傅俊英[1]2003年在《大蒜素预处理延迟保护作用及其信号转导机制的研究》文中认为背景: 冠心病在40~49岁人群中发病率为58.36%,死亡数占人口死亡数的1/3~1/2，占心脏病死亡数的50%~75%。缺血预处理具有强大保护缺血心肌作用，用药物尤其是中药诱导这种内源性调控保护可能是极积有效治疗冠心病新途径。目的：探索能够模拟缺血预处理延迟保护作用的中药，研究大蒜素延迟保护的效果及其信号转导作用机制。方法：大蒜素延迟保护作用的整体动物实验部分：健康新西兰大白兔32只，随机分为缺血再灌注组（30min缺血和2h再灌注损伤）、缺血预处理组（4次5min缺血5min再灌注预处理）、大蒜素预处理大剂量组（1.0mg/kg大蒜素预处理）、大蒜素预处理小剂量组（0.5mg/kg大蒜素预处理）。分别进行预处理（除缺血再灌注组）24h后，再结扎冠状动脉左前降支30min，复灌2h，造成缺血再灌注损伤模型。观察心肌梗死范围（梗死区心肌重量占危险区心肌重量的百分比）、血流动力学（HR、LVEDP、LVPSP、CF、±dp/dt max）、电镜下心肌超微形态结构、生化指标（血浆LDH、CK活性及组织匀浆液MDA、Mn-SOD含量）改变情况。大蒜素延迟保护作用的离体细胞实验部分：利用培养的离体乳鼠心肌细胞模型，研究①大蒜素预处理延迟保护的量效关系：5、10、20、50μg/ml浓度大蒜素与乳鼠心肌细胞共同孵育30min进行预处理，24h后，用细胞存活率、细胞内外LDH活性及MDA生成等指标来观察不同剂量大蒜素对细胞低氧复氧损伤（2h低氧，2h复氧）的影响以探讨大蒜素预处理延迟保护作用的剂量-效应关系。②大蒜素预处理延迟保护的时效关系：20μg/ml浓度大蒜素与细胞共同孵育30min进行预处理后，在12、24、36h分别进行低氧复氧损伤，以观察大蒜素预处理延迟保护作用的时间-效应关系。③信号阻断剂对大蒜素预处理延迟保护作用的影响：PKC阻断剂H-7或MAPK阻断剂PD98059与细胞共同孵育10min后，再用大蒜素（20μg/ml）预处理30min，24h后观察信号阻断剂对大蒜素延迟保护作用的影响。④在此基础上，进行大蒜素预处理延迟保护作用的信号转导机制研究：大蒜素以及大蒜素加H-7或PD98059预处理24h后，直接用免疫杂交法测定细胞裂解液中nPKC-ε、HSP70和NF-κB的蛋白表达情况。结果：整体动物实验部分：①缺血损伤使心肌梗死区重量占危险区重量百分比达52.9±6.5%，缺血和大蒜素（1mg/kg体重）预处理使百分比分别降至24.6±5.0%、36.7±5.5%（P<0.05）。②大蒜素（0.5、1mg/kg体重）预处理使复灌末LVEDP较缺血再灌损伤组分别降低32.34%及56.56%（P<0.01或P<0.05）；LVPSP分别提高61.58%及94.33%（P<0.05）；+dp/dt分别增加19.94%及49.84%（P<0.05）。-dp/dt分别增加24.17%及51.33%（P<0.05 或P<0.01）。但对动物HR、CF无明显改善作用。③缺血损伤后出现细胞、线粒体肿胀，肌丝结构不清，Z线模糊，毛细血管内皮细胞肿胀等改变。大蒜素预处理有明显改善作用。大蒜素大剂量组效果优于<WP=5>小剂量组。④大蒜素（0.5、1mg/kg体重）预处理可使血浆LDH活性较缺血再灌损伤组分别降低30.51%、34.96%（P<0.05），组织匀浆液中MDA含量分别减少23.74%、21.72%（P<0.01）。离体细胞实验部分：①大蒜素5、10、20μg/ml剂量组的生存率分别为86.01%、87.45%、94.42%，明显高于低氧复氧损伤组的76.65%( P<0.01)。20μg/ml组与低氧预处理组的96.45%比， P>0.05。50μg/ml组细胞存活率为38.34%，低于低氧复氧损伤组( P<0.01)。APC20组上清液中LDH活性较低氧复氧损伤组降低46.77%(P<0.01)。APC5、10、20、50 μg/ml组上清液中MDA较低氧复氧损伤组分别降低38.29%、52.03%、45.96%、27.80%(P<0.01)。APC 10、20 μg/ml组与低氧复氧组比较，细胞内液中LDH活性分别提高1.20、1.78倍(P<0.01)。APC5、10、20组细胞内液中MDA则分别降低40.77%、51.27%、59.02%(P<0.01)。②12、24h组细胞存活率分别为70.03%、77.14%，较低氧复氧损伤组的65.16%明显提高( P<0.05或 P<0.01)。36h组的63.20%与低氧复氧损伤组无明显差异。24h组使上清液中LDH活性明显降低，细胞内液中LDH明显增高，同时明显减少细胞内、外液的MDA含量( P<0.05或 P<0.01)。12、36h组仅能减少细胞内液中MDA的生成（P<0.01）。③H-7、PD98059拮抗剂组较大蒜素预处理组存活率分别下降15.71 %、12.43%(P<0.01)。上清液中LDH活性分别增加42.40%、30.73%(P<0.05)。上清液中MDA含量分别增加85.14%、1.27倍(P<0.05或P<0.01)。细胞内液中LDH活性分别降低44.33%、39.80%(P<0.05)。细胞内液MDA含量分别增加69.59%(P<0.05)、1.27倍(P<0.01)。④同时大蒜素及缺血预处理24h后，PKC-ε表达分别增加33.58%、31.01%（P<0.01），HSP70表达分别增加36.62%、43.66%（P<0.01），而PKC抑制剂H-7、MAPK抑制剂PD98059可分别完全抑制两种蛋白表达的增加。NF-κB在各组预处理24h后均无表达。结论：大蒜素能模拟缺血预处理延迟保护作用，减少心肌细胞死亡，促进心肌形态、功能恢复，减轻过氧化损伤。且在一定范围内呈剂量-效应关系。这种保护作用在预处理后12h产生，24h作用最强，36h基本消失。其作用机制可能与大蒜素激活信号转导途径，通过PKC-ε-MAPKs通路，促进HSP等表达上调，蛋白合成加速有关。
傅俊英, 史载祥, 刘秀华, 王彦贞, 张久亮[2]2004年在《大蒜素对乳鼠心肌细胞延迟预处理保护作用及其信号转导机制的研究》文中指出目的 :研究大蒜素预处理对乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的延迟保护作用及其部分信号转导机制。方法 :采用细胞存活率、乳酸脱氢酶活性、丙二醛含量作为心肌细胞受损指标 ,观察终浓度为 2 0 μg/ml的大蒜素预处理 2 4h后对乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用及蛋白激酶抑制剂H 7、丝裂素激活蛋白激酶抑制剂PD 980 5 9对大蒜素预处理作用的影响 ;并通过免疫印迹技术(Westernblotanalysis)测定大蒜素预处理 2 4h后 ,nPKC ε、热休克蛋白 70 (HSP70 )和核因子 κB(NF κB)的表达情况。结果 :大蒜素预处理能显着提高缺氧复氧损伤心肌细胞存活率 ,减少LDH漏出和MDA生成 ,H 7、PD 980 5 9可完全取消这种心肌保护作用。大蒜素预处理可明显增加nPKC ε、HSP70的表达 ,H 7能抑制此作用 ,而PD980 5 9仅对HSP70表达有抑制 ,NF κB在各组间均无明显表达。结论 :大蒜素能够模拟缺血预处理延迟保护作用 ,其机制涉及PKC及MAPKs信号途径 ,可能通过活化nPKC ε ,使下游靶蛋白MAPKs磷酸化而诱导HSP70的高度表达产生延迟预处理心肌保护作用。
傅俊英, 刘秀华, 史载祥, 蔡莉蓉[3]2003年在《大蒜素预处理对乳鼠心肌细胞缺氧复氧延迟保护作用的研究》文中研究指明目的 :研究大蒜素预处理对乳鼠心肌细胞缺氧复氧的延迟保护作用及其机制。方法 :采用细胞存活率、乳酸脱氢酶 (LDH)活性、丙二醛 (MDA)含量作为心肌细胞受损指标。观察终浓度分别为 5、1 0、2 0、5 0 μg/ml的大蒜素预处理以及预处理 1 2、2 4、3 6h后对乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的影响 ,并观察蛋白激酶C(PKC)抑制剂H 7、丝裂素激活蛋白激酶 (MAPKs)抑制剂PD 980 5 9对大蒜素预处理的作用。结果 :大蒜素能提高细胞存活率 ,减少LDH漏出和MDA生成。其中 2 0 μg/ml浓度作用较强。大蒜素预处理 1 2h后即产生延迟保护作用 ,2 4h最强 ,3 6h消失。H 7、PD 980 5 9能够完全清除大蒜素预处理的心肌保护作用。结论 :大蒜素可以模拟缺血预处理延迟保护作用 ,其机制涉及PKC及MAPKs信号途径。
傅俊英, 刘秀华, 史载祥, 王彦贞, 张久亮[4]2003年在《大蒜素在乳鼠心肌细胞延迟预处理作用的实验研究》文中指出目的:研究大蒜素预处理对乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的延迟保护作用及其信号转导机制。方法:采用细胞存活率、LDH活性、MDA含量作为心肌细胞受损指标,观察终浓度为20μg/ml的大蒜素预处
史春志[5]2006年在《大蒜素对大鼠心肌细胞缺氧/复氧、缺血/再灌注损伤保护作用及其机制研究》文中研究说明第一部分大蒜素预处理对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响目的探讨大蒜素对培养乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用并观察大蒜素对心肌细胞凋亡的影响。方法利用培养乳鼠心肌细胞缺氧/复氧(A/R)模型,将培养的心肌细胞分为正常对照(CON)组、缺氧预处理(AP)组、缺氧/复氧(A/R)组、大蒜素(A)组共4组。各组均测定缺氧后、复氧后心肌细胞损伤指标乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量,并应用DNA琼脂糖凝胶电泳及原位末端标记法(TUNEL法)共聚焦荧光显微镜检测各组心肌细胞凋亡,并计算凋亡指数(AI),比较各组间差异。结果A组、AP组较A/R组LDH、MDA明显降低,SOD明显增高;A/R、AP、A组AI较CON组明显增高,AP组、A组AI较A/R组降低有显着性差异,A组较AP组AI稍高,但无显着统计学差异。结论大蒜素具有明显抗心肌细胞A/R损伤作用,并具有明显的抗心肌细胞凋亡作用。第二部分大蒜素预处理对大鼠心脏缺血/再灌注损伤起保护作用及其机制探讨目的第一部分证实大蒜素对培养乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤具有保护作用,本部分进一步探讨在活体大鼠心脏缺血/再灌注(I/R)损伤模型中大蒜素是否具有抗缺血/再灌注损伤及抗心肌细胞凋亡作用。并进一步探讨丝裂素活化蛋白激酶p38(p38MAPK)是否参与大蒜素对大鼠心肌细胞I/R损伤的保护作用。方法建立在体大鼠心脏I/R损伤模型,将69只大鼠随机分为正常对照组(CON组,n=9)、I/R损伤组(I/R组,n=15)、大蒜素预处理组(A组,n=15)、大蒜素预处理+SB203580组(A+SB组,n=15)、SB203580组(SB组,n=15);各组均测定大鼠心肌I/R损伤后血清肌酸磷酸肌酶同工酶MB(CK-MB)、心肌组织丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(S0D)含量,并应用DNA琼脂糖凝胶电泳及原位末端标记法(TUNEL法)检测各组凋亡细胞及凋亡指数(AI),除CON组外余各组均测定心肌梗死范围(IS/AAR%,TTC法),并利用蛋白免疫沉淀法(westernblotting)测定各组缺血区心肌总p38MAPK、磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)表达情况,比较各组间差异。结果A组较I/R组、A+SB、SB组IS/AAR%[(21.85±1.49)% vs.(44.65±4.65)%,(41.17±3.16)%,(40.98±7.62)%,均P<0.01]、CK-MB[(986.40±94.01)U/L vs.(2044.25±107.28)U/L,(2004.75±206.43)U/L,(2044.33±144.13)U/L,均P<0.01)]、MDA [(3.26±0.35)nmol/mg pro vs.(4.96±0.46)nmol/mgpro, (4.79±0.41)nmol/mg pro,(4.75±0.35)nmol/mg pro,均P<0.01)]均明显降低,SOD[(140.20±12.89)U/mg pro vs.(73.16±11.22)U/mg pro,(73.93+8.46)U/mg pro,(74.35+4.66)U/mg pro,均P<0.01)]明显增高。A组较I/R组、A+SB、SB组AI明显降低[(6.97±1.23)%vs. (13.99±3.05)%,(13.55±2.54)%,(14.16±3.70)%,均P<0.01],p-p38MAPK表达在A组较I/R、A+SB、SB组明显增高,总p38MAPK在各组间无显着性差异。结论大蒜素有明显抗在体大鼠心肌I/R损伤、抗心肌细胞凋亡作用,其作用与p38MAPK细胞信号转导通路有关。第叁部分大蒜素调控Bcl-2,Bax蛋白表达及NF-κB核结合活性减少缺血/再灌注诱导的细胞凋亡目的前二部分实验证实大蒜素对培养乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤及活体大鼠缺血/再灌注损伤模型中均具有心肌细胞保护作用,在此部分进一步探讨Bcl-2,Bax蛋白表达及NF-κB核结合活性变化在大蒜素对在体大鼠心肌缺血/再灌注损伤保护作用及抗缺血/再灌注损伤心肌细胞凋亡中的作用。方法利用第二部分实验中正常对照组(CON组,n=6)、缺血/再灌注损伤组(I/R组,n=6)、大蒜素预处理组(A组,n=6)之大鼠心脏;常规进行石蜡切片后使用免疫组化方法检测Bcl-2、Bax蛋白表达,同时利用心肌组织进行电泳迁移率分析(EMSA)测定NF-κB的核结合活性,比较各组间差异。结果A组较工/R组Bcl-2表达明显增加,Bax明显减少。以PEI半定量:与CON组比较,I/R组Bcl-2表达显着减弱(1.30±0.19 vs.1.54±0.19,P<0.01),与I/R组相比,A组Bcl-2表达显着增加(1.30±0.19 vs.5.47±0.49,P<0.01),而Bax表达在I/R组较A组显着增加(6.10±0.90 vs.1.80±0.22,P<0.01)。以光密度半定量表达NF-κB DNA结合活性:I/R、A组分别是CON组的2.36、1.36倍,A组较I/R组亦显着减弱(P<0.01)。结论大蒜素有明显抗大鼠心肌缺血/再灌注损伤作用,其作用机制与抗心肌细胞凋亡作用有关,对Bcl-2,Bax蛋白表达及NF-κ核结合活性的不同调控起到重要作用。
孙琳[6]2011年在《木豆叶指纹图谱及其提取物对心肌缺血再灌注损伤保护作用的研究》文中指出研究背景心肌缺血后有效地再灌注治疗是限制急性心肌缺血性坏死的最有效方法。然而心肌缺血再灌注的最终结果不但取决于缺血持续的时间,也依赖于发生再灌注损伤的程度。再灌注时伴随出现的氧自由基增多、细胞内钙超载、微血管损伤、多型核白细胞积聚以及炎症的激活,可导致心肌缺血再灌注损伤(Myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI),引起细胞损伤的进一步加重；另外,心脏直视手术中,体外循环复灌中引起的心肌缺血性损伤和再灌注损伤是影响术后心脏功能恢复的重要因素,其损伤越来越引起人们的重视,寻求切实有效的方法来治疗缺血再灌注损伤一直是心血管外科领域的研究重点。近年来,中医药对MIRI的保护作用的实验研究得到重视,特别是传统中草药中的提取物,相关研究已经证实了其在MIRI中的有效性和实用性。本研究所选药材木豆叶为豆科木豆属落叶灌木木豆(Cajanus cajan (L.)Millsp)的干燥叶片及嫩枝。木豆叶中主要含有牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素等多种黄酮类成分,具有降血压、止痉挛、抗感染、抗菌、辐射保护以及清除自由基的作用。近年来,有关木豆叶提取物的相关报道较多,但是关于木豆叶提取物应用于治疗心血管疾病的药理学研究鲜有报道,开发适合预防或治疗心血管疾病的木豆叶提取物前景广阔。随着对木豆叶及其提取物临床疗效的进一步研究,木豆叶药材的质量控制问题也渐渐受到人们的关注。目前,木豆叶的质量控制多采用牡荆苷、异牡荆苷作为指标,但仅仅依靠单一或几个化学成分并不能全面体现木豆叶的药效,也不能从整体上评价木豆叶的质量,不利于木豆叶的临床应用和国际化。中药指纹图谱质量控制技术能够确保中药、中成药成分的一致性、疗效的安全性及可靠性,能全面反映中药材所含化学成分的种类与数量,从整体上控制药材质量,既符合传统中医药理论,又符合现代化药品质控的技术手段支持。囚此,中药指纹图谱目前已成为公认的反映中药材及中药制剂质量标准的理想方法。然而,目前对于木豆叶提取物尚没有系统的指纹图谱研究。鉴于木豆叶治疗心血管疾病的开发潜力,以及色谱指纹图谱对评价药材质量的有效性,本研究建立了木豆叶水提物的指纹图谱,并根据指纹图谱结果选用海南产木豆叶药材,通过建立大鼠急性心肌缺血再灌注损伤模型,观察对比不同剂量木豆叶水提物对再灌注损伤的影响,并探讨其可能的作用机制。研究目的(1)建立木豆叶提取物HPLC指纹图谱,为木豆叶药材的鉴别与质量控制提供参考；(2)通过在整体动物水平模拟心肌缺血再灌注损伤,观察木豆叶提取物对受损心肌的保护作用,并比较不同剂量的木豆叶提取物对大鼠缺血再灌注心肌的作用是否有差异；(3)通过对各项指标的检测,评估H202对H9c2细胞造成的损伤,确定木豆叶提取物及H202作用的最佳剂量,观察木豆叶提取物预处理对H202诱导的H9c2细胞氧化应激损伤后的保护作用；(4)通过应用PI3K抑制剂,观察木豆叶提取物对H202损伤后H9c2细胞p-Akt、eNOS以及p-eNOS蛋白表达的影响,探讨其可能的信号调控机制。研究方法(1)木豆叶提取物HPLC指纹图谱的建立。采用Diamonsil C18(2) (250 mm×4.6 mm,5μm),以甲醇-1%冰醋酸为流动相进行梯度洗脱,流速1.0 mL-min-1,柱温40℃,检测波长268 nm。(2)木豆叶提取物对雄性SD大鼠急性心肌缺血再灌注损伤保护作用的研究。采用健康SD雄性大鼠,结扎左冠状动脉前降支30min,再灌注90min建立心肌缺血再灌注损伤模型,记录缺血期间及再灌注期间心功能的变化；通过HE染色观察木豆叶提取物对缺血再灌注损伤心肌细胞形态学的影响；对各组心肌梗死面积进行统计；记录心率失常发生率及持续时间；检测大鼠血清中LDH、SOD、MDA、NO、GSH-PX、CK等生化指标的含量；(3)木豆叶提取物预处理对H202损伤后H9c2细胞保护作用及其作用机制的研究。采用MTT法,以过氧化氢(H202)作为外源性氧化应激刺激,观察木豆叶提取物对受损H9c2细胞活性的影响,以及木豆叶提取物对培养液上清LDH、SOD、MDA及NO含量的影响,并确定H202及木豆叶提取物作用的最佳剂量;采用Western-bloting方法分析木豆叶提取物对加入PI3K抑制剂预处理后的受损H9c2细胞内p-Akt、eNOS以及p-eNOS蛋白量的影响。研究结果采用高效液相色谱仪分析木豆叶水提物,分别建立了云南木豆叶和海南木豆叶水提物的指纹图谱,该方法精密度高、重现性和稳定性良好。对海南及云南两地木豆叶药材分别进行指纹图谱分析,结果显示,两地木豆叶药材共有指纹峰较多,确认其中1个峰的归属为牡荆苷。云南木豆叶水提物指纹图谱和海南木豆叶相比,色谱峰在数的方面基本相仿,即基本成分相似,但色谱峰在“量”的方面即色谱峰面积相差较大。整体动物实验表明,结扎大鼠左冠状动脉前降支所致心肌缺血再灌注损伤,模拟了许多心血管疾病共同的病理生理过程一氧自由基增多,木豆叶提取物可以改善大鼠心功能,减轻再灌注损伤造成的心肌细胞水肿、充血程度,缩小心肌损伤面积,降低血清中LDH、MDA、CK的含量,并提高SOD、NO、GSH-PX的含量。细胞实验表明,木豆叶提取物可以提高细胞存活力,降低细胞上清液中LDH的漏出量,升高SOD活性,降低MDA生成量,升高NO含量,抑制H9c2细胞因H202损伤后导致的细胞凋亡,上调p-Akt及p-eNOS蛋白量的表达。合用PI3K抑制剂LY294002可对抗木豆叶提取物的上述保护作用,结果提示PI3K可能是木豆叶提取物的保护作用通路上的信号靶点。研究结论本课题所建立的木豆叶指纹图谱具有较高的重现性、专属性和可行性,为木豆叶质量控制提供了新的手段,并且为木豆叶药理作用的进一步研究提供了物质基础。木豆叶水提物对结扎大鼠冠状动脉左前降支所致心肌缺血再灌注损伤和H2O2损伤的H9c2细胞均具有保护作用。初步表明木豆叶提取物可通过提高大鼠抗氧化酶活性,增强清除自由基能力,减轻缺血再灌注导致的自由基损伤。其作用机制推测为木豆叶提取物诱导心肌细胞产生适量NO作为触发因子激活其下游的PI3K,产生预适应样保护作用,上调蛋白p-Akt及p-eNOS的表达,从而产生心肌保护作用；上调的eNOS可进一步促进NO生成,延续木豆叶提取物在第二窗中的保护作用。
吴建伟[7]2009年在《大蒜素及缺血预处理对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究》文中提出目的:探讨大蒜素注射液预处理和缺血预处理对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用及机制。方法建立大鼠肾缺血再灌注模型。将75只SD大鼠随机分成对照组(CON)、缺血再灌注组(IR)、缺血预处理组(IPC)、大蒜素预处理组(APC)、大蒜素及缺血预处理组(AIPC)共5组,每组15只。手术方法:对照组:切除右肾但不夹闭左肾动脉;缺血再灌注组:采用切除右肾,夹闭左肾动脉45Min后恢复灌流建立肾缺血再灌注损伤模型;缺血预处理组:切除右肾,夹闭左肾动脉8min+再灌注5min,循环4次,之后夹闭左肾动脉45Min后恢复灌流;大蒜素预处理组:术前8h、4h,术后每8h一次共5次,给予腹腔内注射大蒜素(按20mg/kg)2ml,手术方式同缺血再灌注组;大蒜素及缺血预处理组:术前8h、4h,术后每8h一次共5次,给予腹腔内注射大蒜素(按20mg/kg)2ml,手术方式同缺血预处理组。各组均于术后24h采集肾组织标本及血样标本。采用肾组织HE染色,光镜下观察肾组织病理改变;全自动生化分析仪测定血清尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)水平反映肾功能损害程度;硫代巴比妥酸法(TBA)测定丙二醛(MDA)含量、黄嘌呤氧化酶法(XO)测定超氧化物歧化酶(SOD)活性间接反映肾脏的受损程度;运用免疫组化技术观察肾组织中粘附分子1(ICAM-1)的表达,以探讨肾损害的发生机制。结果1.肾脏病理改变,CON组:未发现明显异常;IR组:损伤较明显,大体观察:肾暗红色,肿胀明显,肾包膜张力高,包膜下可见点状出血灶,切面皮髓交接处可见线状充血出血带。光镜下:肾小管上皮细胞肿胀,不同程度的变性、坏死、脱落,可见断裂的基底膜。间质充血,有炎症细胞浸润。以皮髓交接处最为明显;IPC组和APC组两组肾脏病理改变相似,病理结果如下:大体观察:肾颜色稍暗,肿胀不太明显,切面皮髓交接处颜色稍深。光镜下:变性坏死程度较IR组轻,未见明显的基底膜断裂;AIPC组:大体形态与IPC组及APC组相似,光镜下以肾小管上皮细胞变性为主。2.肾脏功能:CON组:BUN(7.8±1.47)、Cr(43.6±2.67)维持在较低水平;IR组:BUN(54.96±3.45)、Cr(203.08±4.25)与CON组比较差异具有显着性意义(P <0.01);IPC组:BUN(40.16±2.54)、Cr(163.87±8.49)和APC组:BUN(42.13±1.86)、Cr(159.64±6.16):两组对比无显着性差异(P﹥0.05),分别与IR组比较,BUN和Cr均明显降低,存在显着性差异(P <0.01),但仍高于CON组(P <0.01);AIPC组BUN(33.53±3.29)、Cr(132.52±2.73):高于CON组(P <0.01),但与其余组比较均明显降低,存在显着性差异(P <0.01)。3.CON组中,血清MDA含量维持在较低水平(0.95±0.15);IR组中,MDA含量明显升高(2.2±0.21),与CON组比较,差异具有显着性意义(P<0.01);IPC组MDA(1.7±0.27)和APC组MDA(1.6±0.22):两组对比无显着性差异(P﹥0.05),分别与IR组比较,MDA含量明显降低,均存在显着性差异(P <0.01),但仍高于CON组(P <0.01);AIPC理组MDA(1.3±0.14)显着降低,但高于CON组(P <0.01),与其余组比较,仍明显降低,存在显着性差异(P <0.01)。4.CON组中,血清SOD活性维持正常水平(329.76±21.32);IR组中,SOD活性明显降低(201.51±14.53),与CON组比较,具有显着性差异(P<0.01);IPC组SOD(255.94±17.28)和APC组SOD(257.14±16.97):两组对比无显着性差异(P﹥0.05),分别与IR组比较,SOD活性明显升高,均存在显着性差异(P <0.01);AIPC组SOD(308.76±16.45)显着升高,与以上各组比较均存在显着性差异(P <0.01);5.光镜下肾组织中ICAM-1在CON组未见明显表达;IR组中可见大量ICAM-1表达,以肾小管内皮细胞上表达为主,毛细血管壁及间质也可见表达;IPC组和APC组ICAM-1表达减弱;AIPC组ICAM-1表达明显减弱,但是强于对照组。一般认为平均光密度值(MOD)能较准确的反映阳性产物颜色深浅的平均状况。平均光密度值:IPC组(0.2818±0.0147)和APC组(0.2741±0.0121)表达量强于AIPC组(0.1654±0.0139)(P <0.01),亦强于CON组(0.0645±0.0043)(P <0.01),但比IR组(0.3215±0.0263)弱(P <0.01);IPC组和APC组比较无显着性差异(P>O.05)。结论1.肾缺血45Min可导致缺血再灌注损伤的发生,出现明显的组织病理学损伤和破坏,肾功能显着下降。但损伤是可逆转的。2.肾缺血再灌注损伤后,MDA含量明显升高,SOD活性显着下降,而氧自由基损伤是再灌注损伤的一个重要原因,MDA含量可反映肾组织中自由基的含量,SOD在体内自由基清除系统起关键作用,说明MDA、SOD含量的变化间接反映了肾缺血再灌注损伤的程度。3.肾缺血再灌注损伤后, ICAM-1高表达于肾小管上皮细胞,而正常肾组织ICAM-1少有表达,而ICAM-1表达的水平越高,肾功能受损情况越重,说明ICAM-1在肾组织表达的水平可以反映肾受损程度。4.缺血预处理或大蒜素预处理能够减轻缺血再灌注后肾功能和肾组织结构的损害,对肾缺血再灌注损伤具有明显的保护作用;保护作用可能与减少MDA的含量和增强SOD的活性有关;5.缺血预处理及大蒜素预处理两种处理因素对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护有协同作用。可能是通过下调ICAM-1的表达来保护肾组织。
王庆高[8]2007年在《加味丹参饮预处理对大鼠心肌细胞延迟保护作用及细胞信号转导机理研究》文中认为目的:观察加味丹参饮(JDD)预处理对大鼠心肌细胞的延迟保护作用及其细胞信号转导机理。方法:实验分叁部分。第一部分:选用出生72h的大鼠,将培养72h的大鼠心肌细胞随机分6组。空白组正常培养;空白血清对照组加50%大鼠血清培养;含药血清对照组加含50%JDD的药物血清培养,缺氧/复氧(H/R)组予缺氧3h,再给氧1h;缺氧预处理(HPC)组、加味丹参饮预处理(JDDPC)组分别给予HPC、JDDPC,24h后再给予缺氧3h,再给氧1h。实验结束,以台盼蓝染色法观察各组细胞存活率,以比色法观察乳酸脱氢酶(LDH)、肌磷酸激酶(CK)的活性。第二部分:将培养72h的大鼠心肌细胞随机分8组,空白组、空白血清对照组、含药血清对照组、H/R组、HPC组、JDDPC组处理同第一部分;HPC+多粘菌素B(PMB)组预处理前先加入PMB,余处理同HPC组;JDDPC+PMB组预处理前先加入PMB,余处理同JDDPC组。实验结束,以台盼蓝染色法观察各组细胞存活率,以比色法观察LDH、CK的活性,以PepTag非放射性蛋白激酶试剂盒检测蛋白激酶C(PKC)。第叁部分:将培养72h的大鼠心肌细胞随机分8组,空白组、空白血清对照组、含药血清对照组、H/R组、HPC组、JDDPC组处理同第一部分;HPC+格列本脲(GLI)组预处理前先加入GLI,余处理同HPC组;JDDPC+GLI组预处理前先加入GLI,余处理同JDDPC组。实验结束,以台盼蓝染色法观察各组细胞存活率,以比色法观察LDH、CK的活性,以Fura-2/AM为指示剂检测细胞内钙离子浓度,以RT-PCR检测热休克蛋白70mRNA(HSP70mRNA)。结果:HPC组、JDDPC组细胞存活率明显高于H/R组(P＜0.01),LDH、CK明显低于H/R组(P＜0.01)。HPC+PMB组、HPC+GLI组细胞存活率、LDH及CK的活性与H/R组比较无显着性差异(P＞0.05)。JDDPC+PMB组、JDDPC+GLI组细胞存活率高于H/R组(P＜0.01),但低于HPC、JDDPC组(P＜0.01);LDH、CK的活性低于H/R组(P＜0.01),但高于HPC、JDDPC组(P＜0.01)。HPC组、JDDPC组PKC的活性、HSP70mRNA表达显着高于H/R组(P＜0.01),细胞内钙离子浓度显着低于H/R组(P＜0.01)。HPC+PMB组PKC活性、HPC+GLI组HSP70mRNA及细胞内钙离子浓度与H/R组比较无显着性差异(P＞0.05)。JDDPC+PMB组PKC活性、JDDPC+GLI组HSP70mRNA表达高于H/R组(P＜0.01或P＜0.05),但低于HPC、JDDPC组(P＜0.01);JDDPC+GLI组细胞内钙离子浓度低于H/R组(P＜0.01),但高于HPC、JDDPC组(P＜0.01)。结论:①加味丹参饮预处理具有延迟保护作用。②PKC的抑制剂PMB、ATP敏感性钾通道(K_(ATP))的抑制剂GLI能完全阻断HPC的延迟保护作用,说明PKC是HPC的信号转导通路,K_(ATP)为HPC的终末效应物,能减少钙超载,同时诱导HSP70的高表达。③PKC的抑制剂PMB、K_(ATP)的抑制剂GLI不能完全阻断加味丹参饮预处理的延迟保护作用,说明加味丹参饮预处理不完全通过PKC信号转导途径及K_(ATP)通道发挥延迟保护作用,提示加味丹参饮预处理能从多种途径、多个靶点启动心肌内源性的调控保护。
马周瑞[9]2008年在《参附注射液预处理对缺氧/复氧心肌细胞延迟性保护作用的实验研究》文中进行了进一步梳理目的:研究参附注射液预处理对缺氧/复氧心肌细胞的延迟保护作用的量效、时效关系并探讨其可能机制。方法:本实验采用原代培养的新生SD大鼠心肌细胞,建立细胞缺氧/复氧模型。采用细胞存活率和凋亡率(流式细胞术)、培养液中LDH活性(细胞LDH漏出率,全自动生化分析仪测定)、细胞培养液中MDA活性(细胞MDA漏出率,硫代巴比妥钠比色法)作为细胞受损指标,观察终浓度为100、200、400μl/ml的参附注射液预处理以及预处理6、12、24、48、72、96h后对心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响,并同时观察ERKs上游激酶MEK-1/2抑制剂PD098059及反义HIF-1α对参附注射液预处理诱导的心肌细胞延迟性保护作用及其诱导的HIF-lα表达的影响。具体实验分组如下:1.参附注射液预处理对缺氧/复氧心肌细胞的延迟保护作用的量效关系的实验研究:培养的细胞随机进入各实验分组:①空白对照(Control)组:细胞置于培养箱内继续培养28(2+24+2)h;②缺氧/复氧(H/R)组:细胞缺氧2h后复氧,常氧培养2h;③缺氧预处理(HPC)组:细胞缺氧20min,复氧后置培养箱内常氧培养24h,然后再进行H/R操作;④～⑥100μl/ml、200μl/ml、400μl/ml参附注射液预处理(SF-100、SF-200、SF-400)组:含不同浓度(100μl/ml、200μl/ml、400μl/ml)参附注射液的无血清培养基预孵育细胞10min,更换预平衡的无血清培养基后置培养箱内常氧培养24h,然后进行H/R操作。2.参附注射液预处理对缺氧/复氧心肌细胞的延迟保护作用的时效关系的实验研究:采用实验1确定的最佳预处理浓度(200μl/ml),按如下分组进行实验:①Control组,②H/R组,③HPC组,④～⑨参附注射液预处理后6h、12h、24h、48h、72h、96h缺氧/复氧(SF-6、SF-12、SF-24、SF-48、SF-72、SF-96)组。3.反义HIF-1α及ERK通路抑制剂PD098059对参附注射液预处理诱导的心肌细胞延迟性保护作用的影响的实验研究:采用实验1确定的最佳预处理浓度(200μl/ml)预处理心肌细胞并在实验2确定的最佳保护作用时段(预处理后12h)内进行H/R操作,具体分组如下:①Control组,②H/R组,③HPC组,④参附注射液预处理(SF)组,⑤参附注射液+反义HIF-1α(SF+iHIF-1α)组:参附注射液预处理前用含5.0μmol/L的反义HIF-1α培养基预孵育细胞10min,其余步骤同④;⑥参附注射液+ PD098059(SF+PD098059)组:参附注射液预处理前用终浓度为50μmol/L的PD098059预孵育细胞10min,其余步骤同④。取①③④⑥组细胞进行Western Blot检测心肌细胞HIF-1α蛋白表达量。结果:1.与对照组相比,H/R组细胞存活率降低34.20%而凋亡率增加22.15%(p<0.05),LDH和MDA漏出率分别增加110.26%、51.22%(p<0.05)。而HPC组与H/R组相比,细胞存活率增加22.16%,凋亡率降低11.34%(p<0.05),LDH和MDA漏出率分别减少70.77%、37.43%(p<0.05)。2. 100、200、400ul/ml浓度参附注射液预处理组较H/R组相比,细胞存活率分别增加5.90%、20.20%、20.86% (p<0.05),凋亡率分别降低8.29%、8.59%、8.44%(p<0.05),LDH和MDA漏出率分别减少34.52%、58.50%、52.74%和27.72%、33.71%、31.25%(p<0.05)。其中100ul/ml参附注射液预处理组与H/R组比较无显着性差异(p>0.05),200、400ul/ml参附注射液预处理组与H/R组相比有显着性差异(p<0.05),但与HPC组及二者之间并无显着性差异(p>0.05)。3. SF-6、SF-12、SF-24、SF-36、SF-48、SF-72参附注射液预处理组较H/R组相比,细胞存活率分别增加5.14%、15.75%、20.20%、20.52%、19.66%、17.81%而凋亡率分别降低4.82%、10.80%、8.59%、8.74%、7.68%、8.26%(p<0.05),LDH和MDA漏出率分降低34.32%、43.26%、58.50%、57.63%、59.92%、58.29%和20.47%、30.38%、33.69%、30.83%、31.78%、29.75%(p<0.05)。除SF-6组与HPC组相比有显着性差异外(p>0.05),其余各组与HPC组相比无显着性差异且组间无显着性差异(p<0.05)。4. HPC组、SF组与H/R组相比,细胞存活率分别增加22.16%、20.20%,凋亡率分别降低11.34%、8.59%,LDH和MDA漏出率分别减少70.77%、58.50%和37.43%、33.71%,此两组结果与H/R组相比有显着差异(p<0.05)且此两组间差异无显着性(p>0.05)。而SF组+反义HIF-1α组、SF组+PD098059组与H/R组相比,细胞生存率分别增加6.04%、7.89%而凋亡率分别减少4.59%、5.41%,LDH和MDA漏出率较H/R组分别减少10.91%、17.69%和11.76%、12.57%,结果无显着差异(p>0.05);但此两组与HPC组相比,细胞生存率分别减少16.12%、14.27%,LDH和MDA漏出率较H/R组分别增加59.86%、53.08%和24.67%、23.86%,结果有显着性差异(p<0.05)。5. Western Blot结果显示:对照组HIF-1α所在的120kD蛋白条带灰度值为0.427,HPC组为0.837,SF组为0.783,后二组较对照组分别高0.410和0.35(6p<0.01),且后二组间无显着性差异(p<0.01),而PD098059组HIF-1α表达(灰度值为0.566)与SF组及HPC组相比则明显受到抑制(p<0.05).结论:1.参附注射液预处理可以模拟缺氧预处理对缺氧/复氧乳鼠心肌细胞延迟性保护作用; 2. 200μl/ml的参附注射液预处理即可诱导对缺氧/复氧乳鼠心肌细胞的延迟性保护作用,其有效剂量为200～400μl/ml; 3.参附注射液预处理后12h即可产生对缺氧/复氧乳鼠心肌细胞的延迟性保护作用,有效保护期为12～96h; 4.参附注射液预处理对缺氧/复氧乳鼠心肌细胞的延迟性保护作用与ERKs介导的HIF-1α上调有关。
谷万里[10]2007年在《大蒜素对寒凝血瘀心肌缺血气体信号分子调控及微循环影响的研究》文中认为背景:冠心病心绞痛、急性心肌梗死(AMI)是临床最常见的心肌缺血性疾病,均属于中医血瘀证范畴。寒凝血瘀是缺血性心脏病临床常见的中医证型,前期临床研究表明,大蒜素能够作用于冠心病心绞痛的多个发病环节,具有中药多靶点起效的特性,对缺血心肌有良好的保护作用,尤其对寒证的治疗作用明显优于热证。大蒜素对寒凝血瘀证的治疗作用与历代文献记载的大蒜具有温通活血作用颇为一致,提示大蒜素也可能具有温通活血的作用,发挥对寒凝血瘀心肌缺血的治疗作用。目的:探讨大蒜素对寒凝血瘀心肌缺血的作用机制,从大蒜素对气体信号分子调控和对微循环的改善,揭示大蒜素温通活血治疗寒凝血瘀心肌缺血的病理生理及药理机制,并对血瘀证和寒凝血瘀心肌缺血患者的微循环进行观测。方法:本研究分为理论探讨、实验研究和临床研究叁大部分。(1)理论探讨:围绕研究目的,从寒凝血瘀心肌缺血的证治研究、气体信号分子与活血化瘀研究、冠脉微循环障碍的中西医结合研究叁方面进行了理论探讨。(2)实验研究:①首先采用间断反复冷应激和垂体后叶素(Pit)联合造模的方法,建立了大鼠寒凝血瘀心肌缺血病证结合模型:将大鼠分别装入笼内,置于-5℃±1℃环境中,连续3h,使大鼠全身暴露于低温环境。然后将大鼠取出,恢复20℃±1℃室温,并给予Pit20U/kg/d腹腔注射,连续3天。造模第3天,大鼠寒凝血瘀心肌缺血模型造模成功。同时,从大鼠外观状况、体温、舌耳微循环血氧饱和度(StO2)、心电图、血液生化指标、心肌病理、染色等方面对模型进行了综合评价。②在大鼠寒凝血瘀心肌缺血动物模型的基础上,观察了大蒜素对寒凝血瘀心肌缺血的一般生理指标(证候、体温、心电图)、生化指标(FT3、FT4、TSH、cTnT、MDA、SOD)、血管舒缩活性肽(CGRP、ET)、心肌病理的作用。③从大蒜素对气体信号分子NO、NOS、H2S和对心肌eNOS、ET-1mRNA表达的影响,研究了大蒜素对寒凝血瘀心肌缺血的气体信号分子调控机制。④从可视光微循环StO2、微血管内皮细胞Caveolin-1、CD34、心肌毛细血管超微结构,研究了大蒜素对寒凝血瘀心肌缺血微循环的影响。(3)临床研究:①通过对健康成人筛查,取得舌、面部可视光StO2正常值,并测定血瘀证患者活血化瘀治疗前后的舌、面部可视光StO2,对血瘀证的微循环功能进行了临床研究。②通过对急诊PCI及溶栓治疗后的急性期AMI患者进行超声心动图和MCE检查,评价心肌微循环,观测寒凝血瘀心肌缺血的心肌微循环特点。结果:(1)大鼠外观状况观察评价,符合中医寒凝血瘀证候表现:耳温和肛温降低分别反映了寒冷因素对外周和内部体温的影响;耳、舌StO2降低表明外周微循环的功能减退;心电图J点的变化可判断心肌缺血模型的成立;心脏StO2降低表明心肌微循环功能受损;心率的减慢、血清FT3、FT4、TSH的降低反映了寒的征象;血浆ET的增高反映了血管痉挛、血瘀的情况;心肌组织病理切片、染色证实了模型心肌缺血、坏死的存在。应用具有热性药属性的抗心肌缺血药硝酸甘油治疗进行反证,显着改善了各项指标,验证了模型的寒凝血瘀心肌缺血诊断。综合上述各项指标,可以确定采用间断反复冷应激和Pit联合造模的方法建立的大鼠寒凝血瘀心肌缺血病证结合模型成立,符合中医理论。(2)大蒜素对寒凝血瘀心肌缺血的一般指标、生化指标、血管舒缩活性肽调节、心肌病理均有改善作用:低剂量大蒜素可明显减少寒凝血瘀心肌缺血大鼠心肌中MDA含量,增加SOD活力。(3)在对气体信号分子调控机制方面,大蒜素低剂量明显能上调eNOSmRNA表达,促进eNOS的合成,显着提高大鼠心肌组织NOS、NO含量;中剂量能显着提高血浆H2S含量,降低心肌组织H2S合酶含量。(4)在微循环方面,大蒜素中、低剂量能显着提高寒凝血瘀心肌缺血大鼠的耳、舌、心脏StO2,大蒜素中剂量能显着降低Caveolin-1的表达,增加CD34的表达,减轻心肌超微结构病变程度,有改善微循环的作用。(5)临床研究表明,可视光StO2面部最低,口唇最高;舌各部位的StO2值以舌面最高,活血化瘀治疗后各部位StO2明显增高。(6)超声心动检查寒凝血瘀证患者对负荷试验的反映更明显,MCE心尖k值显着低于非寒凝血瘀证。结论:(1)间断反复冷应激和Pit联合造模的方法建立的大鼠寒凝血瘀心肌缺血模型符合中医证候特点。(2)大蒜素具有多重作用机制,能针对寒凝血瘀心肌缺血的多个发病环节,通过调控气体信号分子和改善微循环,多层面发挥对缺血心肌的保护作用,以中、低剂量作用最佳。①大蒜素能提高心肌组织抗氧化能力,保护缺血心肌;通过调控血管活性肽CGRP、ET的作用,拮抗由于造模因素所致的冠脉痉挛收缩,舒张血管,改善心电图J点变化,降低cTnT,减轻心肌缺血损伤。②大蒜素对寒凝血瘀心肌缺血的气体信号分子调控机制是:通过上调eNOSmRNA表达,下调ET-1mRNA表达,升高NOS,促进NO的释放,同时下调H2S,多方面发挥对缺血心肌的保护作用。③大蒜素对寒凝血瘀心肌缺血的心肌微循环具有改善作用:能增加心肌组织毛细血管数量,作用于微血管内皮细胞的Caveolin-1,升高外周耳、舌和心肌组织的StO2,维持心肌氧供和氧利用,改善微循环功能。(3)可视光StO2测定是一种新的定量评价组织微循环功能的指标,对血瘀证舌、面部望诊的客观化研究有重要价值。(4)AMI患者介入治疗后MCE检测,寒凝血瘀者较非寒凝血瘀者心肌微循环受损有加重趋势。(5)应用中药大蒜的单体化合物有效成分大蒜素,也要辨证用药,才能发挥其最大功效。
参考文献：
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[3]. 大蒜素预处理对乳鼠心肌细胞缺氧复氧延迟保护作用的研究[J]. 傅俊英, 刘秀华, 史载祥, 蔡莉蓉. 中日友好医院学报. 2003
[4]. 大蒜素在乳鼠心肌细胞延迟预处理作用的实验研究[C]. 傅俊英, 刘秀华, 史载祥, 王彦贞, 张久亮. 第二届中日韩血瘀证及活血化瘀研究学术大会论文集. 2003
[5]. 大蒜素对大鼠心肌细胞缺氧/复氧、缺血/再灌注损伤保护作用及其机制研究[D]. 史春志. 华中科技大学. 2006
[6]. 木豆叶指纹图谱及其提取物对心肌缺血再灌注损伤保护作用的研究[D]. 孙琳. 广州中医药大学. 2011
[7]. 大蒜素及缺血预处理对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究[D]. 吴建伟. 重庆医科大学. 2009
[8]. 加味丹参饮预处理对大鼠心肌细胞延迟保护作用及细胞信号转导机理研究[D]. 王庆高. 湖南中医药大学. 2007
[9]. 参附注射液预处理对缺氧/复氧心肌细胞延迟性保护作用的实验研究[D]. 马周瑞. 苏州大学. 2008
[10]. 大蒜素对寒凝血瘀心肌缺血气体信号分子调控及微循环影响的研究[D]. 谷万里. 北京中医药大学. 2007