效价达1:64,000。3.多克隆抗体的应用:得到的兔抗血清经Western Blotting检测病毒及真核质粒SFTSV-NSs的表达得到特异性条带,经IFA检测观察到在细胞中以包涵体形式存在的NSs蛋白。SFTSV病毒滴度为4.67X109FFU/mL。结论1.成功构建PGEX-6P-SFTSV NSs重组质粒,并获得高纯度的PGEX-6P-SFTSV NSs重组蛋白。2.成功制备特异性及高效价的兔抗SFTSV NSs多克隆抗体。3.制备的多克隆抗体能够特异性识别真核质粒SFTSV-NSs及SFTSV病毒感染细胞后NSs蛋白在细胞中的表达,并可应用于后续实验。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王晓芳

导师: 李永刚

关键词: 新布尼亚病毒,重组蛋白,蛋白纯化,多克隆抗体

来源: 锦州医科大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,基础医学

单位: 锦州医科大学

分类号: R373

DOI: 10.27812/d.cnki.glnyx.2019.000042

总页数: 54

文件大小: 3462K

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