氨肽酶PepN1在细胞外催化杀稻瘟菌素的成熟

论文摘要

【背景】肽核苷类抗生素杀稻瘟菌素（BlasticidinS,BS）生物合成途径的最后一步是亮氨酰杀稻瘟菌素（Leucylblasticidin S,LBS）水解成熟为BS,BS原始产生菌灰色产色链霉菌和异源表达菌株变铅青链霉菌WJ2清洗过的细胞均能催化这一步反应。前期我们确定在这两种菌中都含有编码3个氨肽酶Pep N同源蛋白的基因,其中编码产物Pep N1主要负责水解LBS和亮氨酰脱甲基杀稻瘟菌素（Leucyldemethylblasticidin S,LDBS）,且催化效率相当。但是,相比于原始产生菌只积累BS这一种组分,异源表达菌株变铅青链霉菌WJ2还积累了LBS和LDBS,这意味着原始产生菌与WJ2中Pep N1的水解活性存在差异。【目的】研究Pep N1在两个菌株中的表达和分泌对BS组分的影响。【方法】利用Pep N1的多克隆抗体,通过蛋白免疫印迹法（Western blot）比较不同生长时间的原始产生菌和异源表达菌株在细胞内、细胞培养液中Pep N1的表达水平。硫酸铵沉淀收集两种菌株培养液中的蛋白,通过Westernblot检测Pep N1的存在并在体外检测水解活性。【结果】原始产生菌第2-6天细胞内Pep N1水平基本没有变化,而异源表达菌株自第4天起细胞内Pep N1开始减弱,到第6天完全消失;另一方面,Western blot在原始产生菌细胞培养液中检测到Pep N1,而在异源表达菌株中却没有检测到。细胞培养液水解LDBS的活性与Western blot检测到的Pep N1表达水平相一致。【结论】BS原始产生菌能持续表达合成Pep N1并将一部分Pep N1分泌到细胞外,而异源表达菌株WJ2从第4天起则停止合成Pep N1,第2-6天的细胞均不能将Pep N1分泌到细胞外,这导致WJ2中积累亮氨酰化的产物。两个菌株清洗过的细胞均可以水解LDBS和LBS,推测在WJ2体内消失的Pep N1分泌到细胞壁上但没有释放到溶液中,这部分Pep N1可以在WJ2中将部分LDBS和LBS水解成对应的DBS和BS。

论文目录

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株

1.1.2 培养基[10]

1.1.3 主要试剂和仪器

1.2 实验方法

1.2.1 生物信息学分析

1.2.2 PepN1多克隆抗体的制备

1.2.3 菌体的收集与链霉菌细胞抽提物（Cell free extracts, CFE）的制备

1.2.4 蛋白质印迹法（Western blot）

1.2.5 蛋白表达与大肠杆菌细胞抽提物（CFE）的制备

1.2.6 硫酸铵沉淀收集细胞培养液蛋白质

1.2.7 HPLC检测细胞培养液LDBS水解活性

2 结果与分析

2.1 PepN1是主要负责BS成熟的水解酶

2.2 PepN1多克隆抗体的特异性

2.3 BS原始产生菌和异源表达菌株细胞内PepN1表达水平

2.4 Western blot分析细胞培养液中是否含有PepN1

2.5 HPLC检测细胞培养液水解活性

3 讨论与结论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 贺惠,禹贵阳,王先坤,邓子新,贺新义

关键词: 杀稻瘟菌素,灰色产色链霉菌,变铅青链霉菌,氨肽酶,蛋白分泌系统

来源: 微生物学通报 2019年02期

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑,农业科技

专业: 有机化工,植物保护

单位: 上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室

基金: 国家自然科学基金(31470195)~~

分类号: TQ455

DOI: 10.13344/j.microbiol.china.180774

页码: 223-232

总页数: 10

文件大小: 1433K

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氨肽酶PepN1在细胞外催化杀稻瘟菌素的成熟

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