吴建超1刘芳2
1身份证号码：13112219830309181x河北050000；2身份证号码：620103198607272624河北050000
摘要：对染发剂中的染料运用情况通过采取高效液相色谱测定的方法来进行研究。将此32种物质分为三类，一共三组，通过对流动相、缓冲盐、色谱柱、波长等的测定，进行分析研究，得出数据。一般来说，当相对标准差在5%以内时，其加标回收率是比较高的。
关键词：染发剂；高效液相色谱法；染料
引言
作为特殊化妆用品的染发剂，其主要的功能就是改变头发颜色，提升人物形象与气质。一般来说，染发剂主要有三种常见的类型：氧化性染发剂、金属型染发剂以及植物型染发剂。在这当中，染色效果最好的就是氧化性染发剂，由于其具有维持时间较长、色调变化很宽的优点，所以得到了较为广泛的应用。苯酚类有机化合物和苯胺类有机化合物是氧化性染发剂最主要的成分。但是需要注意的是这些化合物在某种程度上均具有致敏性和致癌性，所以加强对染发剂的监管以及日常的卫生管理都是非常重要的。
一、基本概述
我国《化妆品卫生规范》（2007年版）中规定了93种暂时允许使用的染发剂，《化妆品卫生规范》（2007年版）对这些染发剂的使用浓度、限制使用条件和警
示用语等作了相应规定，但是在相关检验方法项目中仅提供8种禁限用成分的液相色谱检测方法，检测成分在数量上严重不足。文献中报道的检测方法种类很多，有薄层色谱（TLC）、高效薄层色谱（HPTLC）、高效液相色谱（HPLC）、高效液相色谱－质谱（HPLC/MS）、气相色谱（GC）、气相色谱－质谱（GC/MS）、毛细管电泳（CE）等。DiGioia等采用GC/MS在选择离子监测（SIM）条件下分析染发剂中的p－苯二胺。刘丽等采用超声波抽提、GC/MS测定氧化性染发剂中的16种染料。Vincent等采用ＲP－HPLC－DAD（反相高效液相色谱配二极管阵列检测器）检测p－苯二胺、m－苯二胺、m－氨基苯酚和m－苯二酚4种染料。上述方法检测染料种类有限，不能满足染发剂的监管需求，急需一种能检测尽可能多且容易实施的方法为化妆品的监管提供技术支持。国家食品药品监督管理总局发布的国食药监保化［2012］13号文件的附件10《化妆品中32种禁限用染料成分的检测方法》提出检测32种禁限用染料成分的液相色谱法。该法分3组流动相系统测定，但是该方法重现性、耐用性较差，且对色谱柱伤害较大。
二、高效液相色谱法测定方法
1、流动相的选择
1.1pH的选择。染发剂的成分苯胺类和酚类分别呈碱性和极弱的酸性。在一般色谱柱能承受的pH范围内，苯胺类化合物大都呈离子态，在色谱柱中保留值较小，若加离子对试剂，虽然化合物的保留增强，但分离的重现性较差，pH的微小变化都能导致分离度的较大改变，且采用离子对试剂出峰较慢，故选择在中性、碱性条件下分离苯酚类和苯胺类物质，使其全部或大部分呈分子态，在耐碱性的色谱柱下进行分离。根据酸碱平衡原理，若pH＜pKa－2，则物质以酸性形式存在；pH＞pKa+2，物质以碱性形式存在。故对于羟基，可使流动相pH小于相应物质的pKa－2；对于氨基，可使流动相pH大于相应物质的pKa+2，则氨基和羟基都不电离。根据目标组分的pKa将32种物质分成A，B和C3组。
1.2缓冲盐的选择。缓冲盐在高于或低于pKa一个pH单位内可起到缓冲效果，pH=pKa时缓冲容量最大。为提高缓冲性能，应分别选择pKa=7.0，8.0和9.0附近的缓冲盐，磷酸二氢钾和乙酸铵的pKa分别为7.2和9.2，可作为A组和C组流动相的缓冲盐；液相色谱常用的缓冲盐中无pKa=8.0的，故选择pKa=7.2的磷酸二氢钾作为B组流动相的缓冲盐，也能起到缓冲效果。由于3个流动相系统都使用梯度洗脱，分离过程中有机相比例较高，若使用高浓度缓冲盐可能会在高压泵头析出盐的晶体颗粒，磨损泵密封圈和柱塞杆，故选择使用0.005mol/L的缓冲盐，而B组由于pH和pKa相差较大，缓冲容量相对较小，故可提高其浓度至0.01mol/L以提高其缓冲性能。
2、色谱柱的选择
由于3组流动相的pH偏碱性，故选用碱性柱较合适。ZOＲBAXExtendC18色谱柱具有独特的双配位键合和双封端，在高pH下具有高稳定性，故可使用该色谱柱进行分离。但当B组化合物使用ZOＲBAXExtendC18柱分离时，流动相的有机相比例在10%以下易造成疏水坍塌，会导致保留时间向前漂移，而
ZOＲBAXBonus－ＲPC18柱的固定相含有极性的酰胺基团，即使用100%的水相作流动相，也不会发生疏水坍塌，且ZOＲBAXBonus－ＲPC18柱含有的极性基团减少了碱性化合物和硅胶基质的作用，在pH=8时较稳定，硅胶不易溶解。故可用ZOＲBAXBonus－ＲPC18柱对B组进行分离，而A组和C组采用ZOＲBAXExtendC18柱，上述色谱柱耐用性和分离度均良好。高柱温有利于改善色谱峰的峰形，但是对于硅胶色谱柱，在高于40℃的高柱温下使用磷酸二氢钾等缓
冲液时会加速键合相的断裂，故设定柱温为35℃即可；ZOＲBAXBonus－ＲPC18耐碱性的能力更弱，适当降低柱温至30℃，以延长色谱柱的寿命。
3、检测波长的选择
国食药监保化［2012］13号文件的附件10《化妆品中32种禁限用染料成分的检测方法》选用280nm作为3组物质的检测波长。采用上述流动相系统，DAD扫描表明，在280nm下2－氯－p－苯二胺硫酸盐、2－甲基雷琐辛、N，N－二乙基甲苯－2，5－二胺HCl、N，N－双（2－羟乙基）－p－苯二胺硫酸盐、p－甲基氨基苯酚硫酸盐、2，6－二氨基吡啶和N，N－二乙基－p－苯二胺硫酸盐的吸收较小，灵敏度较低，故选择280，230和250nm分别作为A，B和C3组的检测波长，在相应的检测波长下各个组分的检测灵敏度均较高。
结束语
简言之，从多组分酸碱性化合物的结构入手，根据化合物的pKa值对组分进行分组，建立了染发剂中32种染料的测定方法。该法依据酸碱平衡理论，使大部分组分离子受到抑制，增强其保留，提高重现性和耐用性，精密度与准确度高，操作较为简便，基本弥补了国食药监保化［2012］13号文件的附件10《化妆品中32种禁限用染料成分的检测方法》的缺陷，可作为《化妆品卫生规范》（2007年版）中检测方法的良好补充，也为该类化合物液相色谱分离方法的开发提供了一种思路。
参考文献：
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