福建卫生职业技术学院
摘要：目的：通过不同物料比和提取时间，优化石菖蒲挥发油的提取工艺，并观测石菖蒲挥发油的体外抗菌活性。方法：采用水蒸汽蒸馏法提取石菖蒲挥发油，对物料比和提取时间进行优化选择；采用液体稀释法测定石菖蒲挥发油对临床常见病原菌的最小抑菌浓度（MIC）。结果：石菖蒲与水为1：7的比例，提取7h，挥发油得率高，累计得率达95%以上。抑菌试验表明石昌蒲挥发油对表皮葡萄球菌、A群链球菌以及福氏志贺菌抑菌作用最强，三者的MIC均为0.0021g/ml；对白色念珠菌的MIC为0.0657g/ml；对金黄色葡萄球菌的MIC为0.1313g/ml；对B群链球菌和伤寒沙门菌的MIC均为0.2625g/ml。
关键词：石菖蒲；挥发油；MIC
石菖蒲为天南星科植物石菖蒲（AcoruslatarinowiiSchott）的根茎，味辛、苦，性温，归心、肝、肺、脾、胃经，具有健胃祛风、活血止痛、开窍豁痰、醒神益智、消肿、解毒、杀虫之功效，临床常用于治疗胃肠系统疾病、偏头痛、瘀血头痛、热病神昏、癫狂、健忘、痴呆、耳聋、耳鸣、痰厥、胸腹胀满、胃肠绞痛、痈疖肿痛、跌打损伤等［1］。其主要成分有挥发油、有机酸、糖、氨基酸等。而挥发油的主要成分为β-细辛醚，此外还有α-细辛醚、甲基异丁香酚、榄香素、α-甜没药萜醇、β-蒎烯、桧脑、龙脑、桉油、土青木香烯、丁香酚甲醚、甲基丁香酚等［2］。近十多年药理研究发现，石菖蒲挥发油对心血管系统具有多种保护作用［3］，对胃肠道和支气管平滑肌具有解痉作用［4］，同时还具有镇静和抗癫痫等药理作用［5］。彭萌[6]收录验方：石菖蒲加水适量，煎煮，加食醋煮沸治手足癣，有报道石菖蒲植物水提取物对芒果碳疽菌、香蕉尖孢镰刀菌有抑制作用［7］，而石菖蒲微波水提液具有抑菌作用[8]。但未见其挥发油的抗菌研究报道。而通常植物挥发油都有一定的抑菌效应，因此本研究考察石菖蒲挥发油对临床常见病原菌的抑菌活性。
1材料与仪器
1.1药物中药石菖蒲（AcorustararinoiiSchott），购自福建省药材公司，批号：20141216。
1.2培养基：营养肉汤：杭州滨和微生物试剂有限公司，批号：131220；特级新生牛血清：杭州江滨生物技术有限公司，批号：20120406；营养琼脂：杭州滨和微生物试剂有限公司，批号：150117；绵羊血：苏州莱士输血器材有限公司，批号：141110；无菌生理盐水等。其他：革兰染色液。微量移液器等。
1.3菌株来源金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）ATCC25923、表皮葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、A群链球菌（groupAstreptococci）（ATCC19615）、B群链球菌（GroupBStreptococcus）、肺炎链球菌（streptococcus）、肠球菌（Enterococcus）、白色念珠菌（Moniliaalbican）、大肠埃希菌（ATCC25922）、福氏志贺菌（Shigellaflexneri）、宋内志贺菌（Shigellasonnei）、伤寒沙门菌（Salmonellatyphi）、乙型副伤寒沙门菌（Salmonellaparatyphi）、肺炎克雷伯菌（K.peneumoniae）（ATCC700603）、普通变形杆菌、铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）（ATCC27853）等15种菌种，其中标准菌株购自杭州滨和微生物试剂有限公司，临床分离菌株由福建医科大学附属协和医院和附属第一医院微生物实验室提供。
1.4仪器蒸馏装置6套，电子秤（型号11G0007，武汉自动化仪表厂），双层铁皮电炉（型号A型50Hz，上海深航五金电器厂丹阳分厂），恒温培养箱（型号DHZ-032，上海申能博采仪器有限公司），超净工作台（型号CJ-1B，北京半导体设备一厂）；立式自动电热压力蒸汽灭菌器（LDZX-40BI型，上海申安医疗器械厂），生物安全柜（BSC-1500A2-X，济南鑫贝西生物技术有限公司），电子天平（AL204型，瑞士梅特勒托利多仪器上海有限公司）。
2.方法
2.1石菖蒲挥发油的提取
提取工艺流程：称取→投料→加热→回流→冷却→油水分离→收集挥发油
2.1.1不同加水量提取实验分为三组，第一组：石菖蒲饮片180g，分成6份，每份30g，分别加入蒸馏水100ml，浸泡2h，按提取工艺蒸馏法提取，蒸馏时间5h。第二、三组加蒸馏水量分别150ml、190ml，其他方法与第一组相同。结果见表1。
2.1.2不同蒸馏时间提取实验根据蒸馏时间不同设为1h、3h、5h、7h、9h五个组。每组取石菖蒲饮片180g，分成6份，每份30g，分别加入210ml蒸馏水浸泡2h，按提取工艺以一定时间蒸馏提取，不同时间收油量，并计算累计挥发油得率。结果见表2。
2.2石菖蒲挥发油抗菌活性及MIC测定
2.2.11‰二甲亚砜无菌肉汤配制：取200ul的二甲亚砜加入200ml无菌肉汤中，制备含1‰二甲亚砜无菌肉汤，分装于无菌试管，分为15组，每组10根，每管1ml。
2.2.2石昌蒲挥发油稀释液配制：分别吸取1ml的石菖蒲挥发油提取液加入每组第1根无菌肉汤中，混匀，吸取1ml1：2稀释液于第2根含1‰二甲亚砜无菌肉汤中，混匀，依次倍比稀释，直至第9根，第10根作为阴性对照。
2.2.3菌种分离培养、鉴定与保存：分别将金黄色葡萄球菌（ATCC25923）、表皮葡萄球菌、A群链球菌（ATCC19615）、B群链球菌、肺炎链球菌、肠球菌、白色念珠菌、大肠埃希菌（ATCC25922）、福氏志贺菌、宋内志贺菌、伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌、肺炎克雷伯菌（ATCC700603）、普通变形杆菌、铜绿假单胞菌（ATCC27853）等15种菌种分离培养于血平板，需氧培养18～24小时，经形态检查、生化鉴定为纯培养后，于－20℃保存菌种。
2.2.4菌液配制：将－20℃保存的15种菌种复苏后，接种于血平板，培养18～24小时，经革兰染色镜检鉴定后纯培养，将纯培养菌落用无菌生理盐水稀释，用比浊仪进行比浊，菌液浓度为0.5×108cfu/ml，浊度相当于0.5号麦氏标准比浊管。再将菌液用无菌生理盐水稀释成5×105cfu/ml的浓度，备用。
2.2.5MIC测定：用微量移液管分别吸取配制好的5×105cfu/ml浓度的15种菌种的菌液50μl，分别加入石昌蒲挥发油稀释液和对照管中，其中加A群链球菌，B群链球菌，肠球菌，肺炎链球菌菌悬液的试管，每管再加入10ul的小牛血清。放置35℃培养，培养18～24小时，观察试管中有无细菌生长，以无菌生长的最低含石昌蒲挥发油浓度为该石昌蒲挥发油的MIC。结果见表3。
3结果
3.1石菖蒲挥发油的提取结果
3.1.1不同加水量提取结果
结果表明，加石菖蒲30g，加水量220ml时，得率最高，但加水量190ml时，挥发油得率与加水量220ml组得率相当，由于试验用小容积的蒸馏瓶分组提取，加水量过多，会溢出，影响挥发油的收集，故选用210ml蒸馏水（即水与药材的比值为7：1倍左右）提取。
3.1.2不同蒸馏时间提取结果
从表3可见，石菖蒲挥发油对表皮葡萄球菌、A群链球菌以及福氏志贺菌抑制作用最强，三者的MIC均为0.0021g/ml；对白色念珠菌MIC为0.0657g/ml；对金黄色葡萄球菌MIC为0.1313g/ml；对B群链球菌与伤寒沙门菌MIC均为0.2625g/ml。石菖蒲挥发油稀释液对革兰阳性球菌的肺炎球菌、肠球菌以及革兰阴性杆菌的大肠埃希菌、宋内志贺菌、乙型副伤寒沙门菌、肺炎克雷伯菌和普通变形杆菌无抑制作用。
4讨论
石菖蒲中挥发油的主要成分为β-细辛醚，此外还有α-细辛醚、甲基异丁香酚、榄香素、α-甜没药萜醇、β-蒎烯、桧脑、龙脑、桉油、土青木香烯、丁香酚甲醚、甲基丁香酚等。且近十多年药理研究发现，石菖蒲挥发油对心血管系统具有多种保护作用，对胃肠道和支气管平滑肌具有解痉作用，同时还具有镇静和抗癫痫等药理作用。石菖蒲与水为1：6的比例，即石菖蒲饮片30g，蒸馏水190ml，提取7h，挥发油得率高，累计得率达95%以上；抑菌试验表明石昌蒲挥发油对表皮葡萄球菌、A群链球菌以及福氏志贺菌抑菌作用最强，三者的MIC均为0.0021g/ml；对白色念珠菌的MIC为0.0657g/ml；对金黄色葡萄球菌的MIC为0.1313g/ml；对B群链球菌与伤寒沙门菌的MIC均为0.2625g/ml。而对肺炎球菌、肠球菌、大肠埃希菌、宋内志贺菌、乙型副伤寒沙门菌、肺炎克雷伯菌和普通变形杆菌抑菌作用，本研究显示无抑制作用。通过此次对小鼠耳廓肿胀度的抗炎试验显示，石昌蒲挥发油局部外用无明显抗炎作用。因石菖蒲挥发油对真菌白色念珠菌具有抗菌的效果，而对其他真菌是否也具有抗菌效果还有待研究。石菖蒲挥发油具有强烈刺激的气味，涂抹在皮肤上许多人较难接受，需要掩盖其气味。
参考文献：
［1］王争，王曙光，侯中华.石菖蒲成分及药理研究概况[J].中国药业，2012，21（11）：222-225.
［2］曾志，叶雪宁，沈妙婷.不同产地石菖蒲挥发性成分分析[J].分析测试学报，2011，30（4）：407-412.
［3］吴启端，吴清和，王绮文等.石菖蒲挥发性及B细辛迷的抗血栓作用[J].中国新药与临床药理，2008，19（1）：29-31.
［4］徐建民.石菖蒲挥发性及B细辛迷对支气管哮喘的影响[J].广州中医药大学学报，2007，24（2）：152-154.
［5］吴启端，东永奇，李今等.不同剂量石菖蒲对中枢神经系统影响实验研究[J].广东药学院学报，2005，16（9）656-658.
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［7］何衍彪，詹儒林，赵艳龙，石菖蒲提取物对芒果碳疽菌香蕉尖孢镰刀菌的抑制作用[J]，云南农业大学学报，2006，21（6）：728-732.
［8］邱腾颖，郑韵芳，杨宏芳等.石菖蒲微波水提液的抗炎作用研究[J]．海峡药学，2013，25（7）50-51.
基金项目：课题号：福省省教育厅科技项目（项目号：JB13320）。