李经忠[1]2004年在《新型靶向性聚乙烯亚胺转基因载体的研制》文中研究表明基因治疗有叁个重要环节，即目的基因、转基因载体和靶细胞。基因导入系统是基因治疗的核心技术。目前，应用于基因治疗的载体主要有病毒载体系统和非病毒载体系统。病毒载体转染效率高，是体内基因治疗的主要工具，但安全性存在隐患及有免疫原性，体内不能反复应用。而非病毒载体具有安全性高、免疫原性低、易于对DNA进行操作等优点，故人们愈来愈重视人工合成的非病毒载体的研究，而解决靶向性问题是非病毒中载体中最为关注的问题，理想的载体系统是能将治疗基因输送到并进入特定的靶细胞，从而能在该细胞中得到有效表达，这对于恶性肿瘤基因治疗尤为重要。以受体靶向的非病毒载体系统是最常用和有效的策略，利用细胞表面表达特异性的受体或蛋白，将特定的配体分子或片段与载体连接形成分子偶联体，使DNA能靶向性地转到表达受体的细胞。同时，针对非病毒载体的缺陷及DNA转移过程中的内吞小泡释放问题、转运入核问题，根据具体情况选择合适的载体，并对其作进一步的优化、改善以获得满意的治疗或应用效果。目前常用的非病毒载体包括裸DNA，脂质体载体及阳离子多聚物型载体等。聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)是最常用的阳离子多聚物非病毒载体，PEI可把质粒DNA缩合(condense)成数百纳米大小的颗粒，通过静电作用黏附到细胞表面上，被动内吞。PEI在吞噬泡内不能降解，同时保护DNA免受溶酶体降解；另外，PEI有渗透性肿胀效应，导致吞噬泡破裂，使DNA进入胞浆，并促进DNA进入细胞核。本实验利用PEI作为载体系统的骨架，同时利用FGF受体(fibroblast growth factor receptor，FGFR)和整合素在大多数肿瘤细胞和肿瘤新生血管高表达的特点，设计了能与肿瘤细胞表面相应受体结合的寡肽：碱性细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)寡肽、靶向于整合素的RGD寡肽，利用交联技术将寡肽与PEI偶联，构建了新型的非病毒基因载体系统，以增加其对肿瘤细胞及其新生血管的靶向性，旨在用于恶性肿瘤基因治疗的研究。 研究分两部分：第一部分，PEI转染参数的测定及转染条件的优化。第二部分，靶向于FGFR的bFGF寡肽和靶向于整合素的RGD寡肽的设计与合成，bFGF寡肽／RGD寡肽单靶向的PEI转基因载体的构建及其介导基因转移的有效性和靶向性研究；bFGF寡肽和RGD寡肽联合靶向的PEI转基因载体的制备。习而绷眨甲巴泊.恨L月民之二自.月眨月睡冲全刁‘因月之，卜白匀月升门回中j忆按畏. 第一部分PEI转染效率的优化 目的:用分枝状25 kDa PEI作为转基因载体，介导报告基因质粒的转染，测定转染效率的多种影响因素，优化转染条件，为合成更复杂的载体积累数据。 方法:利用电泳阻滞实验测定PEI与DNA的结合能力。利用编码增强型绿色荧光蛋自的pEGFP质粒和编码p一半乳糖苍酶的PSVp质粒及Pc0NA3.甲质粒作为报告基因，通过PEI转染pEGFP质粒和psvp质粒及peDNA3.邓质粒，检测自蛋白、血清、稀释溶媒、氯喳等对PEI转染效率的影响，探索操作方法(包括转染次数、水平摇动、转染复合物与细胞温育的时间等)和质粒因素(质粒质量、纯度等)对转染效率的影响。通过MTT法测定PEI的细胞毒性。 结果:经过数据推导，得出PEI与ONA的N用比=7.53xb/c，其中N为PEI中的氮含量，P为DNA中的磷含量，b为PEI的质徽扭g)，‘为质粒的质量(雌)。PEI对COS一7细胞和NIH3T3细胞存在一定的毒性，其C50(50%死亡浓度)为7一8林g八111。电泳阻滞试验，PEI/D NA的N用比在2.5~3.0以上可完全阻滞DNA在电泳中的迁移。通过一系列细胞的研究，证明PEI心NA转染效率一般以N于=7.5~10最仕。生理盐溶液作为配制PEI心NA复合物的溶媒，转染效率高于5%葡萄糖溶液。溶酶体抑制剂氯哇降低PEI转染效果而且增加PEI细胞毒性。培养液中的自蛋自、血清显着降低转染效率。试验发现，新鲜制备的PEI心NA复合物转染效率>4oC放置24h>>一sooC冻存24h>>一Zooe冻存24h，<0.05)。 PEI心NA转染psVp后，12h不能测到目的基因表达产物，转染后24h目的基因开始表达，在36h表达量达峰值，并持续数大，然后表达量开始卜降。质粒中生物活性抑制剂(质粒提取试剂盒的残留成分，内毒素等)显着降低转染效率，通过超滤除去截流分子量小于30，000的物质，显着增加转染效率。转染效率与质粒用量呈剂量依赖效应。 结论:PEI是有效的体外真核细胞转染剂，可用于合成更复杂的转基因载体;本研究检测优化了PEI的转染条件井应用于卜而的实验研究。第二部分b「G「寡肤偶联的和整合素的RGD寡肤偶联的PE!载体的设计和制备 目的:设计合成新刑的bFGF寡肤靶向的PEI转基因系统、靶向于整合素的PEI转基因载体，研究该载体复合物系统用于基闪转移的效率。许多病毒感染细胞需要双受体机制，除细胞特异性受体外，整合素是许多病毒的第二受体，本研究模拟病毒双受体转染细胞的机制，制备整合素与FGFR双受体介导的PEI转基因载体。同时探讨核定位信号(nuc!ear locationalsignal，NLs)肤对pEI心NA转染效率的影响。 方法:根据bFGF(1 55 AA)的叁维结构、bFGF分子与FGFR(fibroblast growth factor
胡静[2]2017年在《双功能肽tLyP-1-NLS修饰的DNA纳米胶束的构建及其抗肿瘤作用研究》文中进行了进一步梳理肿瘤是生长于靶器官却与其不相协调的组织团块的异常增生,恶性肿瘤由于其细胞可侵犯、浸润邻近组织细胞,并能通过血液或淋巴系统从原发部位转移到其他组织形成新的瘤块的特点,导致其难以治愈。传统的治疗手段均存在对机体损伤大、风险高、易于复发的问题,而基因治疗由于其独特的切入点为癌症的根治带来了希望。基因治疗是从分子层面入手,通过特殊传递系统将目的基因递送至靶细胞,而目前基因治疗的瓶颈则是寻求合适有效的基因载体系统。相较于免疫原性高、制备复杂的病毒载体,非病毒载体由于其细胞毒性低、易于制备、无感染和恶化风险等优势受到研究者的青睐,其中阳离子聚合物聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI),由于其独特的“质子海绵效应”和良好的转染效率,近年来研究较多。但PEI单独使用时存在体液稳定性差、高转染效率与低细胞毒性不相兼得、无肿瘤特异靶向性等问题。由此,本课题组尝试以细胞毒性低的支链型PEI 2kDa为骨架,用天然高分子材料壳聚糖进行结构修饰,构建PEI衍生物,以期在降低细胞毒性、增加生物相容性的同时确保高的转染效率;再连接双功能肽t Lyp-1—NLS(命名为K12),增加聚合物肿瘤细胞靶向性,进一步提高载体转染效率。本文第一章介绍了聚乙烯亚胺、壳聚糖单独作为转基因载体的应用及缺陷,说明先对壳聚糖进行改性再对聚乙烯亚胺进行修饰的必要性;短肽t Lyp-1能与肿瘤新生血管及细胞膜上高表达的NRPs受体特异结合,NLS是核定位信号肽,可促进细胞核递送,进一步靶向于细胞亚结构,依此提出设想,尝试构建新型双功能肽,再将其连接聚乙烯亚胺衍生物上,以期构建转染效率高、细胞毒性低、有肿瘤细胞靶向性的新型转基因载体。第二章讲述了本课题设想的新型转基因载体的具体构建方法:首先通过硼氢化钾、N-甲基吡咯烷酮等对壳聚糖进行改性,构建季铵化壳聚糖OTMCS,再通过N-羟基琥珀酰亚胺将其连接到支链型PEI 2kDa上,通过固相法合成双功能肽K12,最后通过SMCC法将前体PEI衍生物与K12连接,构建载体OTMCS-PEI-K12,并通过控制K12的投料比,构建低、中、高功能肽比例的聚合物,分别命名为OTMCS-PEI-K12-2,OTMCS-PEI-K12-5,OTMCS-PEI-K12-10。通过质谱、HPLC、1H-NMR对聚合物的合成情况进行表征,发现目的产物被成功合成,可用于后续实验。第叁章通过体外实验,考察不同K12投料比的OTMCS-PEI-K12的理化性质:通过酸碱滴定实验发现,经过OTMCS和K12修饰的PEI,缓冲能力有所减弱,但相较于生理盐水,仍表现出良好的缓冲效果;通过琼脂糖电泳实验考察OTMCS-PEI-K12包合DNA能力,发现2、5、10倍K12投料比的OTMCS-PEI-K12分别能在w/w为0.8,1.2,1.6时将DNA完全缩合,且可以抵抗至少50 U DNase I/μg DNA和200μg/mL的肝素钠的解离;通过扫描电镜发现,聚合物OTMCS-PEI-K12单体呈现枝桠蓬松状,结合DNA后,复合物OTMCS-PEI-K12/DNA呈结构紧密的椭圆形,且纳米粒子分散系均一、稳定,通过粒度-电位仪检测,发现在复合物质量比为5—30之间时,OTMCS-PEI-K12/DNA粒径约为100—600nm,Zeta电位约为1—36m V;通过MTT、水解实验考察OTMCS-PEI-K12的细胞毒性,结果显示,即使在高浓度下,OTMCS-PEI-K12仍表现出低的细胞毒性低,且能在60h后水解为小分子,有良好的生物降解性。第四章通过体外细胞实验,考察了OTMCS-PEI-K12的转染能力,并通过在细胞系中添加不同抑制剂,初步探究聚合物的胞内运转机制:选用B16和U87细胞系,以绿色荧光蛋白pEGFP-N2和虫荧光素酶pGL3-Control为报告基因,选用PEI 25kDa作为阳性对照,结果显示,PEI 2kDa转染效率明显低于PEI 25kDa,但随着OTMCS、K12的逐步修饰,聚合物转染效率逐渐增强,在相同质量比下,新合成的载体OTMCS-PEI-K12转染效果好于PEI 25kDa;OTMCS-PEI-K12在不同细胞系中转染效果不同,其在U87中的转染效果明显优于B16;不同K12投料比的OTMCS-PEI-K12在U87中转染效果有所差异,相同条件下,OTMCS-PEI-K12-5转染效果最好。通过在细胞系中添加微管、微丝、Dynein抑制剂考察胞内转运情况发现:微管的动态平衡对OTMCS-PEI-K12影响不大,而当胞内微丝、Dynein受到抑制时,OTMCS-PEI-K12的转染受到抑制,且随抑制剂浓度增大,转染效率降低,说明OTMCS-PEI-K12是受体介导的特异性胞内转运,适宜机体中非分裂分化细胞的转染。第五章在前期研究基础上,选择体外转染效果最好的OTMCS-PEI-K12-5作为载体,以ING4为治疗基因,通过构建U87无胸腺小鼠肿瘤模型,采用尾注、瘤注两种给药方式,考察不同质量比载药复合物OPK5/DNA的肿瘤组织靶向性及治疗能力。结果表明,通过尾静脉给药且复合物OPK5/DNA在w/w=12时,目的基因诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤生长的效果最好,说明OPK5有U87肿瘤细胞靶向性能。综上,本课题成功构建新型阳离子聚合物OTMCS-PEI-K12,理化试验和体内、外转染结果表明,OTMCS-PEI-K12可兼得低的细胞毒性和高的转染效率,拥有良好的生物相容性、U87肿瘤细胞靶向性和体液稳定性,适宜作为转基因材料。
李达[3]2007年在《基于聚乙烯亚胺为骨架的非病毒转基因载体的研究》文中研究说明基因治疗是指将人体正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的治疗方式。运载遗传物质的工具称为载体。一项完整的基因治疗实施方案包括目的基因、转基因载体、靶细胞和实施途径的选择等四方面的内容。目前常用的转基因载体包括病毒载体和非病毒转基因载体两大类。其中病毒载体在目前的科研工作和临床试验中是主要使用的载体，占到95％以上。但是病毒载体具有一些难以克服的缺陷，如制备复杂、携带能力有限、靶向特异性差、高免疫原性、体内不能重复使用、可能导致感染的潜在危险和引起细胞恶性转化等，所以近20余年来有越来越多的研究者将视线放在了非病毒载体上面。非病毒载体包括脂质体、纳米粒、胶团等，具有成本低、制备相对简单、容易批量生产、携带遗传物质容量大、安全性好等优点，但也有转基因效率相对低下、本身并无特异细胞或组织靶向性等缺点。聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)是由酸催化氮丙啶单体聚合而形成的一种聚合物。自从约15年前发现其可以缩合质粒DNA并转运到细胞核内后，PEI作为转基因载体引起了研究人员的广泛关注。根据合成路线的不同，PEI具有线状和支链状两种结构，分子量范围在＜1000 Da到1.6×10~3 kDa之间，在转基因载体领域，以分子量为22 kDa和25 kDa的PEI应用最广。在生理pH下，游离的PEI每5-6个氨基氮中有一个氨基氮可以被质子化(约20％)，结合了核酸之后，每2-3个氨基氮中即有一个可以被质子化，进入内含体和溶酶体后，pH下降，PEI的氨基氮能够进一步发生质子化(pH为5.0时，质子化程度为45％)，大量捕获质子，并引起Cl~-离子内流，导致溶酶体渗透性肿胀，无需溶酶体溶解肽的辅助作用溶酶体即可破裂，从而将内吞的DNA释放到细胞浆而最终入核。虽然PEI作为一种转基因效率相对较高的非病毒载体，已经成为非病毒载体领域衡量其他类型载体效率的一个“金标准”，但是其本身仍具有不少缺点如相对于病毒载体转基因效率低、高分子量PEI毒性大、无法生物降解、无特异细胞或组织的靶向性以及体内应用有诸多障碍等，这些缺点明显限制了PEI的实际应用。为了克服PEI上述的不利于转基因以及体内使用的缺点，构建理想的转基因载体，需要对PEI进行改造。目前主要改造思路有配体化、聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)化等，但尚无成熟商品化产品。本研究的目的在于改造PEI，构建具有高转基因效率、低毒性、具有肿瘤细胞和组织的特异靶向性以及适合体内静脉途径使用的转基因载体。整个研究分成叁部分，在以分子量为25 kDa的PEI(PEI25k)为骨架的基础上，分别通过双靶向配体肽偶联、PEG化以及以多臂PEG为核心偶联低分子量PEI叁种修饰策略，设计了3类新型载体。详细研究了载体的合成过程、理化特性、缩合质粒DNA的能力、体内外毒性、体外相应细胞株中的转基因效率、特异细胞的靶向作用以及在体内荷瘤动物模型中的转基因活性，以期得到可以在肿瘤的基因治疗中发挥重要作用的理想载体并部分阐明其转基因的机制。在第一部分研究中，鉴于大部分肿瘤细胞表面高表达成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptors，FGFR)和整合素(integrin)，作者选择了靶向于FGFR的多肽YRSRKYTSWYVALKRTGQYKLGSKC(YC25)和靶向于整合素的含RGD肽CYGGRGDTP(CP9)两条肽，分别偶联到PEI25k上，构建了双受体靶向的载体(YC25-PEI-CP9)，观察合成的载体是否具有转基因效率提高并有特异细胞的靶向性等优点。在该部分研究中，先利用细胞免疫组织化学的方法和FITC标记的YC25肽筛选出了FGFR阳性的COS-7、HeLa细胞和FGFR阴性的PC-3细胞作为研究的工具细胞。在FTIR图谱和紫外吸收图谱上，1630cm~(-1)处的吸收峰和270 nm附近的吸收峰出现提示肽的成功偶联。通过计算~1H NMR图谱上甲基基团中质子峰、苯环中质子峰以及PEI中质子峰的积分，验证了双靶向载体中YC25和CP9与PEI25k的偶联率分别为3.6和6.4。凝胶电泳阻滞实验证明了YC25-PEI-CP9在N／P比为4的时候可以完全缩合质粒DNA。利用透射电镜发现N／P比为10的时候，YC25-PEI-CP9可以将质粒DNA缩合成粒径约为200 nm的类圆形纳米粒(polyplexes)。Polyplexes的粒径通过进一步的粒径测定验证。表面电荷测定结果表明在N／P比为10的时候，YC25-PEI-CP9和质粒DNA形成的polyplexes的表面电荷为30.9±3.6mV。在COS-7细胞中的MTT毒性实验结果表明YC25-PEI-CP9毒性略低于PEI25k。在COS-7细胞和HeLa细胞中的体外转基因实验中发现YC25-PEI-CP9在N／P比为10的时候，具有最高的效率，不仅要远高过PEI25k，也要高于单配体肽偶联的PEI25k。但在PC-3细胞中，以CP9肽单偶联的PEI25k效率最好。随后在HeLa细胞中的游离肽抑制实验证明了偶联的两条肽的靶向作用。体内荷瘤动物模型实验中，双靶向的载体也在荷HeLa肿瘤裸鼠中显示了最好的转基因效率，而在荷PC-3肿瘤裸鼠中CP9肽单偶联的PEI25k显示了良好的效率。大小鼠的急性毒性实验结果表明YC25-PEI-CP9的毒性显为PEI25k的一半左右。通过本部分的研究，作者成功构建的双受体靶向的载体YC25-PEI-CP9，其具有转基因效率高、特异肿瘤细胞和组织靶向性好等优点，但同时也有毒性大、所形成的polyplexes呈现较高表面电荷而不适合体内静脉途径使用等缺点。在第二部分研究中，为了屏蔽PEI25k表面阳性电荷，降低载体毒性，使构建的载体适合体内使用，作者利用PEI25k为骨架，以分子量3400 Da的PEG作为电荷屏蔽基团，并结合特异靶向于FGFR的肽GT10，构建了偶联率分别为1、2和4的PEG化的靶向载体PEI-PEG-GT10(1、2、4)。在本部分研究中首先用FITC标记的GT10经细胞结合实验证明了NIH3T3、HepG2细胞可以和GT10结合，而PC-3细胞则不能，并用此叁种细胞作为转基因实验工具细胞使用。FTIR结果上1732 cm~(-1)处吸收峰的消失以及1658 cm~(-1)处吸收峰的出现提示合成过程的成功。通过~1H NMR结果验证了PEG以及肽相对于PEI25k的偶联率分别为1、2和4。凝胶电泳阻滞实验结果表明PEI-PEG-GT10在N／P比4～5以上时可以完全缩合质粒DNA。粒径检测表明在N／P比＞30的时候，PEI-PEG-GT10(1)可以将质粒DNA缩合成粒径为200 nm左右的纳米粒，而且可以抵抗随着时间的延长导致的聚集现象。透射电镜观察PEI-PEG-GT10与质粒DNA在N／P比为30时形成类圆形的纳米粒，边缘结构偏疏松。其后的表面电荷测定结果表明在N／P比为30时，PEI-PEG-GT10形成的polyplexes表明电荷接近中性。体外毒性实验结果提示PEI-PEG-GT10毒性要远低于PEI25k。体外在NIH3T3细胞中的筛选实验表明PEI-PEG-GT10(1)在N／P比为30的时候，具有最高的转基因效率。在HepG2细胞中的实验验证了这一点，而在PC-3细胞中，GT10肽的偶联未能显示出更好的促转基因作用。在NIH3T3细胞中的游离肽抑制实验证明了GT10肽的靶向作用。随后的血清体系转基因实验表明PEI-PEG-GT10(1)具有抵抗血清抑制转基因的作用。在大小鼠急性毒性实验中，PEI-PEG-GT10(1)的毒性远低于PEI25k。而在荷HepG2细胞的裸鼠中，尾静脉注射PEI-PEG-GT10(1)显示了肿瘤组织的良好转基因效率，当PEI-PEG-GT10(1)携带pCSK-α-IFN质粒后，能够明显抑制肿瘤的生长。通过本部分的研究，作者成功构建了不同偶联率的PEG化的靶向于肿瘤细胞FGFR的PEI25k载体，其具有转基因效率高、能抵抗血清抑制效应、特异细胞和组织靶向性好并适合于体内应用等优点，但仍具有一定毒性。在第叁部分研究中，鉴于低分子量PEI具有毒性低的特点，结合PEG所具有的屏蔽阳性电荷的作用，为了构建转基因效率高、低毒性并适合体内应用的载体，作者以8臂的PEG(8armPEG)为核心，将分子量为600Da的PEI(PEI600)串联成大分子量的聚合物(8armPEG-PEI600)，并在PEI600上偶联靶向于肿瘤细胞表面FGFR的肽MC11(8armPEG-PEI600-MC11)。通过FTIR检测1730 cm~(-1)以及1670 cm~(-1)处吸收峰的生成和消减证明了偶联的成功；通过TGA观察成功合成的8armPEG-PEI600以及8armPEG-PEI600-MC11的热分解性质发生了改变；其后通过GPC以葡聚糖为标准品验证了8armPEG-PEI600以及8armPEG-PEI600-MC11的分子量，与理论值非常接近；而~1H NMR的结果则进一步证明了8armPEG-PEI600以及8armPEG-PEI600-MC11中各组件的偶联率符合理论值。凝胶电泳阻滞实验结果表明8armPEG-PEI600和8armPEG-PEI600-MC11均在N／P比为3的时候，可以完全缩合质粒DNA，而PEI600则需要N／P比达到4方可缩合质粒DNA。通过粒径和表面电荷的检测，可以发现在N／P比为30以上时，8armPEG-PEI600和8armPEG-PEI600-MC11就可以将质粒DNA缩合成约200nm大小，表面电荷约为20mV的纳米粒。MTT的体外结果表明了8armPEG-PEI600、8armPEG-PEI600-MC11和PEI600相似，是毒性极低的聚合物。之后分别以HepG2和PC-3细胞为工具细胞，验证了合成的聚合物的转基因效率。结果表明，在两种细胞中，8armPEG-PEI600在N／P比为30的时候，均可以达到最好的效率，略低于N／P比为10时的PEI25k。但是对于8armPEG-PEI600-MC11而言，在HepG2细胞中，N／P比为30的时候，转基因效率大幅上升，是PEI25k的11倍，而在PC-3细胞中，则没有这种效率增加效应。通过肽抑制实验，可以证明在FGFR阳性的HepG2细胞中游离肽对8armPEG-PEI600-MC11的转基因具有抑制效应。体内实验结果表明polyplexes经尾静脉注射荷瘤裸鼠后，由8armPEG-PEI600所形成的polyplexes已经有很大一部分可以到达肿瘤组织，转基因效率是PEI25k的6倍。而由8armPEG-PEI600-MC11所形成的polyplexes在肿瘤组织中的转基因效率又是8armPEG-PEI600的3.1倍。如果载体携带pCSK-α-IFN治疗肿瘤，8armPEG-PEI600-MC11组显示了较好的治疗效果。通过本部分的研究，作者成功构建了载体8armPEG-PEI600-MC11，其具有转基因效率高、毒性极低、特异细胞组织靶向性好等优点，但其和质粒DNA形成的polyplexes呈现相对较高的表面电荷影响了其体内应用。综上所述，本研究通过叁种偶联策略，成功地合成了FGFR和整合素双靶向的PEI25k载体、FGFR靶向的PEG化的PEI25k载体以及8armPEG为核心的串联小分子PEI600的并靶向于FGFR的载体。合成的新型载体都能够在一定的条件下将质粒DNA缩合成适合于转基因的polyplexes，且具有相应受体阳性细胞的靶向性，体外应用具有转基因效率高等特点，体内应用有一定的效果。相对于PEI25k而言，叁类载体各有优点，如均有体外转基因效率高、靶向性好等特点，但亦各有缺点，如YC25-PEI-CP9毒性较大，相应形成的polyplexes的高表面电荷使其不适合静脉使用；PEG化的PEI25k仍具有一定毒性，主骨架高分子量的PEI25k无法降解；8armPEG为核心的载体形成的相应polyplexes也是呈现相对高的表面阳性电荷，影响静脉使用等。本研究横跨有机化学、分析化学、高分子化学、药物学、分子生物学和肿瘤学等多个学科领域，多学科的结合为转基因载体的开发工作提供了崭新的研究思路。研究中所选的靶向位点在肿瘤的靶向基因治疗中具有良好的应用前景。多种理化分析手段、靶向肽的设计和偶联策略等内容具有创新性。合成过程线路明确，重复性好，所需要的合成条件可行性好，为载体的大规模工业制备奠定了扎实的基础。虽然合成的载体离理想转基因载体的要求尚有一定距离，但相信通过进一步完善载体的构建策略如将PEG等分子整合入PEI主骨架、对PEI的氨基进行酰化、在PEI单体上连接疏水基团以及构建能同时携带质粒DNA和化学药物的载体等，一定能获得适合于全身应用的高效率的转基因载体并应用于具体的基因治疗方案。
李经忠, 王青青, 余海, 沈芬平, 李达[4]2004年在《bFGF寡肽靶向的聚乙烯亚胺转基因非病毒载体的研制》文中研究表明对靶向于肿瘤的基因载体的研究有重要意义和紧迫性。聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)是目前最常用的阳离子多聚物转基因载体。通过受体介导的内吞作用可以增加PEI的转染效率和靶向性。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是一种有丝裂原活性的生长因子,许多肿瘤组织及肿瘤新生血管和大多数肿瘤细胞系都高表达
朱青[5]2013年在《两亲性壳聚糖连接低分子量聚乙烯亚胺为骨架的肿瘤靶向转基因载体的构建》文中研究表明基因治疗的本质是通过基因导入系统将外源基因导入靶细胞，通过遗传或分子生物学技术纠正或补偿基因缺陷和异常，以达到治疗疾病的目的。作为一种新的治疗手段，基因治疗可以克服包括肿瘤、遗传性疾病、心血管疾病和自身免疫缺陷等多种疾病，目前研究主要集中于肿瘤的治疗。基因治疗的关键是选择安全且高效的转基因载体，使目的基因高效作用于特定细胞且细胞毒性较小。转基因载体有病毒型和非病毒型两种。聚乙烯亚胺（polyethylenimine, PEI）因其结构中含有多种氨基，质子化后含丰富电荷而成为研究最为广泛的一种聚阳离子型非病毒转基因载体。然而PEI应用于转基因载体尚存在叁个突出问题：第一，转染效率与细胞毒性存在矛盾：高分子量PEI转染效率高，但细胞毒性大；低分子量PEI细胞毒性小，但转染效率低。第二，体液稳定性与穿膜能力存在矛盾：通过增加亲水性来增加PEI体液稳定性将会降低PEI的穿膜能力，而不利于目的基因递送。第叁，PEI的细胞靶向性差。由于PEI是靠静电相互作用与细胞结合，因此无法识别并作用于特定细胞。壳聚糖（Chitosan, CS）是一种天然高分子化合物，由甲壳类动物的甲壳素脱乙酰基后得到，具有高生物相容性和低细胞毒性，也被用作转基因载体。但壳聚糖在生理条件下溶解度低，且表面电荷少，使其转染效率低，限制了其作为转基因载体的应用。整合素是细胞表面受体的主要家族，对细胞和细胞外基质的粘附起介导作用。整合素是由α（120-185kDa）和β（90-110kDa）两个亚单位形成的异二聚体，已发现20余种，其中整合素αvβ3在多种肿瘤表面和新生血管内皮细胞中高表达，对肿瘤血管的生成起着重要作用，因此，整合素αvβ3成为抗肿瘤药物的作用靶点。基于以上分析，本课题首先对壳聚糖CS进行改性，得到两亲性壳聚糖N-辛基-N-季铵化壳聚糖OTMCS，然后以其连接低分子量PEI（PEI2KDa），得到高分子量聚乙烯亚胺衍生物OTMCS-PEI。同时将特异亲和整合素αvβ3的RGD肽与细胞穿膜肽TAT（49-57）偶联，形成具有靶向于肿瘤细胞和提高穿膜效率的双功能肽RGDC-TAT（命名为R13）。最后，采用双功能肽R13修饰PEI衍生物OTMCS-PEI，得到新型转基因载体OTMCS-PEI-R13。本文第一章介绍了聚乙烯亚胺与壳聚糖在转基因载体中的应用，包括聚乙烯亚胺的结构特性、对其进行不同的修饰得到的各种聚乙烯亚胺衍生物以及壳聚糖的结构特性、研究热点等。第二章内容为OTMCS-PEI-R13的合成与表征。首先采用固相法制备双功能肽R13，并通过质谱测定其序列，HPLC测定其相对含量，并采用酶联免疫法检测R13与整合素αvβ3阳性的Hela细胞和B16细胞的亲和能力。壳聚糖CS依次与正辛醛、N-甲基吡咯烷酮在一定条件下反应得到两亲性壳聚糖N-辛基-N-季铵化壳聚糖OTMCS，进而采用叁光气+琥珀酰亚胺法活化OTMCS并与PEI2KDa连接形成OTMCS-PEI高分子量衍生物。最后通过交联剂SMCC将R13按不同摩尔比与OTMCS-PEI偶联得到最终产物OTMCS-PEI-R13。各反应产物通过IR或1HNMR进行结构分析。结果表明，成功合成了双功能肽R13，其纯度达到95%，同时，R13表现出良好的肿瘤细胞亲和能力。成功合成了两亲性壳聚糖OTMCS，并采用叁光气+琥珀酰亚胺法活化OTMCS并交联PEI2KDa，最后成功采用SMCC法将R13与OTMCS-PEI偶联形成最终产物OTMCS-PEI-R13。红外、核磁等结构表征表明目的产物修饰度高且纯度好，说明合成方法稳定、可控。本文第叁章考察了OTMCS-PEI和OTMCS-PEI-R13的理化性质。通过测定两种聚合物在37℃下不同时间点分子量来评价其水解性能；使用激光粒度仪和Zeta电位测定仪测定其粒径及表面电位；使用透射电镜观察其形态结构；通过凝胶电泳阻滞分析考察其包裹DNA的能力及对DNA的保护能力；采用MTT法评价两种聚合物对Hela细胞、B16细胞的毒性，并与PEI25KDa和PEI2KDa进行比较。结果表明，OTMCS-PEI-R13在37℃条件下可缓慢水解，大约60小时水解为小分子聚合物。与DNA形成的复合物呈类球形，粒径约150-250nm，电位适中。OTMCS-PEI与DNA质量比为0.6时可将DNA完全包裹，OTMCS-PEI-R13-l与DNA质量比为1时将DNA完全包裹，OTMCS-PEI-R13-h与DNA质量比为3时将DNA完全包裹，叁者均具有较强DNA缩合能力。同时，OTMCS-PEI可保护DNA抵抗1100μg/mL肝素钠、3U DNase I/μg DNA的DNaseI及50%血清的解离，OTMCS-PEI-R13可保护DNA抵抗300μg/mL肝素钠、23.5U DNase I/μg DNA的DNase I及50%血清的解离。以上结果表明OTMCS-PEI和OTMCS-PEI-R13均具有很强的DNA保护能力。与高分子量PE（IPEI25KDa）相比，OTMCS-PEI与OTMCS-PEI-R13的细胞毒性显着降低，低浓度时与PEI2KDa毒性类似，即使在高浓度时仍保持60%以上细胞活度。本文第四章考察了OTMCS-PEI/DNA、 OTMCS-PEI-R13-l/DNA及OTMCS-PEI-R13-h/DNA复合物体内外转染。以pEGFP-N2绿色荧光蛋白质粒和pGL3-Control虫荧光素酶质粒为报告基因，考察两种复合物在Hela细胞和B16细胞中的体外转染能力。荧光倒置显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况，生物/化学发光仪定量检测虫荧光素酶表达情况。最后建立肿瘤模型，以pGL3-Control虫荧光素酶质粒作为报告基因，考察复合物在体内的分布和表达情况。结果表明，随着w/w升高，转染效率也逐渐升高，叁种复合物的转染效率均显着高于PEI25KDa，尤其连接R13后，转染效率更大幅提高。体内试验表明，复合物在体内的转染效率同样优于PEI25KDa，偶联R13后，虫荧光素酶报告基因在肿瘤组织中表达增强，表明R13可明显改善复合物在体内的分布，可知OTMCS-PEI-R13在体内具有较强肿瘤靶向能力。本课题通过合成两亲性壳聚糖N-辛基-N-季铵化壳聚糖OTMCS并与低分子量PEI连接形成高分子量聚乙烯亚胺衍生物，降低了细胞毒性；与双功能肽R13偶联后，提高了肿瘤靶向性和穿膜效率，进而提高了转染效率。最终合成了转染效率高、细胞毒性低的新型转基因载体OTMCS-PEI-R13，克服了PEI作为转基因载体使用中存在的问题。
黄宏靓[6]2007年在《环糊精偶联低分子量聚乙烯亚胺构建新型非病毒转基因载体及其应用》文中提出基因治疗是将人正常的或有治疗作用的基因通过一定方式导入靶细胞来干预疾病的发生、发展和进程，包括替代或纠正人自身基因结构或功能上的缺陷或错误，杀灭病变的细胞或增强机体清除病变细胞的能力等，从而达到治疗的目的。现在基因治疗已经进行了较多的研究，并且有一些研究已经进入临床试验阶段。现在全世界范围内已经批准的基因治疗临床试验方案超过了1200项，其中近70％是针对恶性肿瘤的治疗。在基因治疗的实施中，有四个重要的环节：一是寻找有效治疗基因，二是研制可以携带基因进入靶细胞进行表达的有效安全的转基因载体体系，叁是选择合适有效的转基因途径，四是如何使治疗基因在靶细胞中特异性表达，发挥有效治疗作用。其中缺乏有效安全的转基因载体体系是制约基因治疗实施的一个主要瓶颈。目前基因治疗使用最多的转基因载体是腺病毒和逆转录病毒载体，约占治疗使用载体总数的50％。病毒载体具有很高的转基因效率，但使用病毒载体有许多缺点，主要包括病毒载体有较强的免疫原性，大量使用会产生较强的免疫反应，出现的首例基因治疗导致死亡的病例是在使用重组腺病毒载体治疗鸟氨酸氨甲酰基转移酶部分缺陷症的病人，由于大剂量注射重组病毒激发了机体严重的免疫反应，多器官衰竭导致死亡。此外病毒载体的应用还有出现插入突变的现象，可能导致宿主细胞的恶性转化，而且病毒载体有限的携带DNA能力，不利于大规模的生产也是限制其应用的主要缺点。非病毒载体与病毒载体相比，其优点主要体现在非病毒载体很低免疫原性，不具备插入突变的能力，易于大规模生产和生产成本较低。但非病毒载体的最大缺点是其转基因效率较低。理想的非病毒转基因载体应该是可以降解的，毒性很低的，有较高转基因效率，并且具备靶向到目标细胞或是组织的能力，使治疗基因在靶细胞或组织中发挥作用。为了寻找理想的非病毒转基因载体，目前以阳离子多聚物作为转基因载体的研究较多。其中一种阳离子多聚物多聚乙烯亚胺(PEI，polyethylenimine)研究是最多的。PEI是经过酸催化氮丙啶单体聚合，可以形成线型或分枝状的聚合物结构，有较高的阳性电荷，与带有阴性电荷的DNA或RNA结合能力较强，可以与DNA或RNA形成复合物粘附到细胞表面被细胞内吞。PEI有很多质子化的多级氨的氮原子，当溶酶体内的pH下降时，PEI能够大量捕获质子，并引起Cl~-内流，导致溶酶体渗透性肿胀，最后溶酶体破裂从而将内吞的DNA释放到细胞质(即质子海绵效应)，DNA释放后进入细胞核中并表达。PEI的分子量的范围变化很大，一般应用于转基因载体的PEI的分子量在5000-25000 Da。高分子量的PEI转基因效率很高，如分枝状25000 DaPEI(PEI 25 kDa)，但毒性也很大。低分子量PEI毒性很低，但一般而言其转基因效率很低，并且PEI作为转基因载体直接体内应用会导致红细胞的聚集，可以与血液中的白蛋白等非特异性结合，导致聚合体的形成，体内应用转基因效率低，一般不单独做为基因药物的载体。所以需要对PEI进行修饰。修饰PEI的目的主要是降低PEI的毒性，提高PEI和DNA复合物的稳定性，提高靶向性，减少与白蛋白的非特异性结合，延长体内的时间等等。考虑到高分子量的PEI毒性很大，本研究选择低毒的低分子量PEI进行修饰，通过与羟丙基环糊精偶联形成新的共聚物，再经过系列试验筛选得到高转基因效率的新型转基因载体。并且提出一个新的设计非病毒转基因载体的思路，即选择一种低毒的多羟基化合物和另一种低毒的多氨基化合物，再选用合适的可以形成可降解的连接基团的试剂将二者连接起来，那么形成的共聚物是可降解的和低毒性的，经过进一步筛选以得到高效率的转基因载体，在此基础上再提高其靶向性，提高载体与靶点的特异结合能力。在目前肿瘤的基因治疗中，阻碍基因成功转移的一个主要原因是缺乏较强靶向肿瘤细胞或组织能力的转基因载体体系。为了提高转基因载体的靶向性，选择能与肿瘤特异性靶点特异结合的靶向物来修饰转基因载体显得非常重要。在人类20-30％乳腺癌和部分卵巢癌的细胞中，Her-2受体过度表达，目前有一些研究利用针对Her-2受体的曲妥珠单抗与非病毒载体偶联，以提高非病毒转基因载体靶向Her-2受体阳性肿瘤细胞的能力。但是抗体是较大的蛋白质，不宜重复给药。所以本研究考虑使用可以与Her-2受体特异结合的靶向性的寡肽与新型非病毒载体偶联，本研究根据文献报道，在噬菌体展示技术筛选得到的寡肽中选择了一条能与Her-2受体特异结合的高亲和力寡肽(其氨基酸序列是Met-Ala-Arg-Ala-Lys-Glu)，与新型载体连接，以提高载体与Her-2受体阳性肿瘤细胞或组织的特异结合能力。通过在一些Her-2受体阳性的乳腺肿瘤和卵巢肿瘤细胞中进行转基因试验，最终研制出一种新型的具有靶向性，低毒，可降解的高效率转基因载体。本研究分两部分进行：第一部分，选择了水溶性好低毒性的多羟基化合物羟丙基环糊精(HPα-CD，2-羟丙基α-环糊精；HPβ-CD，2-羟丙基β-环糊精；HPγ-CD，2-羟丙基γ-环糊精)作为骨架，同时选择了低毒性的多氨基化合物，即低分子量多聚乙烯亚胺(分枝状PEI 600 Da和线型的PEI 423 Da)作为支链，通过一种可以形成可降解酯键的试剂羰二咪唑(CDI)进行连接形成新的共聚物，筛选出高效，低毒，可降解的新型载体。第二部分，通过一段靶向寡肽与新型载体的偶联(该寡肽可以与Her-2受体胞外段特异结合)，从而使得新型载体具有一定靶向能力，提高特异性。经过体外体内的试验证实寡肽偶联的新型载体具备了靶向到Her-2受体的肿瘤细胞的能力，提高了在靶细胞的转基因效率，新型载体携带α-干扰素的真核表达质粒在荷瘤裸鼠的基因治疗中显示了较好的治疗效果。第一部分羟丙基环糊精偶联低分子量聚乙烯亚胺构建新型非病毒转基因载体目的：选用羟丙基环糊精系列作为骨架偶联低分子量PEI，以构建新型可降解，低毒，高效率转基因载体。方法：选择了多羟基化合物羟丙基环糊精作为骨架，同时选择了多氨基化合物低分子量PEI(分枝状PEI 600 Da和线型的PEI 423 Da)作为支链，通过试剂羰二咪唑进行连接形成多种新的共聚物，通过质子核磁共振波谱法，红外分光光度分析法，热分析法等表征手段对新合成的共聚物的结构进行验证，并通过质子核磁共振波谱法检测新共聚物的环糊精和PEI的相对组成。通过检测粒径大小，表面电荷以及通过DNA凝胶电泳阻滞试验来评估新共聚物缩合DNA的能力。通过MTT法检测共聚物对不同细胞毒性。以合成的共聚物为载体携带绿色荧光蛋白质粒进行多种细胞转染，观察细胞的绿色荧光，使用共聚物携带荧光素酶质粒进行多种细胞转染，再用化学发光仪检测荧光素酶与底物蛋白结合后显示的相对荧光强度，评估转染效率。并在有血清和无血清的培养液中，比较血清对载体的转染效率的影响。在接近生理条件下进行共聚物的可降解性检测。结果：经过多次合成得到了HPα-CD-PEI 600，HPβ-CD-PEI 600，HPγ-CD-PEI 600，HPβ-CD-PEI 423，HPγ-CD-PEI 423等多种新的共聚物。通过质子核磁共振波谱法，热分析法证实新共聚物的产生，红外分光光度分析法证实PEI 600，PEI 423分别是以酯键与羟丙基环糊精相连。并且使用质子核磁共振波谱法得到的积分数据分析了新的共聚物中环糊精和PEI的组成，其中HPγ-CD-PEI 600上的PEI 600接入最多，每分子HPγ-CD的羟丙基上约接上了3.3分子PEI 600，HPβ-CD-PEI 600中，每分子HPβ-CD的羟丙基上约接上了3.2分子PEI 600。HPα-CD-PEI 600中，每分子HPα-CD的羟丙基上约接上了1.66分子PEI 600。线型的PEI 423的接入要明显少于分枝状的PEI 600接入。粒径检测结果显示，HPα-CD-PEI 600与质粒DNA复合物的最小粒径出现在N／P比值为400时(N／P比值，N／P Ratio，the number of nitrogen residues of PEI per DNA phosphate Ratio，PEI的氮摩尔数／DNA的PO_3~-摩尔数)，粒径约为325 nm。HPβ-CD-PEI 600与质粒DNA复合物的最小粒径出现在N／P比值为300时，粒径约195 nm。HPγ-CD-PEI 600与质粒DNA复合物的最小粒径出现在N／P比值为40时，粒径约174 nm。表面电荷检测显示，HPα-CD-PEI 600／DNA复合物的表面电荷在N／P比值增加到200以上后，电荷基本维持在+10 mv以上，不超过+20mv；HPβ-CD-PEI 600／DNA复合物表面电荷当N／P比值增加到150以上后，电荷基本维持在约+20mv：HPγ-CD-PEI 600／DNA复合物在N／P比值增加到40以后，电荷基本维持在约+20mv。HPβ-CD-PEI 423和HPγ-CD-PEI 423／DNA复合物的最小粒径分别是约389 nm和468 nm，表面电荷在N／P比值增加到200以上后，维持在+10mv以上。DNA凝胶电泳阻滞试验中，HPα-CD-PEI 600在N／P比值为12∶1时，HPβ-CD-PEI 600在N／P比值为8∶1时可以完全阻滞DNA的迁移，HPγ-CD-PEI 600在N／P比值为4∶1时可以完全阻滞DNA的迁移。这表明共聚物有强的缩合DNA的能力。选择了其中缩合DNA的能力较强的HPα-CD-PEI 600，HPβ-CD-PEI 600，HPγ-CD-PEI 600这叁种共聚物作为转基因载体，进一步检测其毒性和转基因的效率。在不同的细胞中，均显示HPβ-CD-PEI 600毒性最低，HPα-CD-PEI 600其次，HPγ-CD-PEI 600毒性稍大，但它们的毒性都远小于PEI 25 kDa。从这些新共聚物中筛选出两种较高转染效率的新型载体，HPβ-CD-PEI 600的最高转染效率在不同的细胞的适宜N／P比值一般在300，HPγ-CD-PEI 600的适宜N／P比值一般在40或是60。HPβ-CD-PEI 600和HPγ-CD-PEI 600最高转染的效率与PEI 25 kD的转染效率相近或略高。HPαCD-PEI 600的转染效率较低。在有血清和无血清培养液转染试验中，PEI 25 k Da有血清存在的情况下转染COS-7细胞的转染效率最高值是无血清中转染效率最高值的62.2％，HPα-CD-PEI 600有血清存在的情况下转染效率的最高值是无血清最高值的的89.0％，HPβ-CD-PEI 600有血清存在的情况下转染效率最高值是无血清中最高值的的91.4％，HPγ-CD-PEI 600有血清存在的情况下转染效率最高值是无血清中最高值的的98.4％。接近生理条件下，HPγ-CD-PEI 600是可以降解的共聚物。在处理48小时后，HPγ-CD-PEI 600偶联的PEI 600约减少了一半。讨论：合成得到了HPα-CD-PEI 600，HPβ-CD-PEI 600，HPγ-CD-PEI 600，HPβ-CD-PEI 423，HPγ-CD-PEI 423等多种新的共聚物。HPβ-CD-PEI 600，HPγ-CD-PEI 600缩合DNA的能力较强。从中筛选出HPβ-CD-PEI 600，HPγ-CD-PEI 600两种较高转染效率的新型载体。HPγ-CD-PEI 600达到最高转基因效率的N／P比值较低，所以使用量小于HPα-CD-PEI 600和HPβ-CD-PEI 600。HPα-CD-PEI 600，HPβ-CD-PEI 600，HPγ-CD-PEI 600转染细胞时，转基因效率受血清影响较小，HPγ-CD-PEI 600转基因效率受血清影响最小。因为HPγ-CD-PEI 600的转基因效率高，用量小，在有血清培养液中的转染效率下降最少，所以最终选择了HPγ-CD-PEI 600进行第二部分试验。比较共聚物的不同组成和转基因效率的关系，认为PEI的接入量与共聚物缩合DNA的能力和转基因的效率有直接的关系。新的共聚物中PEI的接入量高，共聚物缩合DNA的能力强，转基因的效率也较高。第二部分提高新型载体靶向Her-2受体阳性细胞的能力目的：将新型载体HPγ-CD-PEI 600与靶向寡肽偶联，使其具有靶向到Her-2受体阳性的乳腺肿瘤或卵巢肿瘤细胞的能力。方法：根据文献报道的通过噬菌体展示技术筛选出来，针对Her-2受体蛋白的一段高亲和力寡肽(序列为MARAKE)做为配体通过试剂SPDP偶联新型载体HPγ-CD-PEI 600。质子核磁共振波谱法验证寡肽与新型载体的偶联。偶联寡肽的载体携带绿色荧光蛋白质粒及荧光素酶质粒转染Her-2受体阳性细胞(卵巢癌SKOV-3c细胞，乳腺癌SK-BR-3细胞和T 47D细胞)和Her-2受体阴性细胞(乳腺癌MCF-7细胞)，用流式细胞仪检测具有绿色荧光细胞百分率，化学发光仪检测荧光素酶相对荧光强度，比较偶联寡肽后与未偶联寡肽载体的转基因效率。通过自由寡肽的阻断来比较偶联寡肽的新型载体与未偶联寡肽载体的转染效率。体内试验使用SKOV-3c细胞接种裸鼠成瘤，然后使用偶联寡肽的新型载体携带α-干扰素的真核表达质粒进行瘤内注射，观察肿瘤生长情况及裸鼠的生存期。结果：在质子核磁共振波谱法检测合成产物后，证实载体与靶向性的寡肽偶联。分别使用偶联寡肽的HPγ-CD-PEI 600和未偶联寡肽的HPγ-CD-PEI 600携带绿色荧光蛋白质粒及荧光素酶质粒转染不同的Her-2受体阳性细胞，检测发现，偶联寡肽的HPγ-CD-PEI 600和未偶联寡肽的HPγ-CD-PEI 600相比，偶联寡肽的HPγ-CD-PEI 600在卵巢癌SKOV-3c细胞转染后绿色荧光细胞百分率提高了87％，荧光素酶检测的相对荧光强度提高了63％；偶联寡肽的HPγ-CD-PEI 600在SK-BR-3细胞转染后绿色荧光细胞百分率提高了58％，相对荧光强度提高了77％；偶联寡肽的HPγ-CD-PEI 600在T 47D细相对荧光强度提高了71％。偶联寡肽的HPγ-CD-PEI 600在Her-2受体阴性细胞(乳腺癌MCF-7细胞)的转基因效率没有提高。自由寡肽抑制试验的结果显示在自由寡肽存在的情况下，偶联寡肽的HPγ-CD-PEI 600并没有明显提高在Her-2受体阳性细胞转基因效率。在荷瘤裸鼠使用新型非病毒载体携带α-干扰素质粒瘤内注射治疗效果表明新构建的载体具有比PEI 25 k Da更好的治疗效果，治疗后裸鼠肿瘤生长受到了较为显着的抑制，偶联靶向寡肽的载体治疗组的小鼠肿瘤生长抑制最为明显。偶联靶向寡肽载体治疗组的荷瘤裸鼠生存期明显延长。讨论：新型载体易于偶联新的功能性的基团，新构建的载体通过与靶向寡肽MARAKE偶联后，可以提高对Her-2阳性肿瘤细胞基因效率。偶联寡肽的载体具备了对Her-2阳性肿瘤细胞的靶向性。新型非病毒载体携带α-干扰素质粒治疗荷瘤裸鼠效果结果显示了偶联寡肽的新型载体具有较好的体内应用前景。结论与展望：本研究选择多羟基的环糊精衍生物作为骨架，通过CDI这个试剂，与低分子量PEI进行偶联形成新的共聚物。CDI是可以将具有羟基的化合物和具有氨基的化合物进行连接的试剂，并且连接在两个化合物之间的酯键可以降解。在合成的共聚物中筛选到了有较强缩合DNA的能力的，转基因效率较高的新型转基因载体。通过比较共聚物的不同组成和转基因效率的关系，认为PEI的接入量与共聚物缩合DNA的能力和转基因的效率有直接的关系。新的共聚物中PEI的接入量高，共聚物缩合DNA的能力强，转基因的效率也较高。新的共聚物的优点还在于其容易进行进一步改造，引入合适的靶向物，提高靶向能力。新型转基因载体设计的新思路在试验中证实了可行性，而且通过靶向基团的引入可以获得具有靶向特异细胞或组织能力的高转基因效率的载体。由于环糊精自身有疏水性的空穴，可以包合药物，今后还可以应用于包合治疗药物，从而同时携带治疗基因和药物，提高治疗效果。
刘君[7]2008年在《偶合靶向配体的β-环糊精—低分子量聚乙烯亚胺作为基因载体系统的研究》文中认为基因治疗是将目的基因通过载体系统导入机体细胞或组织,并表达出有疗效作用的产物,在体内发挥治疗疾病的目的。基因治疗一个关键的技术是建立高效、安全、低副作用的基因载体系统。目前基因治疗中的载体系统主要分为病毒载体系统和非病毒载体系统。病毒载体转导基因的效率较高,但具有制备负载、携带能力有限、靶向特异性差高免疫原性、体内不能重复使用以及易引起细胞恶性转化等,非病毒载体与病毒载体相比,其优点主要体现在非病毒载体很低免疫原性,不具备插入突变的能力,易于大规模生产和生产成本较低。但非病毒载体的最大缺点是其转基因效率较低。常见的非病毒载体主要包括阳离子脂质体,阳离子多聚物和阳离子多肽等。其中聚乙烯亚胺(PEI,polyethylenimine)是目前研究颇为成功的聚阳离子非病毒载体材料,其特殊的结构能够很好绑定质粒DNA,保护DNA进入细胞,在很宽的生理PH值范围质子化,释放DNA,取得较高的转基因效率。但聚乙烯亚胺的转染效率和细胞毒性均随分子量的增加而增大,并且直接体内应用会导致红细胞的聚集,与血液中的白蛋白等发生非特异性结合,导致聚合体的形成,一般不单独做为基因药物的载体。所以需要对PEI进行修饰。本研究选用β-环糊精(β-CyD)作为骨架,经过表面修饰后将低分子量的PEI连接起来,制成基因药物载体的母体。结构中β-环糊精上的羟基可以增强载体和细胞膜的黏附作用,其柔软的结构可以偕同PEI顺利穿透细胞膜屏障。合成的母体材料具有毒性低、安全性高和转染效率好等特点。在此研究基础上,为增加载体的靶向性、提高细胞的转染效率,我们选用不同小分子配体对载体进行修饰,这些配体包括叶酸、寡肽和小分子药物炔诺酮。键合靶向配体后,载体的特点更为明显,可达到毒性低、转染效率高、肿瘤特异性强等特点。本实验重点对偶合配体后载体材料在细胞毒性,体外转染性、肿瘤特异性等方面进行系统研究。
刘新生[8]2005年在《乳糖化PEI-磁性纳米粒载体介导的血管抑素基因治疗肝癌的实验研究》文中进行了进一步梳理近年来，随着分子生物学的发展，抗血管生成疗法(Antiangiogenosis therapy)治疗肿瘤格外引人注目，尤其是以血管抑素(Angiostatin)为代表的血管抑制剂对肿瘤的基因治疗更是当今的研究热点。肝癌是具有双重血供的肿瘤，有丰富的血管供其营养。因而，对其进行抗血管生成治疗必将会有令人惊奇的疗效。其意义在于，该疗法有可能摆脱目前传统方法对肝癌疗效不能令人满意的困境，从而成为治疗肝癌的新策略。 问题是，基因治疗必须有合适的载体来完成，而目前的基因载体都不能令人满意。无论是病毒载体还是非病毒脂质体载体都存在不同程度的自身缺陷，不能很好的胜任体内的转基因治疗。因而寻找一种理想的基因载体就成为当务之急。 近年来，纳米粒基因载体的出现为克服上述困难提供了可能。纳米粒与传统的基因载体相比较有其独特的优势，不仅具有生物相容性好、携药量大、安全性高以及易于制备、成本低等优点，而且可以通过对其表面改性或吸附某些受体进一步提高基因的转染效率和靶向性能。因而，纳米粒是一个很有应用前景的基因治疗载体。 本研究以磁性四氧化叁铁纳米粒为核，聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)为壳，同时进行乳糖化修饰，制备出对肝脏具有双靶向性能的乳糖化PEI-磁性纳米粒载体，并对其表征、性能以及体内外转基因能力进行了检验。结果显示，纳米粒成球型，颗粒均匀，平均直径为46nm。乳糖化磁性Fe_3O_4纳米粒在200μg/ml时对组织细胞是安全的；与DNA质量比为3：1时，包封率最高，可达95％左右；接近血浆内环境PH值时结合力最稳定。所制得的乳糖化PEI-Fe_3O_4纳米粒具有磁响应性、生物相容性、长循环功能等特点。与脂质体相比，对组织细胞的毒性小。具备了理想基因载体应有的特点。转染实验表明，乳糖化磁性Fe_3O_4纳米粒在体内外均可成功地将所携基因转染到肝癌细胞内并有分泌活性。进一步研究表明，转染后的血管抑素基因可以在裸鼠的种植瘤体内通过相对减少VEGF而抑制肿瘤新生微血管的形成，进而诱发肿瘤细胞的凋亡，最后发挥抑制肿瘤生长的作用。每周一次，每次20μg的剂量即可达到治疗效果。因此，乳糖化PEI-磁性纳米粒载体是一种较为理想的基因载体，由其携带血管抑素转基因治疗肝癌的方法，
刘克海[9]2012年在《双功能RGD-TAT修饰的DNA纳米胶束的构建及细胞转运机制研究》文中研究表明基因治疗现已成为攻克肿瘤最具希望，也是研究最为活跃的领域。基因导入系统是基因治疗的核心技术。现阶段面临的最大难题在于尚未找到理想的基因载体，治疗基因的导入仍然是肿瘤基因治疗的瓶颈。非病毒载体近年来发展迅速，其中聚乙烯亚胺(polyethylenimine PEI)是近年来研究最为广泛的阳离子多聚物非病毒基因载体，然而，聚乙烯亚胺作为基因载体使用存在叁个突出问题：第一，转染效率与细胞毒性存在矛盾。小分子PEI虽细胞毒性低，但转染效果差，高分子量PEI虽具有较理想转染效率，但细胞毒性强；第二，体液环境中稳定性与穿膜能力存在矛盾。为增加复合物体液环境中的稳定性，应提高PEI/DNA复合物的亲水性，但同时穿膜能力也因而受到影响，使转导效率显着降低。第叁，聚乙烯亚胺靶向性差，解决靶向性问题已成为非病毒载体中最为关注的问题。基于以上分析，本课题首先采用Pluronic P123连接低分子量聚乙烯亚胺(PEI2000)，得到多分枝状或网状结构的高分子量PEI衍生物，然后利用整合素αvβ3在人多数肿瘤细胞和肿瘤新生血管高表达的特点，选择特异亲和该整合素的RGD短肽，与细胞穿膜肽TAT(49-57)连接，合成具有靶向于αvβ3和促进载体穿膜的含RGD和TAT(49-57)双功能肽RGDC-TAT(命名为R13)，利用交联技术将R13与PEI衍生物偶联，从而构建新型非病毒基因载体系统P123-PEI-R13，并考察该系统细胞穿膜及胞内转运、释放机制。本课题针对PEI作为基因载体使用中存在的问题，旨在保证较高转染效率情况下，降低PEI细胞毒性，增加其对肿瘤细胞及其新生血管的靶向性，进而提高基因的细胞摄取水平和转染效率，提高肿瘤的基因治疗效果，为基因治疗探索一条有效的途径。本课题第一部分内容是P123-PEI-R13合成与表征。首先采用固相法制备双功能肽R13（RGDC-TAT），并通过电喷雾质谱分析鉴定其序列，通过HPLC测定其相对百分含量，通过表位肽标记的HRP来检测R13与整合素阳性的Hela细胞与B16细胞的体外结合。进而采用叁光气+琥珀酰亚胺法活化Pluronic P123，并以其为反应剂交联PEI2KDa，得到高分子量PEI衍生物P123-PEI，再选择SMCC法将R13按不同反应比与P123-PEI偶联，得到目的产物P123-PEI-R13，各反应产物通过IR或1H-NMR进行结构分析。结果表明，成功合成了双功能肽R13，其序列为Arg-Gly-Asp-Cys-Arg-Lys-Lys-Aarg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg（RGDCRKKRRQRRR），纯度为95.8677%，同时R13体外具有亲和整合素αvβ3阳性细胞的能力；成功采用叁光气+琥珀酰亚胺法活化P123并交联PEI2KDa，同时成功采用SMCC法将双功能肽R13与P123-PEI偶联，红外、核磁等结构表征表明目的产物修饰度高、纯度好，表明所选合成方法稳定、可控、重复性好。本课题第二部分内容是P123-PEI-R13理化性质。通过测定P123-PEI-R13在37℃下不同时间点分子量的方法评价其水解性能，采用琼脂糖凝胶电泳阻滞分析考察其缩合DNA能力以及对质粒DNA抗DNase I、FBS和肝素钠酶解及解离能力，利用透射电镜观察复合物形态，使用激光粒度仪和zeta电位仪测定粒径、电位，采用MTT法评价合成的P123-PEI-R13对Hela细胞、B16细胞的毒性，并与PEI25kDa对照。结果表明，聚合物P123-PEI-R13在37℃可缓慢水解，大约60h左右可水解成小分子化合物，其水解过程可用一级动力学方程描述。P123-PEI-R13/DNA复合物呈近似球形的胶束样结构，粒径在100-300nm之间，电位适中。P123-PEI-R13与DNA质量比为2时能与DNA完全结合，同时可抵抗高达280μg/mL的肝素钠、50%的FBS及6UDNase I/DNA的解离或酶解。相比较PEI25kDa，P123-PEI-R13细胞毒性显着降低。本课题第叁部分内容是P123-PEI-R13/DNA纳米复合物体内外转染。以绿色荧光蛋白质粒pEGFP-N2和虫荧光素酶质粒pGL3-Control作为报告基因，评价其对Hela人宫颈癌细胞、B16小鼠黑色素瘤细胞及HepG2人肝癌细胞转染能力，采用流式细胞仪和发光仪测定绿色荧光蛋白表达阳性细胞百分率和转染细胞的虫荧光素酶活性，分别定性定量考察P123-PEI-R13对各受试细胞体外转染效率，同时，构建肿瘤模型，以虫荧光素酶质粒pGL3-Control作为报告基因，评价P123-PEI-R13递送DNA时在体内的分布与转染效率。体外转染试验表明，在考察的w/w范围内，随w/w比提高，转染效率有逐渐增强的趋势；随R13修饰比提高，转染效率有逐渐下降趋势；整体而言，P123-PEI-R13在各细胞转染远好于PEI2KDa，也好于P123-PEI，比PEI25KDa略强或近似。体内转染试验表明，P123-PEI-R13在HepG2人肝癌移植模型与B16小鼠黑色素瘤移植模型转染情况类似，整体转染能力较P123-PEI与PEI25KDa强，同时也改善了复合物的体内分布，并且由于R13的修饰，使其在肿瘤组织转染效率显着提高，可知聚合物P123-PEI-R13在体内有较强的肿瘤靶向能力，但与其对二种肿瘤细胞的体外转染相比效率要低。本课题第四部分内容是P123-PEI-R13/DNA纳米复合物穿膜及胞内转运、释放机制的研究。本部分采用加入不同内吞途径抑制剂对转染效率是否产生影响的方法，考察复合物内吞途径；采用加入内涵体-溶酶体酸化抑制剂、细胞骨架和动力蛋白抑制剂对转染效率是否产生影响的方法，考察复合物细胞内转运机制；采用细胞因子及细胞内环境是否影响复合物稳定性的方法，考察复合物在细胞内的解离；采用荧光标记聚合物并结合激光共聚焦显微镜考察复合物在细胞内的实时定位。结果表明，P123-PEI-R13修饰R13后，使其细胞摄取表现出了不同特性，P123-PEI-R13/DNA复合物可通过网格蛋白介导的内吞、小窝蛋白介导的内吞及巨胞饮叁条途径内吞入胞，并可能有不依赖能量的非内吞途径存在。P123-PEI-R13/DNA复合物入胞后首先经内涵体-溶酶体系统酸化过程而从中逃逸，并以微管为轨道和方向，以动力蛋白为动力来源，在微丝作用下，并有中间纤维协助，向微管“-”端，即细胞核方向转运。RNA与P123-PEI-R13具有更强亲和性，P123-PEI-R13/DNA复合物在细胞核内被RNA解离，从而释放DNA。本课题通过Pluronic P123连接低分子量PEI制备高分子量PEI衍生物，并利用交联技术将双功能R13与该衍生物偶联，研制新型具有主动靶向αvβ3作用并且具有高转染效率、低毒性的阳离子聚合物/DNA纳米复合物，并探讨其细胞穿膜及胞内转运、释放机制，为解决目前基因给药方式存在的问题和实际应用打下基础，本课题研究内容有着一定的理论意义和实践应用价值。
陈钧[10]2005年在《聚乙烯亚胺-DNA疫苗递释系统的设计和呼吸道免疫效果评价》文中研究表明本论文研究内容包括两个部分，第一部分为聚乙烯亚胺-DNA疫苗递释系统的设计和呼吸道免疫效果评价；第二部分为苯甲酸利扎曲普坦鼻腔喷雾剂的研制及脑内递药特性研究。 第一部分 聚乙烯亚胺-DNA疫苗递释系统的设计和呼吸道免疫效果评价 21世纪的今天，人类依然面临着传染病的巨大威胁。呼吸道免疫能同时诱导系统和粘膜免疫应答，对有效控制和消灭传染病特别是呼吸系统感染具有十分重要的意义。DNA疫苗具有诱导体液免疫和细胞免疫的能力，而且制备简便，稳定性好，因此DNA疫苗经呼吸道免疫可望为呼吸道传染病的防治带来希望。但目前该方面的研究还处于初期阶段，其症结所在是缺乏高效低毒的DNA疫苗递释系统。病毒载体虽然高效，但其安全性存在极大隐患，而且载体的构建成本非常昂贵，目的基因容量小、靶向特异性差。所以研究开发高效、安全的非病毒载体是当今基因治疗的重要发展方向。但是，非病毒载体最大的缺陷是转染效率低，不能产生有意义的蛋白表达。本研究针对DNA进入细胞表达蛋白(抗原)的主要障碍，即胞外屏障和胞内屏障，设计了叁种新型的基于聚乙烯亚胺(PEI)的DNA疫苗非病毒载体，并以结核分支杆菌抗原Ag85B基因为目的基因，评价了叁种基因递释系统经鼻腔给药后的免疫效果。 第一章将结核分支杆菌抗原Ag85B基因克隆到真核表达质粒pcDNA3.0中，构建成重组pcDNA85b，为了提高该疫苗的免疫原性，在该质粒中插入组织纤维蛋白溶酶原激活因子(tPA)信号序列，由此构建成能在哺乳动物细胞中获得高效表达的结核杆菌DNA疫苗—pcDNA85btPA，并且通过酶解和测序鉴定了其构建的准确性。 第二章针对PEI／DNA复合物溶解性差的问题，将PEI进行不同程度的聚乙二醇(PEG)修饰(每个PEI分子接枝1、2、5、10和20个PEG)，以期增加复合物溶解度，减少相互聚集以及与体液中蛋白的相互作用。为了考察PEG化对PEI／DNA性质的影响，通过凝胶电泳阻滞分析和包封率测定，评价了PEG化的PEI与DNA的结合情况，采用MTT法评价复合物的细胞毒性。结果表明：PEI在PEG化后其与DNA的结合有不同程度的降低，但其复合物的毒性降低。体内外转染实验证明，PEI在PEG化后的转染效率随着PEG接枝率的增加而降低，但在比较低接枝率(即每个PEI分子接枝1个或2个PEG)的情况下，调整N／P值，仍能得到较为理想的体内外转染效率。体外转染结果表明PEI-PEG-1／DNA复合物在N／P为9时，PEI-PEG-2／DNA复合物在N／P为12时的转染效果与PEI／DNA复合物最佳转染效果相似，但在体内应用时前两者体现了一定优势，其转染效率分别是PEI／DNA复合物N／P为9时的2.35倍和2.29倍，存在极显着性差异(P＜0.01)，这是因为PEG的隐形作用使其在体内应用显示优势。 第叁章利用呼吸道细胞膜上存在凝集素，能特异地与糖基结合的特性，采用具有双功能基团的N-hydroxysuccinimide-PEG-Maleimide (NHS-PEG-MAL)，NHS一端专属性地与氨基半乳糖上的氨基结合，MAL一端专属性地与PEI分子多胺中的氨基结合。凝胶阻滞和包封率测定等实验证明PEI分子在修饰0.5％，1％，5％mol／mol糖基后，其与DNA的结合作用降低，但调整N／P值后其与DNA的结合仍较牢固；另外在PEI分子中引入了糖基和PEG的亲水链后，其细胞毒性大大降低。将Gala-PEG-PEI／DNA复合物分别转染16HBE14O细胞(细胞膜上有凝集素表达)和NIH 3T3细胞(细胞膜上无凝集素表达)，体外转染结果证明1％Gala-PEG-PEI／DNA在N／P为36时的转染效率是PEI／DNA在N／P为6时的3.1倍，而在没有凝集素的NIH 3T3细胞上，该复合物的转染效率却仅为PEI／DNA的0.06倍。可见，Gala-PEG-PEI／DNA复合物确实通过受体介导进入细胞，增加了转染效果。体内实验也充分显示了PEG化的优势，1％的Gala-PEG-PEI／DNA在N／P为24，36和48时的转染效率分别为PEI／DNA在N／P为9时的3.0、11.6和6.7倍。 第四章针对DNA载体系统不能有效进入细胞膜或进入膜后易在溶酶体环境下降解失活及不能有效进入细胞核的问题，以人体免疫缺陷病毒(HIV)的蛋白转导域Tat蛋白修饰PEI，该蛋白具有直接穿过细胞膜或者促进溶酶体破坏功能，此外Tat蛋白具有一段核定位序列(Nuclear Localization Sequence，NLS)，可以增加外源基因转运入细胞核，提高转染效果。本研究首先将Tat蛋白PEG化，即将Tat蛋白中的巯基与mPEG-MAL反应，使MAL一端专属性地与Tat蛋白中的巯基结合，该载体引入PEG的长链后能防止Tat蛋白与DNA形成复合物时相互聚集；然后将PEG化的Tat蛋白与DNA在一定质量比的条件下反应，通过正负电荷的相互吸引形成复合物，再将该复合物与带阳离子的PEG化的PEI结合，形成叁元复合物。包封率测定证明PEI在修饰Tat蛋白后其与DNA的结合作用没有降低。体内外转染实验表明，Tat蛋白修饰PEI后能够增加转染效率，PEI-PEG-1／PEG-Tat-1／DNA在N／P为9时的转染效率为PEI-PEG--1／DNA在N／P为9时的2.81倍；其体内转染效率为后者的2.01倍，存在显着性差异(P＜0.05)。但蛋白的修饰方法和修饰量应进一步优化，以期获得更高的表达。第五章对上述叁种修饰的PEI／pcDNA85btPA复合物的免疫效果进行初步评价。采用鼻腔给药途径免疫BALB／c小鼠，研究了四种基于PEI(其中一种为未修饰的PEI，其它叁种分别为采用上述叁种方法修饰的PEI在动物体内得到最高表达的载体)的非病毒载体递送pcDNA85btPA疫苗诱导的体液免疫(包括粘膜免疫)和细胞免疫情况，初步评价疫苗的免疫效果。结果显示叁种基因载体复合物均诱导较强的系统IgG、局部粘膜IgA，特异性淋巴细胞增殖和较强的IFN-γ水平，表明三种复合物均具有载DNA疫苗进入动物体内表达目的蛋白，同时诱导体液免疫(包括系统和局部)和细胞免疫应答的能力。Gala-PEG-PEI／pcDNA85btPA复合物、PEI-PEG-1／PEG-Tat／DNA复合物诱导的免疫应答水平均显着高于PEI／pcDNA85btPA复合物和PEI-PEG-1／pcDNA85btPA复合物，特别是PEI-PEG-1／PEG-Tat／DNA复合物诱导的粘膜免疫水平显着高于其他组，将有望在呼吸道感染性疾病的防治中起到一定作用。 第六章对几种修饰的PEI／DNA复合物经鼻腔给药后对小鼠肺部损伤性进行了初步考察。组织学观察表明，PEI／DNA组鼻腔给药后肺部出现了中等程度的炎症，而修饰的PEI／DNA组则只产生轻度的炎症，说明对PEI进行修饰能显着降低复合物对肺的损伤，具有良好的生理适应性。第二部分 苯甲酸利扎曲普坦鼻腔喷雾剂的研制及脑内递药特性研究 苯甲酸利扎曲普坦(Rizatriptan benzoate，以下将利扎曲普坦简称为RIZA)为新一代5-HT_(1B／1D)受体激动剂，用于成人有先兆或无先兆偏头痛的急性治疗。RIZA目前临床应用的给药途径为口服给药，但常规的片剂并非偏头痛治疗的最佳制剂，因为吞服片剂或喝水会加重偏头痛导致的恶心和呕吐；再次偏头痛所导致的胃肠道副反应(呕吐，胃肠道动力低下，胃排空延缓等)往往会影响药物的吸收，延缓药效。因此，研制一种有效、便捷的新剂型和给药方法具有较高的临床意义。 鼻腔给药是近年来研究较多的给药途径之一，不仅具有药物吸收迅速、无首过效应、给药方便、患者顺应性强等优点，而且还具有向脑内递药的特性。上述特点均有利于中枢启动型药物RIZA以鼻腔给药方式应用于临床偏头痛的治疗。本课题拟将RIZA制成鼻腔喷雾剂，评价其给药后的体内药物动力学及脑内递药特性，旨为RIZA临床应用提供有效便捷的新剂型。 第一章将RIZA制成鼻腔喷雾剂并建立了专属性强、灵敏度高的高效液相色谱检测方法，用于制剂的含量分析和有关物质检查；在鼻腔喷雾剂的质量可控性上，进行pH值、每喷主药含量和有关物质等项目的考察；此外，还进行了初步稳定性试验，为制剂有效期的确定提供参考。 第二章对RIZA鼻腔喷雾剂的安全性进行了考察。采用在体蟾蜍上颚模型考察了RIZA鼻腔喷雾剂对粘膜纤毛运动的影响；应用扫描电镜考察了RIZA鼻腔喷雾剂对大鼠鼻粘膜形态及纤毛数量的影响，从而综合评价制剂的鼻粘膜毒性。结果表明，RIZA鼻腔喷雾剂和基质均无明显的鼻纤毛毒性。 第叁章以市售RIZA片剂为参比，评价了RIZA鼻腔喷雾剂的人体生物利用度。首先创建了反相高效液相色谱—荧光检测法测定血浆中RIZA的浓度，并经方法学评价，各项分析方法的效能指标均符合生物样品的测定要求。测定了16位健康受试者鼻腔给予RIZA喷雾剂后的血浆RIZA浓度，并与片剂口服后的血浆RIZA浓度比较。结果表明，鼻腔喷雾剂与片剂生物等效，平均相对生物利用度为96.4％±15.7％，但鼻腔喷雾剂达峰时间明显短于口服给药，提示起效时间可能快于口服给药。 第四章建立了测定大鼠血浆和脑脊液中RIZA浓度的HPLC检测方法，经方法学考察，该分析方法符合生物样品分析要求，可用于大鼠给药后RIZA血浆和脑脊液中药动学研究。本研究选择静脉注射、鼻腔和口服给药途径，比较经不同途径给药后大鼠CSF及血浆中RIZA药动学行为的差异；以药物靶向指数为指标，评价RIZA经鼻腔给药后的脑内递药特性。结果表明，RIZA鼻腔给药后的药物靶向指数为静脉注射的1.45倍，表明RIZA鼻腔给药后有部分药物可直接通过嗅粘膜吸收转运入脑，具有一定的脑内递药特性。
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