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O型口蹄疫病毒非结构蛋白3B影响宿主天然免疫的机理

2020-12-02阅读(770)

O型口蹄疫病毒非结构蛋白3B影响宿主天然免疫的机理

论文摘要

口蹄疫（Foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）引起的偶蹄动物的烈性传染病,对全世界和我国的畜牧业危害极大。天然免疫应答是机体抵抗病原入侵的第一道防线,在抵抗病原传播和疾病的发展过程中发挥重要的作用,其中视黄酸诱导基因蛋白Ⅰ介导的信号通路能够在FMDV入侵宿主细胞后被激活,诱导Ⅰ型干扰素和炎性因子的合成与分泌来抑制FMDV的增殖。FMDV 3B蛋白（VPg）的结构相对稳定,活性较低,当3B蛋白的结构和活性正常时,宿主细胞内才可产生感染性强的病毒。早期对宿主抗FMDV感染的研究发现,FMDV侵入机体后能调控宿主天然免疫,从而诱导Ⅰ型干扰素释放,FMDV的多个结构蛋白及非结构蛋白,以及基因组RNA均参与了这一调控过程。目前关于FMDV 3B蛋白的研究较少,它在FMDV复制过程中的功能,以及其与宿主蛋白的相互作用尚不清楚。本研究以FMDV 3B蛋白为诱饵蛋白,利用免疫共沉淀-质谱联用技术在宿主细胞中筛选与FMDV 3B蛋白相互作用的宿主蛋白,从中选取天然免疫系统中的重要相关蛋白,并利用病毒感染、基因过表达和siRNA干扰试验等方法研究FMDV非结构蛋白3B影响宿主先天性免疫的机理,获得了以下结果。1.在PK-15细胞中筛选到了与FMDV 3B蛋白相互作用的宿主蛋白。以FMDV China/1/99株基因组为模板,扩增了3B的核苷酸序列,构建了重组载体Flag-3B、Flag-GFP并将其转染到PK-15细胞中表达,通过Western blot检测蛋白表达量和荧光显微镜观察GFP的表达,确定目的蛋白的最佳表达时间为转染后36 h,所以选取36 h时收获细胞用于免疫共沉淀试验。然后以FMDV的3B蛋白为诱饵蛋白,进行针对Flag抗体的免疫共沉淀试验,沉淀与3B蛋白相互作用的宿主蛋白,沉淀产物进行质谱分析,最后从质谱结果中选取了天然免疫系统中的中枢接头蛋白——病毒诱导信号接头蛋白（VISA）作为下一步的研究对象。2.FMDV 3B蛋白与VISA蛋白在细胞内和细胞外均存在相互作用。前面用免疫共沉淀-质谱联用技术筛选到了与FMDV 3B蛋白相互作用的宿主细胞蛋白VISA。为了避免试验结果假阳性的存在,进一步利用免疫共沉淀和GST pull-down验证3B蛋白和VISA蛋白在体内和体外的相互作用。首先从PK-15细胞中扩增到了VISA的核苷酸序列并构建了真核表达载体VISA-Myc,将质粒VISA-Myc转染至293T细胞中表达,用Western blot检测到VISA蛋白在293T细胞中表达成功。将VISA-Myc与Flag-3B共转PK-15细胞中,用Anti-Flag琼脂糖珠进行免疫共沉淀试验,然后用兔抗Myc多克隆抗体在沉淀物中检测到了VISA-Myc蛋白的存在,证明3B蛋白能够与VISA蛋白在细胞内相互作用。然后在大肠埃希菌中原核表达融合蛋白GST-3B,Western blot证明其最佳表达时间为诱导后6 h,同时在293T细胞内转染表达融合蛋白VISA-Myc,提取融合蛋白进行GST pull-down试验,用兔抗Myc多克隆抗体在沉淀物中检测到了VISA-Myc蛋白的存在,证明3B蛋白与VISA蛋白在细胞外也存在相互作用。为了鉴定3B蛋白与VISA蛋白的互作区域,构建了一系列3B截断体质粒Flag-3B1、Flag-3B2和Flag-3B3,用免疫共沉淀试验鉴定出与VISA蛋白相互作用的是3B3蛋白。3.VISA蛋白对FMDV增殖的影响。FMDV感染PK-15细胞后,分别检测感染后0h、2h、4h、6h、8h、12h和24h VISA基因转录和蛋白表达的情况,荧光定量PCR检测发现FMDV的mRNA量和VISA的mRNA量都随着FMDV感染时间的延长而升高,提示在PK-15细胞中FMDV的感染能够上调VISA基因的转录;Western blot检测内源性VISA蛋白量随着FMDV感染时间的延长而逐渐降低。在PK-15细胞中转染不同浓度的VISA-Myc质粒,并于转染后24 h接种1MOI FMDV,荧光定量PCR证明随着VISA-Myc质粒转染量的增加,VISA mRNA量明显增加,同时FMDV的mRNA量则明显降低,TCID50试验表明细胞培养上清中FMDV的病毒滴度也明显降低,说明在PK-15细胞中过表达VISA会明显抑制FMDV的增殖。用siRNA干扰PK-15细胞中VISA基因的转录,然后接种0.5 MOI的FMDV,分别于接毒0 h、4 h、8 h和12 h后检测FMDV的mRNA转录情况,荧光定量PCR表明与对照组siVISA-nc相比,siVISA-1转染组PK-15细胞中FMDV基因组RNA显著增加,说明干扰VISA能够促进FMDV的复制。4.FMDV 3B及VISA对Ⅰ型干扰素通路的影响。将VISA-Myc质粒转染PK-15细胞,荧光定量PCR显示在PK-15细胞中过表达VISA能上调VISA介导的抗病毒因子TRAF2、TRAF3、TRAF6、TBK1、IFN-α、IFN-β、IL-6、IL-8、ISG15和OAS1的mRNA水平,说明VISA能诱导宿主抗病毒因子的产生。用IFN-β和IL-6 ELISA试剂盒检测PK-15细胞上清中IFN-β和IL-6的表达情况,结果显示在PK-15细胞中过表达VISA能够提高IFN-β和IL-6的分泌,FMDV感染能够减少VISA介导的IFN-β和IL-6的mRNA表达。说明FMDV感染能抑制VISA介导的天然免疫因子的产生。FMDV 3B蛋白能够下调VISA诱导的IFN-β的分泌,同时也能够下调VISA诱导的IL-6的分泌。这些结果说明,3B能抑制VISA介导的天然免疫因子的产生。综上所述,本研究证明FMDV 3B蛋白和宿主细胞VISA蛋白在细胞内和细胞外均存在相互作用,FMDV感染的PK-15细胞中内源性VISA的转录水平升高,而VISA蛋白量随着FMDV感染时间的延长逐渐降低。在PK-15细胞中过表达VISA会抑制FMDV的复制,而在PK-15细胞干扰VISA表达则促进FMDV的复制,表明VISA在机体抗FMDV感染过程中发挥着重要的作用。进一步的研究发现过表达VISA能上调VISA介导的天然免疫因子mRNA水平,同时过表达VISA能增强IFN-β和IL-6的分泌。FMDV感染能抑制IFN-β和IL-6的分泌,过表达3B蛋白也能抑制IFN-β和IL-6的分泌。说明FMDV 3B通过其3B3蛋白与VISA蛋白相互作用以抑制VISA信号通路,减少IFN-β和IL-6的表达,从而逃避宿主的天然免疫系统,促进FMDV的复制。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 缩略词对照表
  • 文献综述
  •   第一章 口蹄疫病毒与天然免疫研究进展
  •     1.1 口蹄疫病毒研究进展
  •       1.1.1 口蹄疫病毒基因组结构及其功能
  •       1.1.2 口蹄疫病毒在宿主细胞中的翻译、复制和装配
  •       1.1.3 口蹄疫的防控
  •     1.2 天然免疫研究进展
  •       1.2.1 PRRs与 PAMPs
  •       1.2.2 RLRs的分子结构
  •     1.3 FMDV病毒蛋白拮抗宿主的天然免疫应答
  •       1.3.1 Lpro蛋白拮抗宿主的免疫应答
  •       1.3.2 VP1 蛋白拮抗宿主的免疫应答
  •       1.3.3 VP3 蛋白拮抗宿主的免疫应答
  •       1.3.4 2B蛋白拮抗宿主的免疫应答
  •       1.3.5 2C蛋白拮抗宿主的免疫应答
  •       1.3.6 3A蛋白拮抗宿主的免疫应答
  •       1.3.7 3C蛋白拮抗宿主的免疫应答
  •   第二章 病毒诱导信号接头蛋白与Ⅰ型干扰素的信号转导
  •     2.1 病毒诱导信号接头蛋白（VISA）研究进展
  •       2.1.1 VISA的发现
  •       2.1.2 VISA的结构和细胞定位
  •       2.1.3 VISA对 NF-κB的激活
  •       2.1.4 VISA对 IRF3 的激活
  •     2.2 Ⅰ型干扰素的信号传导和抗病毒效应机制
  •       2.2.1 Ⅰ型干扰素的诱导产生途径
  •       2.2.2 Ⅰ型干扰素的信号转导途径
  •       2.2.3 Ⅰ型干扰素的效应蛋白途径
  • 试验研究
  •   第三章 与口蹄疫病毒3B蛋白相互作用的宿主细胞蛋白的筛选
  •     3.1 材料和方法
  •       3.1.1 病毒和细胞
  •       3.1.2 菌株、载体及试剂
  •       3.1.3 主要仪器设备
  •       3.1.4 口蹄疫病毒的增殖及噬斑纯化
  •       3.1.5 3B目的基因的获取及真核表达载体的构建
  •       3.1.6 3B蛋白和GFP蛋白在PK-15 细胞中的表达及其互作蛋白的筛选
  •     3.2 结果
  •       3.2.1 口蹄疫病毒的传代培养及噬斑纯化
  •       3.2.2 目的基因的获取及真核表达载体Flag-3B和 Flag-GFP的构建
  •       3.2.3 3B蛋白和GFP蛋白在PK-15 细胞中的表达及其最佳表达时间的鉴定
  •       3.2.4 免疫共沉淀选取互作蛋白
  •     3.3 讨论
  •     3.4 小结
  •   第四章 FMDV3B蛋白与VISA蛋白的相互作用的验证及互作区域的鉴定
  •     4.1 材料和方法
  •       4.1.1 细胞
  •       4.1.2 菌株、载体及试剂
  •       4.1.3 主要仪器设备
  •       4.1.4 VISA目的基因的获取及真核表达载体VISA-Myc的构建
  •       4.1.5 VISA蛋白在293T细胞中的表达
  •       4.1.6 免疫共沉淀试验验证3B蛋白与VISA蛋白的相互作用
  •       4.1.7 GST-pull-down验证3B-VISA在体外的相互作用
  •       4.1.8 FMDV3B蛋白与VISA蛋白互作区域的鉴定
  •     4.2 结果
  •       4.2.1 重组载体VISA-Myc的构建
  •       4.2.2 VISA蛋白能够在293T细胞中表达
  •       4.2.3 免疫共沉淀试验证明3B蛋白与VISA蛋白存在相互作用
  •       4.2.4 GST-3B的原核表达
  •       4.2.5 GST pull-down证明3B与 VISA存在相互作用
  •       4.2.6 FMDV3B蛋白与VISA蛋白互作区域的鉴定
  •     4.3 讨论
  •     4.4 小结
  •   第五章 VISA蛋白对FMDV增殖的影响
  •     5.1 材料和方法
  •       5.1.1 病毒和细胞
  •       5.1.2 菌株、载体及试剂
  •       5.1.3 主要仪器设备
  •       5.1.4 引物设计与合成
  •       5.1.5 FMDV感染对内源性VISA转录和表达的影响
  •       5.1.6 过表达VISA对 FMDV复制的影响
  •       5.1.7 下调VISA表达对口蹄疫病毒复制
  •       5.1.8 数据统计和分析
  •     5.2 结果
  •       5.2.1 FMDV感染PK-15 细胞上调VISA转录
  •       5.2.2 FMDV感染抑制猪VISA的表达
  •       5.2.3 过表达VISA可以抑制FMDV的复制
  •       5.2.4 下调表达VISA能够促进FMDV的复制
  •     5.3 讨论
  •     5.4 小结
  •   第六章 FMDV3B及 VISA对Ⅰ型干扰素通路的影响
  •     6.1 材料和方法
  •       6.1.1 病毒和细胞
  •       6.1.2 菌株、载体及试剂
  •       6.1.3 主要仪器设备
  •       6.1.4 引物设计
  •       6.1.5 PK-15 细胞中过表达VISA对抗病毒因子转录和表达水平影响的检测
  •       6.1.6 FMDV感染PK-15 细胞对VISA介导的抗病毒因子影响的检测
  •       6.1.7 过表达FMDV3B对 VISA介导的抗病毒因子的影响
  •       6.1.8 数据统计和分析
  •     6.2 结果
  •       6.2.1 过表达VISA对抗病毒因子的影响
  •       6.2.2 FMDV感染能够抑制IFN-β和IL-6 的分泌
  •       6.2.3 过表达3B蛋白能抑制IFN-β和IL-6 的分泌
  •     6.3 讨论
  •     6.4 小结
  • 结论
  • 本论文的创新点
  • 参考文献
  • 致谢
  • 作者简介

    • 文章来源

    类型: 博士论文

    作者: 解银丽

    导师: 常惠芸,张彦明

    关键词: 口蹄疫病毒,蛋白,病毒诱导信号接头蛋白,天然免疫,型干扰素

    来源: 西北农林科技大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 西北农林科技大学

    基金: 国家重点研发计划(编号:2017YFD0500902),国家自然科学基金(编号:31802171)

    分类号: S852.65

    DOI: 10.27409/d.cnki.gxbnu.2019.000074

    总页数: 101

    文件大小: 2877K

    下载量: 316

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