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大豆GmFT3a基因的克隆与功能分析

2020-12-10阅读(254)

大豆GmFT3a基因的克隆与功能分析

论文摘要

开花是植物从营养生长向生殖生长转变的重要标志,出苗到开花所需时长受到外在环境和内在基因共同调控。FT基因家族是植物中多条开花调控途径的重要整合因子,在拟南芥中过量表达FT基因可促进其开花。在大豆中有10个FT同源基因,除GmFT2a、GmFT5a和GmFT1a基因功能在大豆中得以验证,其余仍有多个FT基因功能尚未明确。本研究通过对大豆FT家族中GmFT3a基因进行克隆和相关功能研究,由此为深入研究大豆开花分子机制提供理论依据,并为培育不同光周期敏感性和广适应性大豆准备育种材料。本实验从光周期敏感的自贡冬豆中克隆GmFT3a基因,运用生物信息学相关软件及网站对该基因及其启动子序列进行分析,采用实时荧光定量方法检测GmFT3a在不同生育期组大豆材料、不同组织部位的表达量和48h表达模式,通过构建P16318-GmFT3a-GFP融合表达载体对拟南芥原生质体进行转化并完成蛋白亚细胞定位,利用农杆菌介导的转基因技术分别获得拟南芥和大豆GmFT3a过表达植株,分析其开花表型及开花调控相关基因的表达情况,明确其在开花途径中的分子功能。主要结果如下:1.GmFT3a基因位于大豆基因组16号染色体上,CDS区528bp,编码175个氨基酸,其中第27至第164位氨基酸为保守性较高的磷脂酰乙醇胺结合蛋白（Phosphatidyl Ethanolamine-Binding Protein,PEBP）家族结构域。GmFT3a蛋白三级结构与AtFT和GmFT2a蛋白高度相似。GmFT3a上游启动子中含有组织特异性表达元件、光响应元件、赤霉素响应元件和温度响应元件。在大豆中GmFT3a与GmFT3b蛋白同源性最高,其次为GmFT2a蛋白。2.实时荧光定量分析发现GmFT3a基因在大豆不同组织中均有表达但在三出复叶中表达量最高;48h内表达分析结果表明GmFT3a无明显的昼夜节律,但在光照后4h出现表达峰值;不同生育期组大豆品种中表达量测定结果表明在长日条件下,生育期组（MG）000组和（MG）VII组的表达量要高于其它各组;在短日条件下,高生育期组（MG）000和（MG）00两组中的GmFT3a的表达量要高于其它各组。3.拟南芥原生质体和转化的亚细胞定位结果发现,GmFT3a蛋白在细胞质和细胞核中表达,同GmFT2a一致,表明GmFT3a可能具有转录因子的活性。4.在长日条件下,过表达GmFT3a转基因拟南芥植株出现极显著早花表型（P<0.01）,各过表达GmFT3a株系开花平均时间相比于野生型拟南芥的开花时间提前3.3天（P<0.01）;各过表达拟南芥株系平均叶片总数（茎生叶+莲座叶）与野生型拟南芥相比减少29.5%,呈极显著减少（P<0.01）;过表达拟南芥植株中内源基因FT、CO和SOC1基因的表达量均极显著升高（P<0.01）,表明GmFT3a基因在拟南芥中的过表达促进其内源FT基因和其它与开花调控相关基因的表达量升高。5.在长日条件下,大豆T2代过表达GmFT3a转基因植株出现显著早花表型（P<0.05）,各株系平均开花时间相比于对照的开花时间提前6.2天;但在短日照条件下其开花时间并无显著改变（P>0.05）;长日条件下T2代转基因植株中GmFT3a、GmFT3b和GmFT1b的表达量极显著升高（P<0.01）,而GmFT2a、GmFT5a和GmFT1a的表达量极显著下降（P<0.01）,表明GmFT3a基因与FT基因家族其它基因可能存在功能冗余或互补关系,起促进和抑制开花功能的基因在不同情况下基因表达量发生变化,符合“跷跷板”模型提出的开花分子调控机制。综上研究结果,结合过表达GmFT3a转基因大豆植株出现显著早花表型及开花调控相关基因的表达量结果,说明GmFT3a对开花起潜在促进作用。通过GmFT3a基因功能研究,可为进一步解析大豆FT基因家族对大豆开花调控通路的分子机制提供理论参考。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第1章 文献综述
  •   1.1 植物开花诱导途径
  •     1.1.1 赤霉素途径
  •     1.1.2 自主途径
  •     1.1.3 年龄途径
  •     1.1.4 春化途径
  •     1.1.5 温度途径
  •     1.1.6 光周期途径
  •   1.2 开花诱导途径中FT的地位及功能
  •   1.3 大豆光周期开花诱导途径
  •   1.4 农杆菌介导的遗传转化
  •   1.5 研究的目的与意义
  •   1.6 试验技术路线
  • 第2章 大豆GmFT3a基因的克隆及生物学分析
  •   2.1 试验材料
  •     2.1.1 试验材料
  •     2.1.2 试验药剂
  •   2.2 试验方法
  •     2.2.1 植物总RNA的提取
  •     2.2.2 cDNA的合成
  •     2.2.3 引物设计
  •     2.2.4 GmFT3a基因片段扩增
  •     2.2.5 PCR产物回收、连接
  •     2.2.6 连接产物的转化和阳性克隆的鉴定及测序
  •     2.2.7 GmFT3a的生物信息学分析
  •   2.3 结果与分析
  •     2.3.1 GmFT3a的克隆
  •     2.3.2 GmFT3a基因的生物信息学分析
  •   2.4 讨论
  •   2.5 小结
  • 第3章 大豆GmFT3a表达模式分析
  •   3.1 试验材料
  •     3.1.1 植物材料
  •     3.1.2 试验药剂
  •   3.2 试验方法
  •   3.3 结果与分析
  •     3.2.1 GmFT3a组织特异性表达分析
  •     3.2.2 48 h内 GmFT3a表达模式分析
  •     3.2.3 GmFT3a不同生育期组品种表达分析
  •   3.4 讨论
  •   3.5 小结
  • 第4章 大豆GmFT3a蛋白的亚细胞定位
  •   4.1 试验材料
  •     4.1.1 试验材料
  •     4.1.2 试验药剂
  •     4.1.3 试验仪器
  •   4.2 试验方法
  •     4.2.1 构建融合表达载体p16318-GmFT3a-GFP
  •     4.2.2 质粒浓缩
  •     4.2.3 拟南芥原生质体制备与转化
  •   4.3 结果与分析
  •     4.3.1 融合表达载体p16318-GmFT3a-GFP构建
  •     4.3.2 GmFT3a蛋白的亚细胞特异性表达
  •   4.4 讨论
  •   4.5 小结
  • 第5章 拟南芥过表达GmFT3a基因功能分析
  •   5.1 试验材料
  •     5.1.1 试验材料
  •     5.1.2 试验表达载体及菌株
  •     5.1.3 试验药剂
  •     5.1.4 试验仪器
  •   5.2 试验方法
  •     5.2.1 构建pCAMBIA1300-GmFT3a-GFP表达载体
  •     5.2.2 pCAMBIA1300-GmFT3a-GFP表达载体的电击转化
  •     5.2.3 拟南芥浸染转化
  •     5.2.4 拟南芥T1 代阳性种子筛选
  •     5.2.5 拟南芥T5 代植株表型及基因表达量分析
  •   5.3 结果与分析
  •     5.3.1 拟南芥转化载体pCAMBIA1300-GmFT3a-GFP构建
  •     5.3.2 转基因GmFT3a拟南芥的获得与鉴定
  •     5.3.3 转基因GmFT3a拟南芥的表型分析
  •   5.4 讨论
  •   5.5 小结
  • 第6章 大豆过表达35S::GmFT3a转基因植株获得与鉴定
  •   6.1 试验材料
  •     6.1.1 试验材料
  •     6.1.3 表达载体与菌株
  •   6.2 试验方法
  •     6.2.1 pTF101.1-GmFT3a表达载体的构建
  •     6.2.2 pTF101.1-GmFT3a表达载体的电击转化
  •     6.2.3 农杆菌介导的大豆子叶节转化流程
  •     6.2.4 转基因大豆植株初步鉴定
  •   6.3 结果与分析
  •     6.3.1 构建pTF101.1-GmFT3a大豆转化载体
  •     6.3.2 转基因GmFT3a大豆的获得与鉴定
  •       6.3.2.1 转基因GmFT3a大豆的获得
  •       6.3.2.2 转基因GmFT3a大豆DNA的分子鉴定
  •       6.3.2.3 T2 代转基因GmFT3a大豆的表型分析
  •       6.3.2.4 GmFT3a过表达大豆植株中GmFT基因表达量分析
  •   6.4 讨论
  •   6.5 小结
  • 全文结论
  • 参考文献
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 王翊宁

    导师: 于丽杰,韩天富

    关键词: 大豆,光周期,开花,基因功能

    来源: 哈尔滨师范大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,生物学,农作物

    单位: 哈尔滨师范大学

    基金: 国家重点研发计(2017YFD0101400),国家大豆产业技术体系建设专项(CARS-04),中国农科院农业科技创新工程

    分类号: Q943.2;S565.1

    总页数: 97

    文件大小: 6514K

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