赵桂华[1]2007年在《自体干细胞移植治疗心肌梗死后的心力衰竭:研究与现状》文中指出学术背景:心肌梗死后的心肌组织不能再生,留下坏死区,最终发展为心力衰竭,而现有的内外科治疗都不能解决心肌细胞丧失的问题。利用自体细胞移植在体外培养出大量可以转化为心肌细胞的干细胞,再直接移植给心脏病患者,改善其心功能,具有广阔的应用前景。目的:介绍自体干细胞移植治疗继发于心肌梗死的心力衰竭的研究现状,并展望其前景。检索策略:由作者应用计算机检索中国期刊全文数据库2001/2007与自体干细胞移植治疗心肌梗死相关文章,检索词为"干细胞;移植;心肌梗死;心力衰竭",限定文章语言种类为中文;同时检索Medline数据库2000/2007相关文章,检索词为"stemcells;celltransplantation;acutemyocardialischemia;heartfailure",限定文章语言种类为"English"。纳入标准:内容与自体骨骼肌卫星细胞、骨髓干细胞、心肌细胞移植治疗心肌梗死后心力衰竭相关。排除标准:陈旧和重复性文献。文献评价:①文献来源有RCT,循证医学系统综述、汇总分析、个例报道、经验交流。②共检索到214篇关于各种来源的自体干细胞移植治疗心肌梗死的文章,最终纳入31篇符合标准的文献进行综述。资料综合:已有许多临床前试验表明干细胞移植可以通过修复和再生受损心肌,增强血管新生等作用,缩小心肌梗死面积,改善心功能。研究较多的有自体骨骼肌卫星细胞移植、自体骨髓干细胞移植、自体心肌细胞移植,还有应用脐静脉血的自体胚胎干细胞移植、自体成纤维细胞和平滑肌细胞移植等。但自体干细胞移植治疗终末期心血管疾病还存在移植细胞类型、移植时机、移植途径及移植剂量选择等许多问题有待解决。结论:自体干细胞治疗终末期心血管疾病研究刚刚开始,还面临着许多问题和争议,小样本临床研究的早期疗效肯定,但缺乏长期随访结果,还有待于大规模临床实验的验证。
马翔[2]2007年在《自体骨髓干细胞移植治疗心肌梗死疗效评估及活体示踪研究》文中研究说明目的:有关骨髓间充质干细胞(MSC)移植至急性心肌梗死(AMI)组织后的转归及作用机制仍不明确。本包括研究:1)建立猪AMI模型,行心肌直接注射移植自体MSC,观察心功能变化并探讨相关机制;2)探讨应用超强顺磁性铁氧化物(SPIO)标记MSC的条件及方法;3)探讨应用MRI活体示踪SPIO标记的干细胞心肌移植的可行性及有效性;4)探讨经冠状动脉内注射骨髓单个核细胞治疗急性前壁心肌梗死(AMI)的中期临床疗效及安全性。方法:1)本课题第一部分选择10只家猪,体重35～45kg,经导管应用球囊持续封堵前降支动脉血管,建立急性心肌梗死动物模型。将成功建立模型的9只动物随机分为2组:实验组5只动物取骨髓血,分离MSC,体外培养扩增,建立模型2周后通过心肌注射的方法将自体骨髓MSC(1.25×10~6～7.54×10~6)移植至AMI区及交界区;对照组动物注射等量生理盐水。移植后行经胸超声检查观察心脏局部与整体心功能变化;心肌核素灌注显像检查评估左心室心肌缺血节段的改善;HE染色观察心肌组织坏死及修复变化;Van-Gieson染色观察心肌梗死后纤维组织增生情况;免疫组化检测心脏结蛋白(Desmin)、心脏连接蛋白(Connexin-43)和心肌早期转录蛋白(GATA-4)的表达;2)本课题第二部分选择8只家猪,体重35～45kg,经导管应用球囊封堵前降支动脉建立心肌梗死模型。成功建立模型的7只动物随机分为2组:SPIO标记的MSC移植组(n=4),未行SPIO标记的对照组(n=3)。使用Feridex I.V溶液、FeridexI.V.-脂质体混合物及Feridex I.V.-聚赖氨酸混合物分别标记MSC,按25μg SPIO加入1ml的DMEM培养24h,使细胞终浓度为(5～9)×10~6/ml,显微镜下观察细胞形态,台盼蓝染色测定细胞活力,普鲁士蓝染色观察SPIO与细胞的结合。以流式细胞仪检测CD44、CD106在原代、第4代、第6代的MSC的表达。建立模型2周后开胸,在梗死区中央及梗死边缘区共5个点注射移植注射细胞(3.6×10~6～9.4×10~6)。于移植前、移植后1h、2周及4周,使用1.5T核磁影像机行心脏MRI检查,观察梗死区中央及梗死边缘区的细胞移植区有无低信号改变。移植后4周,处死实验动物,取心脏组织行HE染色观察心肌组织坏死及修复;普鲁士蓝染色观察移植区有无SPIO标记的MSC的表达;心肌组织荧光免疫组化检测心脏结蛋白、心脏连接蛋白和心肌早期转录蛋白的表达;行扫描电镜及投射电镜观察SPIO在MSCs表面和细胞内的表达;3)课题第叁部分选择8例急性前壁心肌梗死患者,在接受标准药物治疗和介入治疗基础上,经皮冠状动脉内介入治疗后应用Over-the-Wire(OTW)球囊将自体骨髓单个核细胞注入冠状动脉前降支血管,定位以PCI时植入的支架为参考依据。移植前及移植后行经胸心脏超声心动图,测定左心室收缩功能及整体左心室射血分数;行~(99m)Tc-MIBI心肌核素灌注及代谢显像,计算存活及坏死心肌的面积。术后所有患者均进入监护病房持续监护24小时,临床随访时间至少6个月,随访观察心血管事件及不良事件的发生。结果:1)在建立心肌梗死模型中,1只动物发生顽固性室颤死亡,9只动物成功建立心肌梗死模型并成功移植BMCS,建立模型成功率为90%。建立心肌梗死后9例动物行心肌核素显像示左室心尖部及近室间隔部灌注缺损。MSCs移植后4周,核素心肌显像提示对照组仍显示前壁、心尖部灌注缺损,与生理盐水注射前无变化;而心肌注射骨髓干细胞4周后,核素心肌显像提示前壁、心尖部灌注缺损比注射前明显减少。与干细胞移植前相比,实验组室间隔及心室前壁变薄不明显,左室梗死区室壁厚度(IWT)为(4.6±0.3 VS 4.2±0.2,t=2.769,P＜0.05),室壁运动趋于正常(8.0±0.3 VS 7.4±0.4,t=2.982,P＜0.05),LVEF增高(66.4±6.1 VS 60.0±3.8,t=1.988,P＜0.05)。对照组移植后与移植前比较,IWMVs减小,心肌梗死局部室壁变薄,EF减低。移植后实验组IWMVs高于对照组(8.0±0.3 VS 6.9±0.2,t=6.315,P＜0.05),IWT较对照组增加(4.6±0.3 VS 3.9±0.2,t=4.919,P＜0.05),EF改善(66.4±6.1 VS 54.0±1.4,t=3.926,P＜0.05)。由此可见骨髓间充质干细胞移植可以改善梗死心脏的局部与整体心功能。免疫组化检查结果提示在移植区域可见心肌结蛋白、Connexin蛋白和GATA-4表达的阳性细胞,提示MSC植入心肌后可以长期存活并分化成为具有心肌细胞功能的细胞;病理检查发现移植区内有核大胞浆小的移植细胞,提示注射至心肌梗死区的MSC处于分化阶段;2)在建立心肌梗死模型后,MRI检查显示7只动物前壁及心尖部均有灌注缺损区,延迟显像强化,提示心肌梗死模型成功建立。经过24h体外标记,各标记组均可见SPIO与骨髓间充质干细胞结合。叁个标记组中SPIO 24小时标记效率均高于90%,SPIO-PLL混合溶液标记MSC的有效率最高,达(95.5±8.2)%。SPIO.-PLL混合溶液标记的细胞存活率(94.7±3.2)%优于SPIO-LFA组(87.5±4.0)%,(P＜0.05)及SPIO组(86.6±6.1)%(P＜0.05)。SPIO-PLL混合溶液标记的MSC的存活率在标记前是(95.7±3.6)%,标记后为(94.7±3.2)%,P＞0.05,二者差异无统计学意义。经含铁血黄素染色后,叁个标记组中与SPIO颗粒结合的细胞胞核染成红色,胞浆中可见大小不一的蓝绿色颗粒。扫描电镜检测发现SPIO标记的骨髓MSCs表面有均匀分布的颗粒状物质,投射电镜发现SPIO标记组细胞浆内大量黑色含铁小体,细胞表面可见小针样铁颗粒。采用猪全骨髓细胞贴壁分离法筛选MSC,在培养4代后CD44,CD106的表达均为阳性,表明可以获得纯化的MSC群体。开胸心肌移植后1h,SPIO标记的干细胞移植组中4只动物(100%)MSC移植区在磁共振上呈明显的低信号改变,移植后2周4只动物(100%)MRI呈明显的低信号改变,术后4周示3只动物(75%)细胞移植区有低信号改变。大体标本可见心尖部梗死区室壁明显变薄,SPIO标记组移植部位可见暗褐色移植物。普鲁士蓝染色检查发现在移植后4周与SPIO注射部位对应的组织染色阳性,提示SPIO标记的MSC移植入心肌4周后仍在心肌组织内存活;心肌组织荧光免疫组化检测心脏结蛋白、心脏连接蛋白和心肌早期转录蛋白均有表达,提示移植的MSC在心肌移植区内分化为具有心肌功能的细胞;3)8例前壁急性心肌梗死患者骨髓单个核细胞冠脉内移植均成功,术中、术后无严重并发症。所有患者在骨髓单个核细胞移植过程中及移植术后均无不适主诉,血压,心率均无明显变化。移植后患者LVEF 1个月时为(48.1±10.0)%,与术前相比未见明显变化(43.7±5.8)%,P＞0.05;3个月时为52.6±10.0,(P＞0.05),移植后12月为(56.2±9.5)%,与术前相比有改善,但是无统计学差异(P＞0.05)。SPECT心脏显像结果表明骨髓单个核细胞移植后缺血心肌节段及梗死心肌节段数明显减少。至最后一次随访时,患者缺血心肌改善1个节段以上7例(87.5%),无改善1例(12.5%),缺血增0例(0%)。患者术后6个月6分钟步行实验结果为(412.3±73.8)m,较移植术前明显改善(379.4±80.6),P＜0.05。8例患者随访2～23个月均无心悸感觉,心电图及24h动态心电图未发现恶性心律失常,无一例发生死亡、再次心肌梗死、心衰加重再次就诊等心血管事件。无一例患者发生新发肿瘤、支架内再狭窄、支架内血栓等不良事件。结论:1)通过球囊封堵冠状动脉血管建立猪急性心肌梗死模型,建模效率高,建模中应用缺血预处理及药物减少心律失常的发生,为MSCs移植治疗研究提供了良好的实验模型;2)通过心肌直接注射移植家猪自体骨髓MSC,在移植区可见检测心肌细胞结蛋白、Connexin蛋白和GATA-4的表达阳性细胞,提示MSC植入心肌梗死区后可以存活并分化为具有新生心肌功能的细胞;3)MSCs心肌注射移植可以改善心肌梗死后心脏局部与整体心功能,增加梗死区室壁厚度,改善梗死部位室壁运动;4)SPIO标记的干细胞在MRI上呈低信号改变,在心肌移植后4周仍可以被MRI检出,提示应用MRI技术活体示踪动态观察移植的MSC是可行有效的;5)应用SPIO、SPIO-脂质体、SPIO-多聚赖氨酸等经过24h体外标记MSCs,均可以与骨髓间充质干细胞有效结合,标记率均大于90%,细胞活力及形态未受影响,表明SPIO是一种安全、高效的细胞标记物;6)中期随访提示骨髓单个核细胞移植可以抑制急性前壁心肌梗死后左室腔的扩大,提高左室射血分数,改善心肌梗死后左心室心肌缺血,并发症少、安全性好。
黎健[3]2005年在《干细胞移植治疗心肌梗死》文中研究指明近年来 ,干细胞包括骨骼肌成肌细胞、胚胎干细胞和骨髓干细胞已被应用于心肌再生。心肌梗死动物模型的实验研究表明 ,干细胞移植改善了梗死心肌的功能 ,但其作用机制尚不十分清楚。本文对干细胞移植治疗心肌梗死研究中取得的成就、目前的研究焦点和有待解决的问题以及临床应用的潜力做一个总的评述
刘维新[4]2004年在《治疗心肌梗死候选细胞心肌分化潜能与候选基因逆转录病毒载体的构建与鉴定》文中认为细胞移植作为一项极具开创性意义的技术和方法，为临床治疗心肌梗死带来了新的希望。近年来，有学者发现，骨髓基质细胞(marrow stromal cells，MSCs)具有可通过常规的骨髓穿刺而简单获取、强大的自我更新能力以及用胞嘧啶类化学物质5-氮胞苷诱导后或在心肌环境中可向心肌细胞分化的潜能。因此，MSCs被认为是细胞移植治疗心肌梗死最有前途的自体细胞来源之一。然而，MSCs向心肌细胞分化的潜能及具体机制尚不清楚；值得注意的是，目前已有越来越多的学者对成体干细胞是否具有广泛的分化潜能提出质疑。为深入研究和了解MSCs向心肌细胞分化的潜能及其临床应用价值，探索临床以细胞移植和基因工程治疗心肌梗死的新思路和新方法，本课题从下述几个方面进行研究： 1．Wistar大鼠MSCs体外培养的形态学和增殖动力学研究 为研究和观察MSCs体外培养时的形态学变化和增殖动力学特征，本部分实验采用Wistar大鼠作为实验动物，用离心法分离全骨髓，经原代培养24h后，用Hank's平衡盐溶液(Hank's balanced salt solution，HBSS)轻轻冲洗3次以去掉非贴壁的造血干细胞，可见贴壁的MSCs呈尖梭形散在分布。第3～4d后，MSCs呈集落样迅速增殖；6d后，不同大小的细胞集落明显增多(8～12个／60-mm皿)；第12d时，集落间彼此接触以致每个集落中央的细胞长至数层时，细胞几乎停止生长，但此时整个皿底并未被细胞铺满。传代的MSCs体积增大，形态上也表现出异样性，基本上可以分成两种类型：小的尖梭形或叁角形及大的扁平形。前者随着不断的传代具有转变成后者的倾向；而且一旦转变成后者，增殖能力明显下降。第1代末时约15％～18％的细胞呈大的扁平型，而至第4代末时此类细胞超过57％。 当细胞以2845 cells/cm~2的密度接种时，在30d的传代培养过程中，细胞倍增数可达21.95。随着传代的进行，细胞增殖能力明显降低。原代培养的MSCs前3～4d保持在静止期，而后迅速增殖，至第10d时平均细胞数可达(15.37±0.10)×10~4个。10d后若不进行传代，细胞几乎停止增殖。第1代和第2代细胞的生长曲线与原代相似，静止期明显缩短，细胞数量在短期内增加更为明显(第1代约为4一7d:第2代约为4一6d):第3代的细胞增殖速度明显减慢，至第4代时细胞基本上停止增殖。 本部分实验结果表明，体外培养的MSCs其增殖能力有限，易于趋向衰老;其心肌细胞分化潜能、作为细胞移植的靶细胞及以其为载体的基因治疗的临床应用价值尚待进一步研究。2.体外胞啥健类化学物质5一氮胞昔诱导MSCs向心肌细胞分化的 研究 为验证体外胞喀睫类化学物质5一氮胞昔能否诱导MSCs向心肌细胞分化，本实验用不同浓度(3、5、10件mol几)的5一氮胞昔以不同的方式(一次处理与反复处理)诱导MSCS，通过对形态学的观察并采用免疫组织化学、从尾stem blot及心室肌特异性肌球蛋白轻链(ventrieular myosin light ehainZ，MLCZv)启动子控制下的蓝绿色荧光蛋白(enhaneed eyan variant ofAe口uorea巧etoria green fluoreseent Protein，ECFp)报道基因表达技术进行检测，以验证和分析5一氮胞昔诱导MSCs向心肌细胞分化的可行性。 实验结果显示，5一氮胞昔处理24h后，部分MSCs出现状态不佳甚至死亡的现象，而且随着药物浓度的提高，这种现象更加明显;各5一氮胞昔处理组的MSCs在整个3Od的观察过程中，既没有见到自发搏动的细胞，也没有见到肌管形成。当MSCs生长至融合时，可见“细条样”和/或“肌管样”结构形成，但这种结构即使在非5一氮胞营处理组，当细胞生长至融合时，同样可以出现。 免疫荧光检测表明，作为阳性对照的心肌细胞在荧光显微镜下可见明显的心肌特异性肌节肌球蛋白重链(myosin heavy ehain，MHC)及肌钙蛋白(troponinl，Tnl)的表达，在高倍镜下其横纹结构明显可见;然而这两种心肌特异性蛋白在所有5一氮胞普处理组的MSCs均未检测到表达，而且那些“细条样”和/或“肌管样”结构也不表达这两种蛋白。W七stem Blot检测结果提示，各5一氮胞普处理组MSCs经SDS一队GE后的免疫印迹结果没有发现心肌特异性MHC、Tnl蛋白阳性表达，而在作为阳性对照的心肌细胞蛋白的位置经免疫印迹显色后可见二者明显的条带。ECFP报道基因检测结果提示，经转染pMLCZv尼CFP的正常心肌细胞，48h后在荧光显微镜下(激发波长400士20nln)观察到了明亮的蓝绿色荧光;但在30d内，各5一氮胞昔处理组均未见呈蓝绿色荧光的MSCs出现。 本部分实验结果表明，先前学者们所报道的5一氮胞昔能够诱导MSCs向心肌细胞分化的作用并不具有可靠的重复性。尽管本实验不能排除长期反复用5一氮胞营处理可能导致极少数MSCs向心肌细胞分化，并通过筛选获得心肌生肌细胞株(eardiomyogenie eell line，CMG eell line)，但不宜简单地夸大5一氮胞昔对MSCs向心肌细胞分化的诱导作用。3.体外气心肌样”环境对MSCs向心肌细胞分化的诱导作用 为研究体外“心肌样”环境对MSCs向心肌细胞分化的诱导作用，本实验采用荧光染料如一二乙酞基一2一苯基叫噪(4，6一diamidino一2一phenyli耐ole，nAPI)预先标记MSCs，并将其与新生大鼠心肌细胞进行共
陈光涛, 章岚, 任文君[5]2015年在《干细胞诱导心肌细胞增殖与运动促进心肌细胞再生的研究进展》文中研究指明背景:干细胞移植治疗心血管疾病表现出传统方法无可比拟的优越性,但干细胞向心肌细胞自发分化的效率非常低,而且影响干细胞分化的因素很多。目的:阐明不同来源干细胞治疗心肌梗死的优缺点,探讨提高心肌细胞分化效率的方法,最佳诱导分化条件及运动促进干细胞动员、诱导内源性心肌细胞再生的机制。方法:由第一作者检索1985至2015年Pub Med数据库和中国知网收录的与干细胞治疗心肌梗死、干细胞向心肌细胞分化运动影响干细胞增殖及心肌细胞再生的相关文献。英文检索词为"stem cells,myocardial infarction,myocardial regeneration,cardiac cell,exercise",中文检索词为"干细胞,心肌梗死,心肌再生,心肌细胞,运动",共纳入54篇文章进行综述。结果与结论:为了提高心肌细胞分化率,近年来多种化学诱导剂和生物成分先后应用于干细胞向心肌细胞分化的研究,模拟心肌微环境和血管细胞生长因子的作用也是诱导心肌细胞分化的主要方法。通过有氧运动促进干细胞动员来诱导缺血心脏血管新生和上调各种血管生长因子表达,可促进心肌细胞增殖和修复。有关干细胞的获取、移植排斥反应、向心肌细胞定向分化的调控机制还需进行深入探讨。
郑德华[6]2004年在《经冠状动脉移植同基因骨髓单个核细胞治疗心肌梗死的实验研究》文中认为心肌梗死(myocardial infarction，MI)是影响人类生活质量的一类重要疾病。近年来，随着人们生活水平的提高和人口老龄化，其发病率明显升高。急性心肌梗死后，由于局部心肌组织缺血、缺氧，心肌细胞大量坏死，纤维组织增生，疤痕组织形成，心室重塑(ventricular remodeling，VR)，心功能下降，晚期常出现难治性心力衰竭(refractory heart failure)。目前的治疗主要针对挽救濒死心肌细胞，增强存活心肌细胞的功能；阻断神经内分泌系统，阻断心室重塑。由于心肌细胞不能再生，心肌疤痕组织不能修复为新的心肌组织，但通过细胞移植可以增加梗死区心肌细胞数量，从而为心肌梗死的治疗提供新的策略。近十年来，国内外学者做了大量细胞心肌成形术(cellular cardiomyoplasty，CCM)方面的工作，胚胎干细胞(embryonic stem cells)、胚胎心肌细胞(fetal cardiomyocytes)、骨骼肌成肌细胞(skeletal myoblasts)及自体心肌细胞(autologous cardiomyocytes)的心肌内移植研究取得了很大进展。由于供体细胞来源、异体细胞移植引起的免疫排斥反应及移植细胞与宿主心肌细胞的连接等问题，目前还不能确定进行细胞移植的最佳细胞类型。骨髓单个细胞(Bone Marrow Mononuclear Cells，BMMNCs)中含有大量多能干细胞，国外学者发现经体外诱导后骨髓干细胞可分化为肌源性细胞(myogenic cells)或心肌细胞。本研究观察同基因骨髓单个核细胞经冠状动脉植入心脏后的存活、分布及分化状况，为自体骨髓单个核细胞移植进行心肌再生的临床应用提供实验依据。 军医进修学院硕十学位论文 方法:1.密度梯度离心法分离、纯化LewiS大鼠骨髓单个核细胞，并以PKH26红色荧光染料作为示踪剂进行标记;用光学显微镜、荧光显微镜、流式细胞仪检测骨髓单个核细胞PKH26红色荧光标记效果。2.在同系LewiS大鼠颈部异位心脏移植模型基础上，以液氮冷冻法制备了急性心肌梗死模型;观察移植心脏的搏动情况，术后1天组织病理学检查建模效果。3.心肌梗死后2天，经移植心冠状动脉移植PKH26标记的同基因骨髓单个核细胞;细胞移植后7天，采集标本，检测植入细胞存活、分布及分化状况。 结果:1.经分离纯化后骨髓单个核细胞数量为2.1 xl护，骨髓单个核细胞的细胞膜被标记红色荧光，标记阳性率为84.99%，台盼蓝拒染率95%，表明PKH26标记细胞效果良好，细胞活性良好。2.供体心脏冷冻区形成边界清楚的白色圆盘形硬斑，血流开放后冷冻区运动功能障碍，梗死心复跳率94%，受体存活率76%;移植心脏病理切片苏木素一伊红染色显示梗死区心肌细胞变性坏死，炎症细胞浸润明显，与正常心肌组织界线较为清楚。3.细胞移植后7天，采集标本检测，PKH26红色荧光阳性细胞主要集中于移植心脏的冷冻梗死区，脾脏、骨髓也可见少量阳性细胞分布，非梗死区及其余脏器组织切片均未见红色荧光阳性细胞;梗死区内标记细胞大部分表达CD34;梗死区内connexin43的表达明显高于对照组。 结论:供体同基因骨髓单个核细胞经冠状动脉植入后，能够在受体移植心脏梗死区存活、分化、使梗死区出现心肌再生;心肌损伤后，可能激活了细胞因子级联，从而产生大量趋化因子或韶附分子使移植的骨髓单个核细胞定向迁移至梗死区。
陈绍良[7]2006年在《经冠状动脉骨髓间充质干细胞心肌内移植治疗急性心肌梗死的实验及临床研究》文中认为目的:已有的研究证实骨髓干细胞心肌内移植可以显着改善梗死后心肌的功能,但是尚未见有关骨髓间充质干细胞治疗急性心肌梗死的临床研究。为此我们设计本前瞻性研究,以期系列观察研究经冠状动脉内注射骨髓间充质干细胞(BMSC)治疗急性心肌梗死(AMI)的疗效,并比较放射性心肌核素显像、经胸超声心动图和心脏电机械标测测定存活心肌的特异性及敏感性。方法:(一)实验研究:选用雄性家猪(购自于江苏省农科院畜牧研究院),体重介于20—30 kg。以球囊封堵左冠状动脉前降支制作心肌梗死模型,观察24 h后,存活者按心肌梗死造模次序随机分为治疗组和对照组。氯氨酮(25 mg/kg, IM)麻醉后,在无菌条件下,用含肝素6000u的注射器抽取髂骨骨髓30 ml。用Ficoll-Paque (1.077 g/ml)分离液分离出单个核细胞,1500 rpm离心10 min,洗两次,将离心后的细胞打散并以1×107个/ml细胞接种在75cm2的培养瓶内。1天后去掉悬浮细胞,每3天换液,7-10天后当细胞近融合时,0.125%的胰酶消化,1000rpm离心5min,生理盐水洗2次,取1×107拟行注射的细胞,100目滤网过滤,重悬于含肝素2000u的5ml生理盐水备用。标记方法应用嘧啶的类似物溴化脱氧尿嘧啶(BrdU,Sigma公司)或荧光PKH26(Sigma公司),注射前2天,在培养液中加入10μmol/L的BrdU;部分猪,在注射前,给其MSC进行PKH26荧光染色。用间接免疫荧光法检细胞的表型。在心梗前、注入MSC前、处死前叁个时间点,插入猪尾巴导管,连接压力换能器,记录左室收缩压(LVSP,left ventricular systolic pressure)、左室舒张末压(LVEDP,left end-diastolic pressure)、压力升高最大速率(+dP/dt,peak rate of pressure rise)和压力下降最大速率(-dP/dt ,peak rate of pressure fall ),每次记录前需稳定15 min。在处死前,麻醉后送入核素室,静脉注射99Tcm-MIBI显像,行心电检测,行心肌核素显像检查,检测梗塞相对面积、心肌灌注评分以及左室射血分数(LVEF)。
徐清斌[8]2004年在《自体干细胞移植治疗冠心病的研究》文中提出第一部分 自体骨骼肌卫星细胞移植治疗心肌梗死的研究 第一节 骨骼肌卫星细胞的分离、培养及鉴定 目的：探讨骨骼肌卫星细胞的分离、培养及鉴定方法。方法：无菌条件下从幼猪叁角肌群处切取骨骼肌标本5—10g，采用胶原酶和透明质酸酶消化的方法获取骨骼肌卫星细胞，进行体外培养、扩增，并观察所培养细胞的形态；降低培养液中胎牛血清浓度，观察肌管形成；免疫组化的方法检测Desmin的表达；RT—PCR法检测细胞肝细胞生长因子受体c-met的表达。结果：卫星细胞在体外生长、增殖良好，刚分离出的卫星细胞呈球形，折光性强，12小时后开始贴壁，仍为圆形，48小时后贴壁完全，细胞呈梭形，生长缓慢。随时间延长，细胞增殖、迁移逐渐有规律地平行排列。降低细胞培养液中胎牛血清浓度至2％，卫星细胞可融合成肌管，免疫组化显示培养的细胞Desmin阳性，这些细胞表达c-met。结论：酶消化法是一种适合的卫星细胞的培养方法。 第二节 自体骨骼肌卫星细胞移植修复心肌梗死后心肌损伤的实验研究 目的：研究骨骼肌卫星细胞植入梗死区组织后的转归及其对心肌损伤的修复作用。方法：幼猪10只，对照组和治疗组各5只，治疗组从幼猪叁角肌群处切取骨骼肌标本，获取卫星细胞，体外培养、扩增，
邵素霞[9]2004年在《大鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养及其移植治疗心梗实验研究》文中研究表明成体心肌细胞是终末分化的细胞，一旦损伤只能由无收缩能力的纤维组织所代替，目前对心肌梗塞的一些治疗手段如冠状动脉旁路移植术，虽然能恢复心脏血管的再灌注，但却不能逆转已坏死的心肌,所以往往随该类收缩细胞的缺失而导致急性心衰造成死亡。所谓心脏器官中的细胞移植，实质上即把健康的有关细胞移植到病损的心脏中，当前这项研究已逐渐被认为是增强心脏功能及限制心梗扩大的重要途径。目前有关细胞移植治疗心梗的研究主要集中在3个方面：（1）胎儿心肌细胞移植。（2）胚胎干细胞来源的心肌细胞移植。（3）骨骼肌卫星细胞移植。研究表明叁种方法都有一定的疗效，但胎儿心肌细胞及胚胎干细胞很难得到，在培养时扩增的能力也有限，移植时有免疫排斥反应，同时还面临道义及政治上的谴责，所以很难在临床上应用。学者们现在把注意力集中到与心肌具有同源性而且结构和功能具有一定类似性的骨骼肌方面，而且更值得关注的是，与骨骼肌相伴的肌卫星细胞，在骨骼肌再生中所起的作用及其自我更新能力，使研究者们认为这一细胞或许是可用于治疗心梗，改善心脏功能的潜能性细胞。众所周知，骨骼肌卫星细胞是成体骨骼肌中位于肌细胞膜和基膜之间具有增殖分化潜能的肌源性干细胞,平时处于未分化状态，当骨骼肌受损时能被激活进入细胞周期，然后与受损的肌纤维融合，恢复骨骼肌的连续性及功能。应用骨骼肌卫星细胞作为供体细胞有很多理想的特性，如在体外未分化状态有增殖能力，在缺血组织内仍然能够成活，用自体卫星细胞移植，无免疫排斥反应。卫星细胞细胞移植首先应用于肌营养不良萎缩症，后来科学家又将卫星细胞移植用于治疗心梗，并发现卫星细胞移植到心梗心肌后能够成活，心脏功能有了明显改善。由于此项技术在临床上有广泛的应用前景，引起了许多科学家的关注。目前此项研究虽然取得了一些成果，但还存在很多急待解决的问题，如（1）测定移植细胞的成活率，找到提高移植细胞成活率的方法；（2）心梗面积多大时进行细胞移植会更有效；（3）发明一种长期标记移植细胞的可靠技术，用此技术搞清<WP=5>被成功移植细胞的分化状态；（4）确定最佳的移植细胞数量及移植时间，完善细胞移植方法，使临床应用方便，病人痛苦少。基于以上问题本课题拟分离纯化新生大鼠骨骼肌卫星细胞，观察其生物学特性，用不同方法标记细胞，探讨标记物毒性及标记率。为了使肌卫星细胞在体外快速增殖，用多种生长因子作用于肌卫星细胞，将胶体金标记的细胞移植到正常心肌组织，观察其生长状态，探讨胶体金标记方法在体内标记的可行性，以及将胶体金标记的卫星细胞移植到SD大鼠冷冻心梗模型中的心梗区中央部位，观察移植细胞的生长分化情况，探讨其在治疗心梗中的作用。本实验共分四个部分。方法与结果1. 新生大鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养及标记方法取生后3日龄新生SD大鼠四肢骨骼肌，经胶原酶、透明质酸酶及链酶蛋白酶消化，用等密度沉降离心法分离出骨骼肌卫星细胞，观察其生长规律，检测分裂指数及生长曲线。用胶体金、DAPI及BrdU标记液分别标记细胞8h、24h、48h，测标记后细胞的生长曲线及标记率。结果表明分离所得肌卫星细胞纯度95%以上，梭形，第3-5天增殖旺盛，5代以内生长较快,一般在培养第5天细胞排列出现方向性，并开始融合成肌管。研究发现叁种标记方法对肌卫星细胞有不同程度毒性。胶体金标记法毒性最小，标记率100%，DAPI标记细胞率为100%，BrdU毒性最大且标记率仅为10%。研究者认为本实验方法简单、快速，所得肌卫星细胞纯度高，性能好。胶体金标记法适合于电镜研究，DAPI标记法适合于光镜研究，BrdU标记法较差。2. EGF、bFGF和PHGF对大鼠骨骼肌卫星细胞增殖的影响 取第四代新生大鼠骨骼肌卫星细胞，用MTT法、流式细胞技术检测细胞周期方法、溴脱氧核甘尿嘧啶(bromodeoxyuridine,BrdU)掺入法及免疫细胞化学检测增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen ，PCNA）的方法探讨了表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）及促肝细胞生长因子（hepatocyte growth-promoting factor ，PHGF）对大鼠骨骼肌卫星细胞增殖的影响。结果表明bFGF、PHGF对骨骼肌卫星细胞有较强的促增殖作用，且两者之间无差别，bFGF最佳作用浓度为5μg /L ，PHGF最佳作用浓度为10μg /ml 。本实验证实国产牛bFGF对卫星细胞的增殖作用明<WP=6>显不如进口人bFGF，这可能与药物质量或种属因素有关，在选择作用因子时应予以考虑。与其他生长因子相比，PHGF价格低廉易于获取，适宜推广。EGF增殖作用不明显。3. 骨骼肌卫星细胞移植到大鼠体内生长发育的初步研究 将胶体金标记的骨骼肌卫星细胞移植到正常大鼠心肌中，用免疫组化、共聚焦免疫荧光双标染色方法及电镜多种方法探讨胶体金标记方法的可行性，卫星细胞的生长分化情况，为卫星细胞移植治疗心梗研究提供参考资料。结果表明将胶体金标记16小时的卫星细胞移植后，移植细胞可以在宿主心肌中生长并在肉眼下可见移植部位颜色变黑，能够使我们快速找到移植位点，减少了取材的盲目性。移植?
李博[10]2013年在《XIAP修饰的脂肪间充质干细胞在心肌梗死治疗中的作用》文中研究说明目的脂肪干细胞是心血管疾病干细胞治疗的重要种子细胞来源,特别是针对心肌梗死的治疗。然而脂肪组织来源的干细胞能否有效地恢复心功能,以及对心功能恢复的程度尚未得出统一结论。已有研究表明,脂肪干细胞对心梗的治疗作用受限于心梗区缺血缺氧所导致的移植细胞高凋亡率,并导致的脂肪干细胞的活力下降。同时研究表明,XIAP作为细胞抗凋亡作用的核心蛋白成分,有可能参与心肌缺血所致的移植细胞凋亡的过程。本实验的目的是1.研究脂肪干细胞对SD大鼠心梗模型的治疗作用。2.同普通干细胞相比,XIAP修饰的脂肪干细胞是否具有更强的活力,以及能否更好的恢复心功能。方法1.切开大鼠一侧腹股沟,无菌条件下取适量皮下脂肪组织,进行脂肪干细胞的分离、培养；2.将P2代脂肪干细胞分别向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞诱导,证实其多向分化潜能；3.流式细胞仪检测脂肪干细胞表面标志物,证实其是脂肪干细胞；4.在体外将XIAP表达质粒通过电转染导入脂肪干细胞内,并应用无血清培养基诱导凋亡；5. Western Blotting检测XIAP凋亡抑制蛋白的表达；6.建立大鼠心肌梗死模型,选取梗死中央及边缘区共5个注射点,每个注射点注射生理盐水(n=18),ADSCs细胞悬液(n=18),或经XIAP修饰的ADSCs细胞悬液(n=18),并设未处理组(n=7)7.术后4周应用超声心动图对大鼠心功能进行检测；8.应用TTC特殊染色对大鼠心梗面积进行具体测量；9.行苏木素-伊红(hematoxylin and eosin HE)染色和马松(Masson)染色,对大鼠心肌行病理学分析；10.行免疫组化及毛细血管计数11.进行统计学分析结果1.传代后细胞分布均匀,呈纤维样细胞形态。流式细胞仪检测显示,与脂肪干细胞相关的抗原均为阳性,表达率均大于79%；2.显微镜下观察诱导细胞,细胞形态发生明显变化,应用相应的染色试剂检测诱导细胞,证明分离得到的细胞能够向不同成体细胞分化；3.应用Western Blotting检测XIAP凋亡抑制蛋白和caspase7相关蛋白,对体外XIAP凋亡抑制蛋白的表达进行验证,发现相比于未转染质粒细胞正常培养的ADSCs,转染XIAP表达质粒后正常培养的ADSCs表达了抗凋亡蛋白,说明通过电转染的方式,ADSCs能够很好地表达XIAP凋亡抑制蛋白。应用无血清培养基诱导凋亡转染XIAP表达质粒后的ADSCs和未转染质粒的ADSCs,PVDF膜相应位置出现Anti-capase7,说明细胞被成功诱导凋亡。且转染XIAP表达质粒后的ADSCs组蛋白质显影较未转染质粒的ADSCs组小,说明转染XIAP表达质粒的ADSCs的抗凋亡能力得到增强；4.超声心动图检测示脂肪干细胞自体移植组的左室收缩末期内径、左室舒张木期内径小于心肌梗塞对照组、左室射血分数大于心肌梗塞对照组,差异有显着性意义(P<0.05)；5.通过对大鼠心梗面积的测算,我们得出ADSCs组明显小于对照组(P<0.01)。XIAP修饰的ADSCs组明显小于对照组(P<0.01)；也小于ADSCs组(P<0.05)；6.镜下观察所见梗死区XIAP修饰的ADSCs组微血管数目比ADSCs移植组、心肌梗死对照组明显增多(P<0.05)。ADSCs移植组较心肌梗死对照组微血管数目明显增多(P<0.05)。结论通过本实验,我们证明了自身脂肪干细胞移植作为治疗心肌梗死手段的有效性,为干细胞治疗心肌梗死提供了又一有价值的子干细胞。同时首次将XIAP抗凋亡基因同脂肪干细胞相结合,证明了XIAP抗凋亡基因用于干细胞治疗的可行性,拓宽干细胞治疗心肌梗死的道路,为今后的临床治疗提供新的思路。
参考文献：
[1]. 自体干细胞移植治疗心肌梗死后的心力衰竭:研究与现状[J]. 赵桂华. 中国组织工程研究与临床康复. 2007
[2]. 自体骨髓干细胞移植治疗心肌梗死疗效评估及活体示踪研究[D]. 马翔. 新疆医科大学. 2007
[3]. 干细胞移植治疗心肌梗死[J]. 黎健. 中国动脉硬化杂志. 2005
[4]. 治疗心肌梗死候选细胞心肌分化潜能与候选基因逆转录病毒载体的构建与鉴定[D]. 刘维新. 武汉大学. 2004
[5]. 干细胞诱导心肌细胞增殖与运动促进心肌细胞再生的研究进展[J]. 陈光涛, 章岚, 任文君. 中国组织工程研究. 2015
[6]. 经冠状动脉移植同基因骨髓单个核细胞治疗心肌梗死的实验研究[D]. 郑德华. 中国人民解放军军医进修学院. 2004
[7]. 经冠状动脉骨髓间充质干细胞心肌内移植治疗急性心肌梗死的实验及临床研究[D]. 陈绍良. 苏州大学. 2006
[8]. 自体干细胞移植治疗冠心病的研究[D]. 徐清斌. 南京医科大学. 2004
[9]. 大鼠骨骼肌卫星细胞的原代培养及其移植治疗心梗实验研究[D]. 邵素霞. 河北医科大学. 2004
[10]. XIAP修饰的脂肪间充质干细胞在心肌梗死治疗中的作用[D]. 李博. 天津医科大学. 2013
标签：外科学论文; 心肌细胞论文; 干细胞论文; 细胞分化论文; 细胞增殖论文; 心肌损伤论文; 骨髓细胞论文; 心肌论文; 生物技术论文;