张畅斌[1]2003年在《小鼠同源异型框基因Pem在大肠杆菌的表达》文中指出背景：同源异型框基因家族成员多编码转录因子，控制发育的关键事件。小鼠Pem(mPem)基因是90年代初新发现的一个同源异型框基因。Pem基因在小鼠发育过程及成体部分组织中呈时间和空间特异性表达，并在一系列肿瘤细胞株中持续表达。 对Pem基因自身的结构与调控已有较多文献报道，揭示Pem生理功能的研究仍不多。Pem属于同源异型框基因，可能是一种发育调控的转录因子。Pem蛋白可能与其它蛋白因子相互作用，对特异的下游基因进行调控，以实现其功能。获得Pem蛋白既可以制备抗Pem的抗血清，也可以开展体外实验，为从分子水平研究其功能提供必要基础。 目的：用大肠杆菌表达mPem蛋白。 方法：PCR扩增小鼠Pem cDNA编码序列，将它克隆到含有GST的原核表达质粒载体pGEX-4T-3上，转化大肠杆菌BL21，诱导表达GST／mPem融合蛋白，通过亲和层析，获得初步纯化的产物，以羟胺切割验证其一级结构。 结果：在大肠杆菌中诱导表达出GST／mPem融合蛋白，经过亲和层析获得一定量的GST／mPem融合蛋白，它们具有预期正确的一级结构。 结论：构建了原核融合表达质粒pGEX-4T／mPem；成功在大肠杆菌中表达GST／mPem融合蛋白。
李实骞[2]2006年在《mPem蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化及其抗血清的制备》文中研究表明Pem cDNA编码一段210个氨基酸的多肽，其第116到175个氨基酸残基序列与同源异型域极为相似。Pem基因的表达具有明显的时间和空间特异性：在鼠胚发育的第6天，即可检测到Pem转录本的表达；第7-8天，Pem表达量达到最高，随后迅速减少；Pem基因在成年组织中一般不表达，但可在生殖组织表达；另外，Pem特异地在附睾近侧尾部和远侧的体部中表达，此处是精子获得运动性和受精能力的地方。这些资料表明Pem可能在胚胎发育和精子形成过程中充当着重要的角色。 本实验室利用GAL4酵母双杂交系统对小鼠7天胚胎cDNA文库进行筛选，获到了几个与mPem蛋白相作用的分子，其中包括Cdc37和Mdfic。为进一步研究mPem蛋白的功能，及mPem蛋白与其它蛋白的相互作用，我们在大肠杆菌中高效表达并纯化重组mPem蛋白，制备其特异性多克隆抗血清。多克隆血清可直接用来检测mPem及其重组蛋白，进行一系列体外实验，研究Pem蛋白的功能。 目的：构建pET22b(+)-mPem原核表达质粒，在大肠杆菌中高效表达mPem-6His蛋白，纯化mPem-6His蛋白，制备其特异性多克隆抗血清。 方法：设计合适引物，通过PCR扩增mPem cDNA序列，将其克隆至原核表达载体pET22b(+)，构建pET22b(+)-mPem表达质粒；表达质粒转化大肠杆菌表达菌株Rosseta~(TM)2(DE3)，IPTG诱导表达mPem-6Hi s融合蛋白，并进一步优化IPTG诱导条件；Ni~(2+)亲和层析纯化mPem-6His蛋白，并进行纯化蛋白的超滤除盐和冻干。以冻干后的mPem-BHis蛋白做为抗原，皮内注射免疫雄性新西兰兔制备mPem蛋白的特异性多克隆抗血清，ELISA测定其效价，Western blot检测其特异性。 结果：成功构建pET22b(+)-mPem原核表达质粒；实现Pem-6His蛋白在大肠杆菌中的高效表达，优化IPTG诱导条件，在转接后2.5-3.0h(0.D.600：0.6-1.0)加入0.4mM IPTG诱导1.5h，此时mPem-6His蛋白的表达量达到菌体总蛋白的16％；Ni~(2+)亲和纯化了mPem-6His蛋白，并进行纯化蛋白的超滤除盐和冻干；制备了mPem蛋白的特异性多克隆抗血清，ELISA测定抗血清效价为1：160000，Western blot表明该多克隆抗血清能特异识别结合内源性及外源性Pem蛋白。 结论：构建了pET22b(+)-mPem原核表达质粒；实现了mPem-6His蛋白在大肠杆菌中的高效表达；进行了mPem-6His蛋白的纯化、除盐和冻干；制备了高效
郭芬[3]2007年在《小鼠Rhox5蛋白与鞘脂激活蛋白原功能性相互作用的研究》文中研究说明小鼠Rhox5为同源异型框基因，隶属于Rhox基因簇(reproductive homeobox on the X chromosome genes cluster)β亚簇。多项研究表明其在生殖系统的发育、精子的形成和成熟过程中发挥重要的作用，但如何发挥功能尚未清楚。鞘脂激活蛋白原(prosaposin)为一多功能蛋白，除参与脂类代谢、神经系统营养外，其亦在生殖系统的发育和前列腺癌的发生中担任重要角色。本人前期的酵母双杂交实验首次发现Rhox5蛋白能够与prosaposin相互结合，将都能够在雄性生殖系统中特异性表达的两种蛋白联系起来。由于前人的研究表明在前列腺癌中，prosapsin蛋白可以以PI3K／Akt依赖的模式促进细胞存活和抑制凋亡。基于此，我们提出这样的假设：Rhox5与prosaposin的结合可能通过PI3K／Akt信号传导通路参与雄性生殖系统中的发育、配子的形成过程中的调控机制。进一步研究小鼠Rhox5蛋白与prosaposin之间的相互作用，定位其相互作用的关键结构域；研究其相互作用模式，可能为阐明两者在雄性生殖系统的发育、配子的形成过程中的调控机制奠定理论基础。本研究主要结果如下：1．Rhox5的原核表达、抗体制备及其亚细胞定位分析成功地构建了pET22b-Rhox5原核表达质粒；针对Rhox5 cDNA序列中富含大肠杆菌稀有密码子且这些稀有密码子大多串联排列这一现象，创新性地采用修饰后的大肠杆菌菌株Rosetta ~(TM)2(DE3)为宿主细胞。该菌株含有独立表达7种大肠杆菌稀有密码子tRNA的质粒，有效的克服了由于密码子偏好性差异导致的外源基因低表达，从而实现了Rhox5-6His融合蛋白的高效表达。优化表达条件，在转接后OD600达到0.6-1.0时加入IPTG至终浓度为0.4 mM诱导1.5 h，Rhox5-6His融合蛋白的表达量达到菌体总蛋白的16％；Ni~(2+)亲和纯化Rhox5-6His蛋白，并将纯化后的蛋白进行超滤除盐和冻干。免疫雄性新西兰兔，获得Rhox5蛋白特异性的多克隆抗血清，ELISA测定抗血清效价为1：160 000，Western blotting表明该多克隆抗血清能特异识别结合内源性的Rhox蛋白及外源性GFP-Rhox5蛋白。使用自制的Rhox5特异性多克隆抗血清，我们首次证实了内源性Rhox5蛋白的细胞核定位。由于Rhox5蛋白可能在胚胎发育、生殖系统的发育、精子的形成和成熟过程中起关键的调控作用，Rhox5蛋白及其特异性多克隆抗血清的获得将为Rhox5蛋白的功能性研究提供有效的工具。2．Rhox5可以直接与Prosaposin相互作用在前期酵母双杂交系统初筛中，我们获得了一个与Rhox5相作用的分子：No.1-14。双向酵母双杂交实验表明Rhox5蛋白与No.1-14在酵母体内存在相互作用。GST-pull down实验再次证实了Rhox5蛋白与No.1-14间的物理性相互作用。将No.1-14的核苷酸序列进行Blast，通过序列比对和搜索，获得一个与No.1-14序列100％同源的cDNA序列。该cDNA序列为prosaposin(Psap)基因，编码鞘脂激活蛋白原。No.1-14位于Prosapsin蛋白的C末端。PCR方法从小鼠7天胚胎cDNA文库中扩增全长的prosaposin的cDNA序列，获得了不含外显子8的prosaposin剪接本。双向酵母双杂交实验表明Rhox5蛋白与prosaposin(without exon8)在酵母体内存在相互作用。GST-pull down实验再次证实了Rhox5蛋白与prosaposin(without exon8)间的物理性相互作用。间接免疫荧光显示Rhox5蛋白与prosaposin共定位于细胞核中；哺乳动物细胞免疫共沉淀实验结果表明在胞内外源性的prosaposin蛋白不仅可以结合外源性的Rhox5蛋白，而且可以与细胞本身表达的Rhox5蛋白相结合。这些结果均表明Rhox5蛋白在胞内可以与prosaposin相结合，而其C末端的172个氨基酸残基可能在其结合中发挥重要作用。Rhox5／prosaposin间的相互作用可能是通过MAPK和PI3K／Akt信号通路调控小鼠雄性生殖系统的发生、精子的生成、成熟及前列腺癌的发生。然而，这些假设需要进一步的实验证据支持。3．Rhox5与Prosaposin相互作用的关键结构为进一步确定含有外显子8的prosaposin蛋白与Rhox5蛋白间的相互作用，重迭延伸PCR方法扩增获得含有外显子8的prosaposin cDNA序列，并将其克隆至酵母双杂交载体pGBKT7和pGADT7中，双向酵母双杂交和体外的GST-pull down实验均表明，含有外显子8的prosaposin蛋白和不外显子8的prosaposin蛋白同样可以结合Rhox5蛋白，其与Rhox5的亲和力相当，暗示prosaposin的这两种剪接本与Rhox5蛋白的结合均有可能具有生理学意义。研究与prosaposin结合的Rhox5关键结构，PCR方法分别扩增获得Rhox5的两个截短型片段，Rhox5 A和Rhox5 B。其中Rhox5 A为Rhox5蛋白N端的104个氨基酸残基，不含任何保守结构域，酵母双杂交和GST-pull down实验均表明该截短型片段不能与prosaposin蛋白结合；Rhox5 B为Rhox5蛋白C端的105个氨基酸残基，含有保守的homeodomain，酵母双杂交和GST-pull down实验表明该截短型片段不仅能与prosaposin蛋白结合，而且其结合力度与全长的Rhox5蛋白没有任何差异。提示Rhox5蛋白的同源异型域为其与prosaposin蛋白结合的关键结构。研究与Rhox5结合的prosaposin的关键结构，构建四种prosaposin的截短型片段：Psap A，包含了除No.1-14之外的氨基酸残基；No.1-14；saposin C，包含第313-392位氨基酸残基；saposin D，包含了第438-517位氨基酸残基。双向酵母双杂交和GST-pull down结果均表明prosaposin各截短型均可以与Rhox5结合，但结合力度存在差异：Prosaposin＞Psap A，No.1-14＞saposin C，D。生物信息学分析其3D结构模式图发现，除蛋白的肽链长度逐步减少，二硫键的数目减少外，其二级结构极其类似。为进一步确定影响prosaposin蛋白中与Rhox5蛋白结合的结构，构建两种saposin D的突变体：saposin D M3C和saposin D M6C，分别将saposin D内的3个／6个半胱氨酸突变成丝氨酸，以破坏其2个／3个保守的二硫键，并使氨基酸组成中疏水性氨基酸比例降低，试图破坏其疏水性的核心。双向酵母双杂交和GST-pull down结果表明saposin D M3C与Rhox5的结合力度与野生型的saposin D相当，而saposin D M6C则丧失了与Rhox5结合的力度。生物信息学分析其3D结构模式图发现，saposin D M3C的3D结构与野生型的saposin D类似，而saposin D M6C的3D结构与野生型的saposin D相比，其第3个α螺旋的长度明显减少，而第3、4个α螺旋间的环状结构长度延伸。这有可能是导致Saposin D M6C丧失了与Rhox5结合力的主要原因。4．Rhox5／Prosaposin的相互作用及其与PI3K／Akt信号通路为研究单独的Rhox5、prosaposin及Rhox5／prosaposin协同作用的生理功能，将哺乳动物细胞表达质粒pcDNA-Rhox5-HA和pcDNA-Psap-Myc单独或共同转染NIH3T3细胞，通过G418和潮霉素B筛选，RT-PCR和Western blotting实验的最终鉴定，获得阴性对照细胞株pcDNA3.1 in NIH3T3，单独过表达Rhox5-HA的细胞株Rhox5-HA in NIH3T3，单独过表达Psap-myc的细胞株Psap-myc in NIH3T3以及同时过表达Rhox5-HA和Psap-myc的细胞株Rhox5／Psap in NIH3T3。MTT实验检测四种细胞株的细胞增殖情况，结果发现过表达prosaposin可显着促进NIH3T3细胞的增殖；过表达Rhox5蛋白的细胞增殖略有增加；而当两者协同过表达后其促细胞增殖效果较单独的prosaposin处理有所下降。PI3K／Akt信号通路特异性抑制剂LY294002处理细胞后，能够显着改变由prosaposin及其与Rhox5蛋白的协同作用对细胞增殖的影响。无血清条件下诱导细胞凋亡，结果表明过表达prosaposin可显着抑制无血清诱导的NIH3T3细胞的凋亡；Rhox5的过表达对细胞的凋亡也起到了一定的抑制作用；然而当Rhox5／prosaposin协同作用后较单独的prosaposin作用下其抗凋亡效应显着降低。为进一步剖析Rhox5与prosaposin的单独作用及其协同作用对细胞增殖及细胞凋亡的影响，Western blotting实验检测四种细胞模型的PI3K／Akt信号通路中各蛋白的磷酸化水平改变。结果发现：单独过表达Rhox5，prosaposin及协同过表达Rhox5／prosaposin的细胞与阴性对照细胞相比Akt蛋白的总量、PTEN~(Ser380)、Akt~(Thr308)、Raf~(Ser259)的磷酸化水平均未见改变。Rhox5可微量提高PDK1~(Ser241)、Akt_(Ser473)、GSK3β~(Ser9)的磷酸化水平；prosaposin可显着提高这叁个蛋白的磷酸化水平；而Rhox5和prosaposin协同作用后较prosaposin单独作用下叁者的磷酸化水平有所降低。LY294002可抑制由Rhox5、prosaposin及两者的协同作用诱导的PI3K／Akt信号通路蛋白磷酸化水平的提高。Realtime PCR结果表明，Rhox5和prosaposin单独的过表达可抑制细胞周期抑制基因P27~(KIP1)的表达，促进细胞周期蛋白Cyclin D1的表达，促使细胞周期从G1→S期进展；同时诱导survival基因cIAP1、cIAP2的表达，促进细胞存活。而两者协同作用后对细胞周期和细胞存活的调节较单独的prosaposin作用有所改变。本研究获得了Rhox5蛋白的高效表达，制备Rhox5特异性抗血清，证实了内源性Rhox5蛋白的细胞核定位。首次证实了prosaposin与Rhox5蛋白的相互作用，提出Rhox5蛋白的同源异型域及prosapoin肽键内部的二硫键在Rhox5／prosaposin结合中起关键作用。研究其相互作用模式，得出了推论：在病理条件下(前列腺增生、癌变或雄激素调控异常)，可能导致两种均受雄激素调控的基因Rhox5和／或prosaposin的过表达。过表达的prosaposin被分泌至胞外，充当营养因子或细胞因子的功能，通过PI3K／Akt信号通路促进细胞增殖、抑制细胞凋亡；过表达的Rhox5可能通过Rhox5蛋白本身Ser和Thr的磷酸化或通过其下游调控分子活化PI3K／Akt信号通路，同样发挥促细胞增殖和抑制细胞凋亡的功能；而当Rhox5和prosaposin同时过表达时，Rhox5蛋白则充当负调控的作用，抑制prosaposin的分泌，在某种程度上抑制由prosaposin诱导的PI3K／Akt信号通路的活化，进而改变由prosaposin诱导的细胞增殖和抗凋亡活性。本研究为prosaposin与Rhox5蛋白及其协同作用可能在前列腺及前列腺癌的发生、转移和入侵中发挥作用的机制研究奠定了基础。
孙丽敏[4]2007年在《基于细胞穿膜肽TAT-Rhox5融合蛋白的原核表达、纯化及其细胞转导研究》文中认为目的：穿膜肽是指具有细胞膜穿透功能、长度多数小于20个的氨基酸序列，可以穿过细胞膜进入细胞质甚至细胞核，而细胞膜却完好无损。这些天然的或人工合成的多肽具有水溶性、低裂解性并通过非吞噬作用进入各种细胞膜。其中发现较早，研究最多的是来源于人免疫缺陷病毒(HIV)-Ⅰ的反式转录活化因子(Trans—activating transcriptional activator，TAT)。TAT或TAT来源的多种多肽不仅能运输小分子物质，还能运输大分子量的药物和纳米颗粒性物质至多种哺乳动物的活细胞中。Rhox基因家族是一簇新发现的同源异型框基因簇，其定位于X染色体上，特异性的在雌雄鼠的生殖组织中表达，可能在胚胎发育、生殖组织的发育、精子的生成和成熟中发挥重要作用。本实验室利用GAL4酵母双杂交系统对小鼠7天胚胎cDNA文库进行筛选，获到了几个与mPem蛋白相作用的分子，其中包括Cdc37和Mdfic。本课题拟构建，表达和纯化TAT-Rhox5融合蛋白，并将纯化所得蛋白质传导进入细胞，研究穿膜肽TAT是否可以协助Rhox5蛋白进入细胞和其在细胞内的定位，以及其在细胞内的功能发挥情况。从而为穿膜肽TAT的应用研究提供实验依据，同时，为Rhox5蛋白的功能研究奠定基础。方法：将TAT序列按照通读框插入重组质粒pET22b(+)-Rhox5中，构建pET22b(+)-TAT-Rhox5表达质粒。转化E.coli表达菌株Rosseta~(TM)2(DE3)，IPTG诱导表达TAT-Rhox5-6His融合蛋白，Western blotting检测目的蛋白，表逹并纯化TAT-Rhox5融合蛋白，转导TAT-Rhox5融合蛋白进入细胞并检测其转导进入细胞的最佳浓度，再以免疫荧光法检测其在细胞内的定位。结果：成功构建pET22b(+)-TAT-Rhox5原核表达质粒；实现了TAT-Rhox5-6His蛋白在大肠杆菌中的高效表达；并能纯化出高纯度的TAT-Rhox5融合蛋白，证实穿膜肽TAT可以协助Rhox5蛋白进入细胞，并最终运送到核内，而TAT-Rhox5融合蛋合进入细胞的最佳浓度为3μM，当转导时间增加，融合蛋白进入细胞核的量亦相对增加。结论：成功纯化出高纯度的TAT-Rhox5融合蛋白，证实穿膜肽TAT可以协助Rhox5蛋白进入细胞，并最终运送到核内，为Rhox5蛋白的功能研究奠定基础。
欧淑芳[5]2009年在《小鼠转录因子Mdfic表达图谱及其与Rhox5相互作用的研究》文中提出Mdfic(MyoD family inhibitor domain containing)基因,是一个近年来新发现的基因,因其编码MyoD抑制素结构域(I-mfa domain),故命名为Mdfic。然而,其研究工作仅限于cDNA序列的测序和Genebank的登录,对其功能研究仍是一片空白。在前期工作中,我们首次发现了Mdfic和同源异型框蛋白Rhox5间的相互作用,为其功能研究提供了新的线索。小鼠Rhox5为同源异型框基因,隶属于Rhox基因簇(reproductive homeobox on theⅹchromosome genes cluster)β亚簇。除在生殖系统的发育、精子的形成和成熟过程中发挥重要的作用外,多项研究表明其在肌细胞的发生和分化中担任重要角色,有可能作为MyoD基因的上游调控子或者和其他转录因子协同作用,调控肌细胞的早期发生和分化事件。Rhox5与Mdfic间的相互作用暗示了两者可能组成转录调控复合体在肌细胞发生和分化中发挥重要作用。本研究不仅研究新型转录因子Mdfic本身,而且侧重研究两种转录因子Mdfic和Rhox5间的相互作用。研究新型转录因子Mdfic的表达图谱,生物信息学分析其蛋白功能,将为新型转录因子Mdfic的功能性研究提供实验基础;研究小鼠Rhox5蛋白与新型转录因子Mdfic之间的相互作用,定位其相互作用的关键结构域;推测相互作用模式,这将为阐明新型转录因子Mdfic的功能及其与Rhox5蛋白的相互作用在肌细胞发生分化中的功能研究提供理论参考。本论文的实验结果及结论如下:1.Rhox5蛋白与Mdfic蛋白相结合经过酵母双杂交系统初筛,我们得到了一个与Rhox5相作用的分子:No.1-99。反向酵母双杂交实验和体外的GST-pull down实验结果表明Rhox5蛋白可以在酵母体内和体外结合No.1-99。使用Blast在线软件进行序列比对和搜索,发现No.1-99序列的cDNA序列与Mdfic(Mdfic)基因的C末端序列100%同源。PCR方法从小鼠7天胚胎cDNA文库中扩增全长的Mdfic的cDNA序列,并将其克隆至酵母双杂交载体BD和AD载体中构建重组质粒。双向酵母双杂交实验和体外的GST-pull down实验结果表明Rhox5蛋白可以在酵母体内和体外结合Mdfic。哺乳动物细胞的免疫共沉淀实验确认了哺乳动物细胞中生理状态下Rhox5与Mdfic的结合。这些结果均表明Rhox5蛋白在胞内可以与Mdfic相结合,而其C末端可能在其结合中发挥重要作用,但其相互作用的关键区域仍需要进一步的细化。2.Mdfic的表达图谱及生物信息学分析RT-PCR和荧光定量PCR检测小鼠10种组织:心、肝、脾、肺、肾、睾丸、附睾、小肠、胚胎(7-8天)和骨骼肌;NIH3T3细胞及诱导前后的C2C12细胞中Mdfic基因的表达情况差异,结果显示Mdfic mRNA在小鼠的肝、脾、肾和晕丸中有较高的表达水平,其余5个组织器官(心、肺、附睾、小肠、胚胎、骨骼肌)中的Mdfic mRNA表达水平相对较低,其中以附罩和小肠的表达最低。骨骼肌、诱导前后的C2C12细胞中Mdfic mRNA的表达水平,叁者相比,Mdfic的表达水平存在:诱导前的C2C12细胞＞诱导后的C2C12细胞＞骨骼肌。生物信息学分析Mdfic基因组结构及其蛋白相关性质,结果表明:①Mdfic基因定位于第6号染色体15670661-15752165 bp区间的正链上。Mdfic基因总长度为81454bp,由5个外显子和4个内含子组成。外显子和内含子的连接处的序列均符合“gt-ag规则”。②通读框分析表明:Mdfic mRNA存在可选择性的翻译起始位点,除常规的位于338-390 bp的AUG起始密码子外,Mdfic mRNA的AUG起始密码子上游还存在潜在的非AUG起始密码子,即GUG,分别位于mRNA序列的第37-39 bp,70-72 bp和142-144bp。相对于AUG起始密码子起始翻译的蛋白来讲,非AUG起始密码子起始翻译的蛋白将原本的247 aa分别延长了82 aa,106 aa和117 aa,对应获得分子量为26 kD,34 kD,37 kD和38 kD的蛋白,根据其分子量,分别将这四种蛋白命名为Mdfic p26,p34,p37和p38。③生物信息学分析了这四种蛋白的翻译后修饰位点和二级结构预测,结果表明Mdfic p26,p34,p37和p38其共有的247 aa对应的翻译后修饰位点和二级结构基本一致。④亚细胞定位分析结果表明Mdfic p26,p34,p37和p38蛋白均主要定位于细胞核(可能性为52.2%)。⑤相对于Mdfic p26来讲,Mdfic p34,p37和p38蛋白延伸出的82 aa,106 aa和117 aa并未影响Mdfic p26的翻译后修饰位点、二级结构和亚细胞定位。⑥多序列比对的结果表明:Mdfic p26、HIC p32和XIC蛋白的同源性极其高,分别达到:81%、59%。他们均由AUG起始翻译,氨基酸残基数目相近,分别为247 aa、246 aa和246 aa,其C末端的I-mfa结构域,同源性高达95%以上。Mdfic p26、小鼠的I-mfa蛋白和人的I-mfa蛋白的氨基酸序列进行比对结果表明,Mdfic p26与小鼠的I-mfa及人的I-mfa的同源性也较高,尤其是其C末端的I-mfa结构域。推测Mdfic基因是HIC的鼠基因类似物(orthologue),同属于I-mfa结构域家族,编码Mdfic或者可以称为MIC(Mouse I-mfa domain containing protein)。在该蛋白的功能发挥中,其C末端的I-mfa结构域可能发挥重要的功能。3.Rhox5与Mdfic相互作用的关键区域分析生物信息学分析Mdfic的氨基酸序列,根据分析结果PCR方法扩增了Mdfic A截断型片段,包含了第72-247位氨基酸残基,含有保守的I-mfa结构域;双向酵母双杂交和体外的GST-Pull down结果表明,该截断型片段可以与Rhox5蛋白结合,且结合力度较完整的Mdfic蛋白强,这表明与Rhox5蛋白结合的区域位于MdficA截断型片段内,而MdficA截断型片段外的区域(1-71 aa)的结构可能影响了Mdfic与Rhox5蛋白的结合。进一步,我们将Mdfic A片段细化为两段:Mdfic B,包含了第72-191位氨基酸残基,不含有I-mfa结构域:Mdfic C,包含了第191-247位氨基酸残基,含有I-mfa结构域。令人惊奇的是:含有保守的I-mfa结构域的Mdfic C截断型片段丧失了与Rhox5蛋白结合的能力,而不含有I-mfa结构域的Mdfic B截断型片段保留了与Rhox5蛋白结合的能力。此外,双向酵母双杂交和体外的GST-pull down实验均表明Rhox5 N截短型片段(不含同源异型域)不能与Mdfic蛋白结合;而Rhox5 C截短型片段(含有同源异型域)则保持了与Mdfic蛋白结合的能力。这些结果表明Mdfic可能通过Rhox5蛋白的同源异型域与其结合。本研究首次利用RT-PCR和荧光定量PCR检测小鼠10种组织:心、肝、脾、肺、肾、睾丸、附睾、小肠、胚胎(7-8天)和骨骼肌;NIH3T3细胞及诱导前后的C2C12细胞中Mdfic基因的表达情况差异,提出Mdfic的表达水平存在:诱导前的C2C12细胞＞诱导后的C2C12细胞＞骨骼肌,暗示了Mdfic可能在肌细胞分化中起负调控作用。生物信息学分析了Mdfic的功能,提出其I-mfa结构域在其功能发挥中担任重要作用。此外,研究首次证实了Mdfic与Rhox5蛋白的相互作用,提出Rhox5蛋白的同源异型域及Mdfic蛋白的非I-mfa结构域在Rhox5/Mdfic结合中起关键作用,并基于此得出了推论:Mdfic蛋白的I-mfa结构域可能与其他转录因子结合,调控该转录因子的活性;而Rhox5与Mdfic的结合极有可能进一步调控由Mdfic参与的其他转录因子调控,叁者形成一个复杂的调控网络,共同参与肌细胞发生及分化的调控。
郭芬, 李实骞, 欧淑芳, 初彦辉, 李月琴[6]2009年在《小鼠RHOX5蛋白两种截短型突变体的原核表达及其与MDFIC互作的鉴定》文中认为目的:表达和纯化两种小鼠RHOX5蛋白的截短型突变体,确定完整的RHOX5蛋白及其两种截短型突变体与MDFIC蛋白结合的能力。方法:生物信息学分析小鼠同源异型框蛋白RHOX5的cDNA序列,分别对RHOX5的两种截短型片段RHOX5 N和RHOX5 C进行PCR、分别扩增RHOX5的两种截短型片段RHOX5 N和RHOX5 C并将其克隆至pGEX4T3原核表达载体,构建重组表达质粒。用重组表达质粒分别转化大肠杆菌RosettaTM2(DE3)菌株,经IPTG诱导后,使用Glutathione-Sepherase 4B颗粒对融合蛋白进行小批量亲和纯化,通过SDS-PAGE电泳分离目标蛋白,确定融合蛋白的表达。进行GST-pull down实验,检测完整的RHOX5蛋白及其两种截短型突变体与MDFIC蛋白结合的能力。结果:在大肠杆菌RosettaTM2(DE3)中有效地实现了GST-RHOX5、GST-RHOX5 N和GST-RHOX5 C 3种融合蛋白的可溶性表达;经Glutathione Sepherase 4B颗粒亲和纯化后,获得了纯化后GST融合蛋白;GST-pull down实验证实,含有homeodomain的RHOX5蛋白和RHOX5C截短型突变体可以与MDFIC蛋白相结合,而RHOX5N截短型突变体则丧失了与MDFIC蛋白结合的能力。结论:实现了RHOX5及其两种截短型突变体的原核表达和纯化,证实RHOX5蛋白的homeodomain结构域是其与MDFIC结合的关键部位。
参考文献：
[1]. 小鼠同源异型框基因Pem在大肠杆菌的表达[D]. 张畅斌. 暨南大学. 2003
[2]. mPem蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化及其抗血清的制备[D]. 李实骞. 暨南大学. 2006
[3]. 小鼠Rhox5蛋白与鞘脂激活蛋白原功能性相互作用的研究[D]. 郭芬. 暨南大学. 2007
[4]. 基于细胞穿膜肽TAT-Rhox5融合蛋白的原核表达、纯化及其细胞转导研究[D]. 孙丽敏. 暨南大学. 2007
[5]. 小鼠转录因子Mdfic表达图谱及其与Rhox5相互作用的研究[D]. 欧淑芳. 暨南大学. 2009
[6]. 小鼠RHOX5蛋白两种截短型突变体的原核表达及其与MDFIC互作的鉴定[J]. 郭芬, 李实骞, 欧淑芳, 初彦辉, 李月琴. 中国生物工程杂志. 2009
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