水稻柠檬烯合酶的功能鉴定

论文摘要

萜类化合物作为植物次生代谢产物中种类最为繁多的一类,在植物直接防御和间接防御中发挥着重要的作用。水稻作为全球的主要粮食作物之一,病虫害一直是影响其产量问题的重要因素,利用萜类物质对水稻进行绿色可持续防御保护是今后水稻病虫害防治发展的方向。本研究依据本室已有的褐飞虱取食水稻芯片数据,挑选出2个受褐飞虱取食诱导上调表达基因TPS19与TPS20,本室已毕业硕士进行的目的蛋白体外酶活实验验证了它们是柠檬烯合酶基因,通过对转基因水稻进行褐飞虱H型嗅觉仪实验、褐飞虱刺探电位图分析及水稻接菌实验,为验证水稻柠檬烯合酶的生物学功能及培育新型绿色抗病虫害水稻提供理论参考。主要结果如下:1、对转TPS19基因超表达载体及CRISPR-cas9载体进行了水稻遗传转化,对转TPS20基因CRISPR-cas9载体进行了水稻遗传转化,通过分子鉴定获得了稳定整合且高效表达的超表达转基因植株与目的基因敲除再生植株。2、对超表达TPS19与TPS20植株挥发物进行了顶空吸附收集并用GC-MS对抽提物进行了成分检测:柠檬烯是主要产物;亚细胞定位结果显示二者均定位于叶绿体,表明TPS19与TPS20都是单萜合酶。以上结果从侧面佐证了TPS19与TPS20在水稻中作为柠檬烯合酶存在。3、对超表达TPS19与TPS20植株T1代进行了水稻褐飞虱H型嗅觉仪实验与昆虫刺探电位仪实验。结果表明:超表达转基因水稻对水稻褐飞虱寄主选择和取食行为均无显著影响。4、对超表达TPS19与TPS20植株T1代进行了水稻纹枯病离体接菌实验,结果表明超表达转基因水稻对纹枯病有一定抗性,但是受环境条件影响较大。5、TPS19与TPS20二者无论是CDS序列还是氨基酸序列都具有极高的相似性,但二者的组织表达模式不同:TPS19主要在三叶期幼苗、茎、发穗花序、开花前一天的内外稃中表达,而TPS20主要在三叶期幼苗、幼苗地上部分、茎、开花前一天的内外稃、开花后3 d小穗中表达。基于启动子融合GUS的染色观察发现TPS19与TPS20均主要在水稻叶鞘和叶片中表达。6、构建了酵母单杂交载体,对TPS19启动子质粒文库筛选,初步找到转录因子LOCOs01g39310、LOCOs06g41010、LOCOs07g35870、LOCOs09g12770。

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摘要

Abstract

缩略名词表

1 前言

1.1 植物萜类化合物的研究进展

1.1.1 萜类化合物

1.1.1.1 单萜

1.1.1.2 倍半萜

1.1.1.3 双萜

1.1.2 萜类化合物功能

1.1.3 萜类化合物的合成途径

1.1.3.1 基本C5 单元IPP和 DMAPP的合成

1.1.3.2 萜类化合物直接前体的合成

1.1.3.3 萜类化合物的合成

1.1.4 植物萜类合酶

1.1.4.1 TPS结构特点

1.1.4.2 TPS功能分类

1.1.4.3 TPS的功能研究

1.1.4.4 柠檬烯合酶

1.2 研究目的和意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 水稻材料和来源

2.1.2 菌株和载体

2.1.3 试剂和工具酶

2.1.4 引物

2.2 实验方法

2.2.1 载体的构建

2.2.1.1 亚细胞定位载体的构建

2.2.1.2 启动子融合载体的构建

2.2.1.3 酵母单杂交载体的构建

2.2.2 农杆菌介导的ZH11 的遗传转化

2.2.3 转基因植株的PCR检测

2.2.4 转基因植株Southern blot

2.2.4.1 水稻叶片DNA抽提

2.2.4.2 Southern blot

2.2.5 目的基因表达量检测

2.2.5.1 水稻叶片总RNA抽提

2.2.5.2 水稻总RNA反转录

2.2.5.3 目的基因表达量检测

2.2.6 水稻挥发物的收集及气质联用检测

2.2.6.1 水稻挥发物的收集制备

2.2.6.2 气相色谱-质谱联用（Gas Chromato graphy-Mass Spectrometer,GC-MS）检测

2.2.7 褐飞虱寄主定位行为

2.2.8 褐飞虱刺探电位图（electrical penetration graph,EPG）

2.2.9 亚细胞定位

2.2.9.1 细菌高质量质粒的抽提

2.2.9.2 水稻原生质体的制备

2.2.9.3 原生质体的转化

2.2.9.4 激光共聚焦显微镜观察

2.2.10 酵母单杂交

2.2.10.1 酵母的快速转化

2.2.10.2 酵母单杂筛库

3 结果与分析

3.1 转基因超表达水稻的获得、拷贝数检测、表达量检测及抗性鉴定

3.1.1 T0 代转化植株的获得

3.1.2 Southern blot

3.1.3 转TPS19、TPS20 基因阳性转化材料的表达量检测

3.1.4 转TPS19、TPS20 基因材料挥发物收集及气质联用检测

3.1.5 转TPS19、TPS20 基因材料T1 代褐飞虱抗性鉴定

3.1.5.1 转基因水稻对褐飞虱寄主定位行为的影响

3.1.5.2 转基因水稻对褐飞虱取食行为的影响

3.1.6 转TPS19、TPS20 基因材料T1 代的纹枯病抗性鉴定

3.2 CRISPR转基因水稻植株的获得及阳性检测

3.3 TPS19与TPS20 在水稻中的组织表达模式

3.4 TPS19与TPS20 编码蛋白的亚细胞定位

3.5 TPS19与TPS20 酵母单杂交

3.5.1 酵母单杂交载体的构建

3.5.2 目的基因自激活活性检测

3.5.3 酵母文库筛选结果分析

4 讨论

4.1 TPS19、TPS20 在水稻中行使柠檬烯合酶功能

4.2 TPS19、TPS20 的表达模式分析

4.3 TPS19、TPS20 的转录调控机制探索

4.4 TPS19、TPS20 在抗稻飞虱水稻培育中的应用前景

4.5 TPS19、TPS20 在抗病害水稻培育中的应用前景

参考文献

附录

1 OsTPS19和OsTPS19的CDS序列比对

2 OsTPS19和OsTPS19的氨基酸序列比对

3 农杆菌介导粳稻遗传转化试剂及培养基配方

3.1 水稻遗传转化试剂

3.2 水稻遗传转化培养基配方

4 农杆菌介导粳稻遗传转化操作流程

4.1 诱导愈伤

4.2 继代

4.3 预培养

4.4 侵染与共培养

4.5 水洗

4.6 筛选S2

4.7 分化

4.8 生根

4.9 炼苗

5 Southern blot试剂配方

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 王岭楠

导师: 林拥军

关键词: 萜类化合物,柠檬烯合酶,褐飞虱,纹枯病,酵母单杂交

来源: 华中农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,生物学,农作物

单位: 华中农业大学

分类号: S511;Q943.2

DOI: 10.27158/d.cnki.ghznu.2019.000368

总页数: 85

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