两种新内源RNA病毒的鉴定及相关特性研究

论文摘要

内源RNA病毒是一类能够侵染不同生物的病毒类群,寄主范围包括植物、真菌及卵菌。侵染寄主时不会引起寄主异常症状,在寄主体内能够持续慢性感染。基因组核酸多为线性双链RNA（dsRNA）,全长在9.8-17.6 kbp之间,编码一个大的ORF,编码框上含有RdRp（RNA-dependent RNA polymerase）、CPS（capsular polysaccharide synthetase）、Hel（viral RNA helicase）或UGT（UDP-glycosyltransferase）等一些保守结构域。有些内源RNA病毒的全长基因组5?末端附近存在一个缺口（nick）,有些内源RNA病毒基因组3?末端会检测出一串连续的胞嘧啶碱基,它们是否在病毒的进化起到一定作用尚不清楚。此外,该类病毒不形成病毒粒子,不编码病毒衣壳蛋白。本研究从植物和真菌两种不同的寄主中分别发现了一种新内源RNA病毒,对其分子特性及部分生物学特性进行了研究,主要结果如下:首先,白粉菌中发现的一种新内源RNA病毒。白粉菌样品采自北京地区感染白粉菌的枸杞植物,利用白粉菌ITS区域和显微形态观察,鉴定了白粉菌病原为穆氏节丝壳（Arthrocladiella mougeotii（Lév.）Vassilk.）。提取该白粉菌的dsRNA,进行随机引物克隆、末端RACE扩增（RNA ligase mediated rapid amplification of cDNA ends,RLM-RACE）和中间序列测定,获得了病毒基因组全长序列,大小为11683 bp（登录号:MH094752.1）。包含一个大的ORF,编码3个保守结构域,分别是靠近N末端的Hel-1（helicase 1）结构域、靠近C末端RdRp 2（RNA-dependent RNA polymerase 2）结构域以及CRR（cysteine-rich region）的区域。全长基因组末端5?和3?非翻译区分别有16 bp和50 bp,3?端无连续的胞嘧啶碱基。基于病毒核酸序列及RdRp氨基酸序列构建的系统进化树显示:新发现病毒与Endornaviridae下的Alphaendornavirus属的EcEV（Erysiphe cichoracearum endornavirus）和GeEV（Grapevine endophyte endornavirus）亲缘关系最近,形成一亚簇,其核酸序列同源性分别为66.53%、68.55%,RdRp氨基酸序列同源性分别为73.62%、72.39%。鉴于新发现病毒在基因组结构、编码蛋白结构域、进化特征等方面都符合内源RNA病毒特点,所以将该病毒暂命名为AmEV（Arthrocladiella mougeotii endornavirus）。其次,从植物瓠瓜（Lagenaria siceraria var.hispida）中发现一种新内源RNA病毒。经随机引物克隆、末端RACE扩增和中间序列测定,获得病毒基因组序列,全长大小为15098 bp（登录号:KX377970.1）。基因组编码一个大的ORF,其上包含5个保守结构域,分别为1个Hel区域,2个CPS区域,1个UGT区域及1个RdRp区域。病毒全长基因组5?和3?非翻译区分别有111 bp和52 bp,并且在3?非翻译区尾部还含有13个连续胞嘧啶碱基。基于病毒核酸序列及RdRp氨基酸序列构建的系统进化树显示:新发现病毒与Endornaviridae下的Alphaendornavirus的LsEV-CA（Lagenaria siceraria endornavirus-California）和CmEV（Cucumis melo endornavirus）亲缘关系最近,形成一亚簇,其核酸同源性分别为72.96%,69.11%,RdRp氨基酸序列同源性分别为82.56%,68.10%。鉴于新发现病毒与内源RNA病毒LsEV-CA间基因组核酸和编码蛋白的高同源性,作者认为发现的新病毒只是LsEV（Lagenaria siceraria endornavirus）的一个新株系,暂命名为LsEV-HuB（Lagenaria siceraria endornavirus-Hubei）。最后,对瓠瓜中发现的LsEV-HuB的部分生物学特性进行了初步研究,主要包括不同瓠瓜品种的种子带毒率、不同时期瓠瓜体内LsEV-HuB含量的动态变化及瓠瓜被两种病毒（WMV和LsEV-HuB）复合侵染时病毒的相对含量等。结果显示:（1）利用2对LsEV-HuB的特异性引物对18个瓠瓜品种种子带毒率进行RT-PCR检测,结果显示:绝大部分瓠瓜种子携带LsEV-HuB比率达到100%,如早熟棒瓠子、绿太郎一号、芦瓜2号等16个品种,少部分瓠瓜品种的带毒率为92.85%,如LE731、超级早生2个品种,说明瓠瓜中的LsEV-HuB是经过种子垂直传播且传播效率高;（2）利用qRT-PCR方法检测瓠瓜体内的LsEV-HuB含量在不同生长时期的动态变化,结果显示:在瓠瓜生长发育期LsEV-HuB含量最高,其次是开花结果期,幼苗期病毒含量最低,大概只及生长发育期、开花结果期的1/7、1/6,说明LsEV-HuB在寄主植物体内是动态变化的;（3）采用6种病毒特异性引物检测荆州市郊区蔬菜种植基地感染瓠瓜的病毒种类,发现西瓜花叶病毒（WMV）和LsEV-HuB复合侵染该蔬菜基地瓠瓜植物。利用qRT-PCR方法检测病原病毒WMV和LsEV-HuB的相对含量,结果显示:在瓠瓜植物中,LsEV-HuB的含量只有WMV的1/9,说明内源RNA病毒的含量远低于病原病毒,不会引起寄主表型变化。

论文目录

摘要

Abstract

第1章绪论

1.1 引言

1.2 双链RNA病毒的简介及分类

1.2.1 双链RNA病毒的简介

1.2.2 双链RNA病毒的分类

1.3 内源RNA病毒的研究进展

1.3.1 内源RNA病毒的发现和发展概况

1.3.2 内源RNA病毒的寄主范围、自然分布及传播

1.3.3 内源RNA病毒的分子特性及基因组结构

1.4 本研究的目的与意义

第2章穆氏节丝壳内源RNA病毒的分子特征及分类地位

2.1 实验材料

2.1.1 样品采集

2.1.2 菌株、载体及培养基

2.1.3 实验器材及试剂

2.1.4 RT-PCR扩增和检测引物

2.1.5 缓冲液及培养基的配制

2.2 实验方法

2.2.1 CTAB法提总DNA

2.2.2 病毒dsRNA的大量提取

2.2.3 白粉菌ITS区域的PCR扩增

2.2.4 白粉菌ITS区域的克隆和测定

2.2.5 白粉菌显微形态观察

2.2.6 病毒dsRNA的回收纯化

2.2.7 病毒基因组中间序列的克隆

2.2.8 病毒基因组末端序列克隆

2.2.9 病毒基因组序列的拼接和结构分析

2.2.10 病毒的进化分析

2.3 结果与分析

2.3.1 枸杞白粉病病原菌的鉴定

2.3.2 穆氏节丝壳中dsRNA病毒的鉴定及纯化

2.3.3 穆氏节丝壳内源RNA病毒基因组测定

2.3.4 穆氏节丝壳内源RNA病毒的分子特征分析

2.3.5 穆氏节丝壳内源RNA病毒分类地位的确定

2.4 小结与讨论

第3章瓠瓜内源RNA病毒的分子特性及分类地位

3.1 实验材料

3.1.1 实验样品

3.1.2 菌株、载体及培养基

3.1.3 实验器材及试剂

3.1.4 RT-PCR扩增和检测引物

3.2 实验方法

3.2.1 病毒dsRNA的大量提取

3.2.2 病毒dsRNA的回收纯化

3.2.3 病毒基因组中间序列的克隆

3.2.4 病毒基因组末端序列的克隆

3.2.5 病毒基因组序列的拼接及结构分析

3.2.6 病毒的进化分析

3.3 结果与分析

3.3.1 瓠瓜内源RNA病毒的鉴定及全长克隆

3.3.2 瓠瓜内源RNA病毒分子特征的分析

3.3.3 瓠瓜内源RNA病毒分类地位的确定

3.4 小结与讨论

第4章瓠瓜内源RNA病毒的部分生物学特性

4.1 实验材料

4.1.1 实验样品

4.1.2 实验试剂及仪器

4.1.3 RT-PCR扩增及检测引物

4.2 实验方法

4.2.1 瓠瓜的种植及样品的选择

4.2.2 Trizol法提总RNA

4.2.3 试剂盒提植物总RNA

4.2.4 总RNA的RT-PCR、电泳检测

4.2.5 qRT-PCR的数据处理及分析

4.3 结果与分析

4.3.1 瓠瓜种子携带内源RNA病毒的检测

4.3.2 不同时期内源RNA病毒在瓠瓜中的动态变化

4.3.3 瓠瓜内源RNA病毒与西瓜花叶病毒的含量变化

4.4 小结与讨论

第5章全文结论

致谢

参考文献

个人简介

附录1 缓冲液及培养基的配制

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 彭小琴

导师: 章松柏,方守国

关键词: 内源病毒,瓠瓜,穆氏节丝壳,系统进化,荧光定量

来源: 长江大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,农业基础科学,植物保护

单位: 长江大学

分类号: S432.4

总页数: 73

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